Name: ロリポップライク限外プローブを用いたヒト先住民唾液ペプチドーをサンプリング：臨床質量分析のためのペプチドの検出を簡素化し、強化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶロリポップ型限外濾過プローブを用いた唾液ペプチドサンプリング法。NanoLC-LTQ質量分析による低豊度ペプチドの直接検出を可能にし、タンパク質消化を不要とする臨床診断への応用が期待されます。

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<li>Jonsson, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gln-Gly+cleavage%3A+correlation+between+collision-induced+dissociation+and+biological+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Gln-Gly cleavage: correlation between collision-induced dissociation and biological degradation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 12, 337-342 (2001).</li>
<li>Gibbons, R. J., Hay, D. I., Schlesinger, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delineation+of+a+segment+of+adsorbed+salivary+acidic+proline-rich+proteins+which+promotes+adhesion+of+Streptococcus+gordonii+to+apatitic+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Delineation of a segment of adsorbed salivary acidic proline-rich proteins which promotes adhesion of Streptococcus gordonii to apatitic surfaces.</a> Infect Immun. 59, 2948-2954 (1991).</li>
<li>Li, T., Johansson, I., Hay, D. I., Stromberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strains+of+Actinomyces+naeslundii+and+Actinomyces+viscosus+exhibit+structurally+variant+fimbrial+subunit+proteins+and+bind+to+different+peptide+motifs+in+salivary+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Strains of Actinomyces naeslundii and Actinomyces viscosus exhibit structurally variant fimbrial subunit proteins and bind to different peptide motifs in salivary proteins.</a> Infect Immun. 67, 2053-2059 (1999).</li>
<li>Hardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+defining+the+human+parotid+gland+salivary+proteome+and+peptidome%3A+identification+and+characterization+using+2D+SDS-PAGE%2C+ultrafiltration%2C+HPLC%2C+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Toward defining the human parotid gland salivary proteome and peptidome: identification and characterization using 2D SDS-PAGE, ultrafiltration, HPLC, and mass spectrometry.</a> Biochemistry. 44, 2885-2899 (2005).</li>
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<li>Losic, D., Rosengarten, G., Mitchell, J. G., Voelcker, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+of+diatom+frustules%3A+potential+nanostructured+membranes+for+molecular+and+particle+separations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nanosci.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Pore architecture of diatom frustules: potential nanostructured membranes for molecular and particle separations.</a> J. Nanosci. Nanotechnol. 6, 982-989 (2006).</li>
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<li>Whitelegge, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Sequence+Polymorphisms+and+Post-translational+Modifications+in+Proteins+from+Human+Saliva+using+Top-Down+Fourier-transform+Ion+Cyclotron+Resonance+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Protein-Sequence Polymorphisms and Post-translational Modifications in Proteins from Human Saliva using Top-Down Fourier-transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry.</a> Int. J. Mass Spectrom. 268, 190-197 (2007).</li>
<li>Castro, P., Tovar, J. A., Jaramillo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+of+Streptococcus+mutans+to+salivary+proteins+in+caries-free+and+caries-susceptible+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Odontol.+Latinoam%22%5BJournal%5D)">Adhesion of Streptococcus mutans to salivary proteins in caries-free and caries-susceptible individuals.</a> Acta Odontol. Latinoam. 19, 59-66 (2006).</li>
<li>Challacombe, S. J., Sweet, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+mucosal+immunity+and+HIV+infection%3A+current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Oral mucosal immunity and HIV infection: current status.</a> Oral Dis. 8, 55-62 (2002).</li>
<li>Jensen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+acidic+proline-rich+proteins+in+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Salivary acidic proline-rich proteins in rheumatoid arthritis.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 842, 209-211 (1998).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

