ロリポップライク限外プローブを用いたヒト先住民唾液ペプチドーをサンプリング：臨床質量分析のためのペプチドの検出を簡素化し、強化

本唾液ペプチド研究では、ロリポップ型の超ろ過プローブを用いた後、ダイレクトナノLC-LTQ質量分析による解析を行っています。まず、ポリエーテルスルホン膜とエチレンプロピレンチューブを用いてLLUFプローブを組み立てます。次に、ボランティアから唾液検体を採取し、LLUFプローブで処理して唾液をサンプリングします。

次に、そのままnano L-C-L-T-Q質量分析を行い、LLUFプローブ処理ありの唾液サンプルと処理なしの唾液サンプルのデータを分析します。最終的に、L-C-M-S-Sデータを分析し、2つのサンプル間で同定されたペプチドを比較することで、唾液ペプチドを得ることができます。ロリポップ型の超ろ過プローブをダイレクトnano lc LTQ質量分析に組み合わせるこの手法は、唾液タンパク質をペプチドに消化するなどの他の手法に比べて重要な利点があります。

それに続く質量分析において、LUF PROは唾液の簡素化と精製を行い、臨床応用のための全唾液中のペプチドのMS検出能を向上させます。エポキシ接着剤を使用して、ポリエーテルセルホーン膜を三角形ポリプロピレンパドルの縁に密封します。次に、テフロン製フッ素化エチレンプロピレンチューブを三角形のシリンダー出口に取り付けます。

ポリプロピレン製のパドルを用い、プローブを70%アルコールで一晩滅菌します。適切なシール状態を評価するため、LLUFプローブを50 mg/mLのBlue dextran溶液に2時間浸漬します。回収したサンプル中にBlue dextranが存在しないことを確認してください。

20歳から40歳の健康なボランティアを募集します。水で口をすすいだ後、被験者に全唾液サンプルを氷冷した容器に吐き出してもらいます。すべてのサンプルをまとめ、氷上で保存します。

採取後すぐに、LLUFプローブによるサンプリングを行うため、200 µLの唾液を持って4 °Cの室内に移動します。次に、培養皿に入れたヒト唾液中にポリエーテル細胞膜を浸します。シリンジで吸引して陰圧をかけ、唾液からのサンプリングのための限外ろ過プロセスをシミュレートします。

次に、タンパク質濃度を決定します。nano LC-MS分析用に、唾液タンパク質サンプルを1 µg/µLに調製します。サンプル分析には、Finnegan LTQ質量分析計にオンラインで接続したExigent nano LCを使用します。まず、オートサンプラーを用いて、未消化の唾液サンプル5 µLをnano LCシステムのトラップカラムにロードします。

洗浄ステップの後、バルブを切り替え、トラップおよびC 18分離カラムにバッファーBを0から50%の線形勾配で供給します。Excaliburのデータ依存モードを使用して、強度1×10⁴以上の上位4つのMSイオンのms/msスペクトルを収集します。各サンプルについて、3つの異なる独立した調製試料を用いて2回ずつ分析を行います。

次に、データファイルをSequest Sorcerer 2システムにインポートし、非酵素特異性を指定して、適切なヒトNCBIタンパク質データベースに対して検索を行います。Sequest検索後、結果は自動的にフィルタリングおよび検証され、Sequestの結果に基づいてペプチドプロファイルおよびタンパク質プロファイルに表示されます。ペプチドプロファイルでは、ペプチドの割り当てが正しいか誤っているかの包括的な確率であるPスコアを推定し、各ペプチド配列に関する追加情報も特定します。

Protein profitは、MS/MSスペクトルに割り当てられたペプチドに基づき、各タンパク質に対して0から1までの確率スコアを算出します。本セクションでは、細菌検出培養において口腔細菌を除去するLLUFプローブの能力を判定するため、LLUFプローブによる採取前後の唾液サンプルを好気性細菌試験用にアガープレートに塗布します。抗生物質を含まないLBアガープレートを用い、37 °Cで1日間培養し、嫌気性細菌についてはガスパックを用いて培養します。

サンプルをbruブロスおよびオーガプレートを用い、嫌気条件下、37 °Cで1日間培養した。ロリポップ状の超ろ過装置の作製により、模倣口腔環境における唾液のサンプリングが容易になる。このシステムでは、分子量カットオフが30 kilodaltonsの負電荷ポリエーテルスルホン膜をポリプロピレンパドルに接着し、LLUFプローブの前面に配置することで、唾液中の大きなタンパク質をろ過し除去している。

ヒトの口腔環境を模倣するため、シリンジを用いてスポンジに唾液を浸します。唾液は接続されたチューブを通じてろ過・回収されます。LLUFサンプリング前後の唾液のLCクロマトグラムを比較し、nano L-C-L-T-Q質量分析法によって、唾液固有のペプチドを同定しました。

これらの微分クロマトグラムは、化学的または酵素的な消化を行わずに得られるため、臨床目的のサンプル調製を簡素化できます。本サンプルでは、LLUFによって異なるタンパク質組成を解明した結果、未消化の唾液中に131個のペプチドが同定されました。

これらのペプチドは、さまざまなプロリンリッチタンパク質に由来する断片です。Actin、alpha amylase、alpha one globin、beta globin、his sustain one、keratin、one mucin、seven polymeric immunoglobin receptor、serin、および S 100 が含まれます。LLUFプローブでろ過した後の唾液中で同定された26種類の固有ペプチドは、主にさまざまなプロリンリッチタンパク質に由来する断片です。

α-アミラーゼ由来のこのペプチドは、LLUFプローブを用いずに採取した唾液サンプルでのみ検出されており、大きなタンパク質を除去するLLUFプローブの能力が示されました。非常に興味深いことに、大きなタンパク質を除去した後、LLUFプローブでサンプリングした唾液からいくつかの配列ペプチドが検出され、特にプロリンに富むC末端を持つペプチドが超ろ過LLUFプローブ後のサンプルで同定されました。これで、質量の分析に向けて、単純な唾液にA-L-L-L-L-U-F PROを使用する方法について十分に理解できたはずです。

一貫した条件下で唾液を簡便に採取し、より精度の高い分析を行うことは非常に重要です。この技術を習得すれば、3時間以内に適切に実施できると考えられます。ロリポップ状の超ろ過プローブとダイレクトnano LC-LT-QMSを用いたこのアプローチによるスペクトラムチェーン分析は、ヒト疾患の診断におけるバイオマーカーの臨床応用を促進します。