我々は、多くのペプチドフラグメントは、人間の消化唾液中に存在することを発見した。これらのペプチド断片は、プロリンリッチタンパク質、アクチン、α-アミラーゼ、α1グロビン、βグロビン、histain 1、ケラチン1、ムチン7、高分子免疫グロブリン受容体、satherin、S100A9の様々なフォームからの誘導体である。未定の切断部位を有するペプチドの生産に貢献する多くの要因があるかもしれません。たとえば、いくつかのペプチド断片は、ヒト全唾液中に天然に存在するかもしれません。 C-末端-PQ多くのペプチドは、（ 表1と補足表1および2）を同定した。プロリンリッチタンパク質は、酸性、塩基性またはグリコシル化タンパク質として分類することができ、単一の領域17にクラスタ化された6つの遺伝子によってコードされている。対立遺伝子変異は、差動RNAスプライシング、タンパク質分解処理、および翻訳後修飾から17以上の30種類のプロリンリッチタンパク質の結果。分泌された後、酸性プロリンリッチPROTアインズは急速に歯面と歯垢のタンパク質分解18から19によって...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ポリエーテルスルホン膜</td><td>ポール·コーポレーション</td><td></td><td> 30kDaのMWCO </td></tr><tr><td>テフロンフッ素化エチレンプロピレン管</td><td>アップチャーチ科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブルーデキストラン</td><td>シグマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ナノLCシステム</td><td> Eksigent </td><td></td><td></td></tr><tr><td> C18トラップカラム</td><td>アジレント</td><td> 5065-9913 </td><td></td></tr><tr><td> LTQリニアイオントラップ型質量分析計</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>魔術師2 </td><td> SAGE-N ReseaRchの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル0.1％ギ酸</td><td> JTベーカー</td><td> 9832から03 </td><td> LC / MSグレード</td></tr><tr><td>水0.1％ギ酸</td><td> JTベーカー</td><td> 9834から03 </td><td> LC / MSグレード</td></tr></tbody></table>

ロリポップライク限外プローブを用いたヒト先住民唾液ペプチドーをサンプリング：臨床質量分析のためのペプチドの検出を簡素化し、強化

Sampling Human Indigenous Saliva Peptidome Using a Lollipop-Like Ultrafiltration Probe: Simplify and Enhance Peptide Detection for Clinical Mass Spectrometry

ヒト唾液プロテオームとペプチドーが1-2を明らかにされているが、それらはすぎなかったトリプシン唾液タンパク質の消化物から同定された。外因性の酵素による事前消化せずにヒト唾液の先住民族ペプチドーの同定は、ヒト唾液でネイティブペプチドが疾患の進行を予測し、治療効果を監視し、病気を診断するための潜在的な値を提供するので、必須となります。適切なサンプリングは、人間の土着の唾液ペプチドーの識別の強化のための重要なステップです。 3から4の残骸を削除するには、遠心分離を含むヒト唾液をサンプリングする従来の方法は時間がかかりすぎるの臨床使用のために適用可能であることかもしれません。さらに、遠心分離による瓦礫撤去は、感染した病原体のほとんどをきれいにし、多くの場合、低濃度のペプチドーの識別を妨げる高濃度タンパク質を除去することができない場合があります。 PRI、従来のプロテオミクス的手法marilyゲル内消化との結合の二次元ゲル電気泳動（2-DE）ゲルは多くの唾液タンパク質の5-6を識別することができる利用しています。しかし、このアプローチは、一般的に低濃度のペプチド/タンパク質を検出するのに十分な小文字は区別されません。液体クロマトグラフィー - 質量分析（LC-MS）ベースのプロテオミクス前の2-DE分離することなくタンパク質を識別することができる代替手段です。このアプローチは、より高い感度を提供していますが、それは一般的に臨床使用が困難になってトリプシンと以前のサンプルプレ分画7とプレ消化を必要とします。 サンプル調製のために質量分析の妨害を回避するために、我々は、キャピラリ限外濾過（CUF）プローブ8から11と呼ばれる技術を開発しました。我々の研究室からのデータは、CUFプローブは、ダイナミックかつ低侵襲な方法8の動物の様々な微小環境から、生体内でタンパク質を捕捉することが可能であることを実証-11。負圧は、サンプル収集中に撤退単に注射器によって作成されているので全く遠心分離は必要ありません。 LC-MSを組み合わせたCUFプローブが成功したトリプシン消化し ​​たタンパク質の8-11を同定した。本研究では、簡単に人間の口腔内に収まることができロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブを作成することにより、限外ろ過サンプリング技術をアップグレードしました。トリプシン消化せずにLC-MSによる直接分析では、国産ヒト唾液は様々なタンパク質に由来する多くのペプチド断片が含まれていることを示した。 LLUFプローブと唾液をサンプリングする遠心分離を避けますが、効果的に多くの大規模、高濃度タンパク質を除去。私たちの質量分析の結果は、多くの低濃度のペプチドはLLUFプローブで大きなタンパク質をフィルタリングした後に検出されなったことを示す。低濃度の唾液ペプチドの検出は、クロマトグラフィーを持つ複数のステップのサンプルの分離独立していた。臨床応用のために、LLUFプローブが組み込まれてLC-MSとdが潜在的に唾液から疾患の進行を監視するために、将来的に使用することができます。

将来の臨床応用のための唾液採取を考慮して、ロリポップのような限外濾過（LLUF）プローブは、ヒトの口腔内に収まるように作製した。ナノLC-LTQ質量分析法による消化唾液の直接分析は、大規模なタンパク質や高濃度タンパク質を除去し、低豊富なペプチドは多くの検出可能なようにするLLUFプローブの能力を実証した。

ヒトの唾液プロテオームおよびペプチドームはすでに明らかにされているが1-2、それらは主に唾液タンパク質のトリプシン消化物から同定されたものである。同定……

本唾液ペプチド研究では、ロリポップ型の超ろ過プローブを用い、次いでダイレクトnano LC LT Q質量分析による解析を行っています。まず、ポリエーテルスルホン膜とエチレンプロピレンチューブを使用してLLUFプローブを組み立てます。次に、ボランティアから唾液検体を採取し、LLUFプローブで処理して唾液をサンプリングします。その後、直ちにnano L-C-L-T-Q質量分析に移行し、LLUFプローブ処理ありと処理なしの唾液サンプルのデータを分析します。最終的に、L-C-M-S-Sデータを分析し、2つのサンプル間で同定されたペプチドを比較することで、唾液ペプチドを得ることができます。ロリポップ状の超濾過プローブを直接的なnano lc LTQ質量分析に組み合わせるこのアプローチは、唾液タンパク質をペプチドに消化するなどの他の方法に比べて、主要な利点があります。質量分析による解析に続き、LUF PROを用いて唾液の簡略化と精製を行い、臨床応用のための全唾液中のペプチドのMS検出能を向上させます。エポキシ接着剤を使用して、ポリエーテル細胞膜を三角形のポリプロピレンパドルの縁に封止します。その後、テフロン製フッ素化エチレンプロピレンチューブを三角形のシリンダー出口に取り付けます。ポリプロピレン製パドルを用い、プローブを70%アルコールで一晩滅菌します。適切なシール性を評価するため、LLUFプローブを50 mg/mLのブルーデキストラン溶液に2時間浸漬します。回収したサンプル中にブルーデキストランが存在しないことを確認してください。20歳から40歳の健康なボランティアを募集します。水で口をゆすいだ後、被験者に全唾液サンプルを氷冷した容器に吐き出させます。すべてのサンプルを合わせて、氷上で保存します。採取後直ちに、LLUFプローブを用いたサンプリングのため、200 µLの唾液を持って4 °Cの室内に移動します。次に、培養皿に入れたヒト唾液中にポリエーテル細胞膜を浸します。シリンジで吸引して陰圧をかけ、唾液からのサンプリングのための限外ろ過プロセスを模倣します。次に、タンパク質濃度を決定します。nano LC質量分析に用いるため、唾液タンパク質試料を1 µg/µLに調製します。試料分析には、Finnegan LTQ質量分析計にオンライン接続したExigent nano LCを使用します。まず、オートサンプラーを用いて、未消化の唾液試料5 µLをnano LCシステムのトラップカラムにロードします。洗浄ステップの後、バルブを切り替え、バッファーBを0から50%の直線勾配でトラップおよびC 18分離カラムに供給します。Excaliburのデータ依存モードを使用し、強度が1×10⁴以上の上位4つのMSイオンのms/msスペクトルを収集します。各サンプルについて、3つの異なる独立した調製試料を用いて2回ずつ分析を行います。次に、データファイルをSequest Sorcerer 2システムにインポートし、non enzyme specificityを用いて適切なヒトNCBIタンパク質データベースに対して検索を行います。Sequest検索後、結果は自動的にフィルタリングおよび検証され、Sequestの結果に基づいてペプチドプロファイルおよびタンパク質プロファイルに表示されます。ペプチドプロファイルでは、ペプチドの割り当てが正しいか誤っているかの包括的な確率であるPスコアを推定し、各ペプチド配列に関する追加情報も特定します。Protein profitは、Ms.Msスペクトルに割り当てられたペプチドに基づき、各タンパク質に対して0から1までの確率スコアを算出します。本セクションでは、細菌検出培養において口腔細菌を除去するLLUFプローブの能力を判定します。好気性細菌の試験のため、LLUFプローブ採取前後の唾液サンプルをオーガプレートに播種します。37 °Cで1日間、抗生物質を含まないLBオーガプレートを使用し、嫌気性細菌についてはガスパックを用いて培養します。サンプルをbruブロスおよびオーガープレートを用い、37°Cの嫌気条件下で1日間培養します。ロリポップ型の超濾過デバイスを作製することで、擬似的な口腔環境における唾液のサンプリングが容易になります。このシステムでは、分画分子量30 kilodaltonsの負電荷ポリエーテルスルホン膜をポリプロピレン製パドルに接着し、LLUFプローブの前方に配置することで、唾液中の大きなタンパク質を濾過します。ヒトの口腔内環境を模倣するため、シリンジを用いてスポンジに唾液を浸透させます。唾液は接続されたチューブを介してろ過され、回収されます。LLUFサンプリング前後の唾液のLCクロマトグラムを比較し、nano L-C-L-T-Q質量分析法を用いて唾液固有のペプチドを同定しました。これらの微分クロマトグラムは、化学的または酵素的な消化を経ずに得られるため、臨床目的の試料調製を簡略化できます。本試料において、LLUFによる異なるタンパク質組成の解明により、未消化の唾液中に131種類のペプチドが同定されました。これらのペプチドは、さまざまなプロリンリッチタンパク質に由来する断片です。Actin、alpha amylase、alpha one globin、beta globin、his sustain one、keratin、one mucin、seven polymeric immunoglobin receptor、serin、および S 100 が含まれます。LLUFプローブでろ過した後に唾液中で同定された 26 個のユニークなペプチドは、主にさまざまなプロリンリッチタンパク質に由来する断片です。α-アミラーゼ由来のこのペプチドは、LLUFプローブを用いずに採取した唾液サンプルのみで検出されており、大きなタンパク質を除去するLLUFプローブの能力が示されました。非常に興味深いことに、大きなタンパク質を除去した後、LLUFプローブで採取した唾液からいくつかの配列ペプチドが検出可能となり、特にプロリンに富むC末端を持つペプチドが、超ろ過LLUFプローブ後のサンプルで同定されました。これで、質量分析のために単純な唾液に対してA-L-L-L-L-U-F PROを使用する方法を十分に理解できたはずです。一貫した条件下で唾液を簡便に採取し、より精度の高い分析を行うことは非常に重要です。この手法を習得すれば、3時間以内に適切に実施できると考えられます。ロリポップのような超ろ過プローブとダイレクトnano LC-LTQ-MSを用いたこのアプローチによるスペクトル連鎖分析は、ヒト疾患の診断におけるバイオマーカーの臨床応用に寄与します。

sampling-human-indigenous-saliva-peptidome-using-lollipop-like

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