Name: 病原体胞の精製からレジオネラ菌感染した食細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶ、食細胞からレジオネラ菌を含む液胞を精製する方法。免疫磁性分離と密度勾遠心を用いて、高純度の病原体胞を単離し、細菌の病原性メカニズムを研究するための信頼性の高いプロトコルを確立する。

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私たちのラボでの研究は、マックス·フォン·ペッテンコーファー研究所、ルートヴィヒ·マクシミリアン大学、ミュンヘン、ドイツ研究協会（DFG、HI 1511/3-1）とBundesministeriumエリーゼBildungウントForschung（BMBF） &quot;医療感染ゲノム&quot;イニシアティブによってサポートされていました（ 0315834C）。

1。 LCVアイソレーションの準備<ol><li> レジオネラ出ストリークは、4日間の小型商用車の分離前に5μg/ mLのクロラムフェニコール（CAM）を使用したCYE寒天プレートにグリセロールストックからDsRedタンパク質-Expressの13,14を生成します 。 37細菌をインキュベート℃に</li><li> 1×10 のうち7種D. GFP-カルネキシンまたは75 cm 2の組織培養におけるRAW264.7マウスマクロファージを生産discoideumのは 1日前の感染をフラスコ。 D. 20μg/ mLのG418で10ミリリットルHL5培地を使用します。 23℃discoideumのとアメーバをインキュベートC、5％CO 2を RAW264.7マクロファージに対しては、10％FCS（熱不活性化）と1％グルタミンを添加した10ミリリットルRPMI 1640培地を使用して、37℃で細胞を成長させる°。感染症やサンプルごとに少なくとも3 75センチメートル2フラスコ（最小6×10 7細胞）を使用します。 </li><li> L.で一晩培養物を接種CYEプレートからレジオネラ 。 AYE培地3 mLで15 mLの試験管を取るおよび5μg/ mLのカム。 0.1のOD 600nmのを生成するために、細菌懸濁液の100μlで接種する。 21から22時間37℃でオーバーヘッド回転ホイールの一晩培養をインキュベートします。 </li></ol> 2。 LCVの分離<ol><li> D.の媒体を変更するdiscoideumの細胞には、次の感染を妨げる抗生物質を、削除します。 </li><li>一晩培養物のODを測定します。細菌は、2×10 9細菌/ mlに相当する≥3のOD 600nmで 、で、そのピークの感染に達している必要があります。 </li><li> L.の約500μlを添加して細胞を感染させる10ミリリットルHL5培地（D. discoideumの場合）または10ミリリットルRPMI 1640（マクロファージ）に増殖する細胞にpneumophilaの一晩培養。これは50の感染多重度（MOI）に対応しています。その後、感染は10分間500×gで細胞に細菌の遠心分離によって同期されます。遠心分離は続いているD.のインキュベーションにより、 25°Cと°C、5％CO 2、それぞれ37 RAW264.7マクロファージにおけるdiscoideumの細胞 。 1時間の感染時には、遠心分離工程が含まれています。 </li><li>感染後、培地を除去し、細胞外細菌を除去するために一回細胞を洗浄する。 D.、氷冷SorCバッファを使用タマホコリカビとRAW264.7マクロファージ、氷冷PBS。各フラスコにプロテアーゼ阻害剤（Roche社）を添加した3 mLのHSバッファを追加し、セルスクレイパーを用いて細胞を収集します。 15 mLの試験管内のプールに対応するサンプルを。 </li><li>サンプルの均質化のために3 mLのプラスチック製のルアーロックシリンジとステンレス鋼ボールホモジナイザーを使用しています。あなたは氷の上で動作することを確認してください。開始する前に、任意の洗剤汚染を避けるために、気泡を取り除くために、氷冷HSバッファを使用して、それをフラッシュするために、蒸留水でボールホモジナイザーを洗浄する。 8μmのクリアランスのボールを使用しています。 </li><li>シリンジUNDに最初の3 mLを埋める日にそれをマウント電子ホモジナイザー。ホモジナイザーを前後に9回のサンプルを押してください。均質化しない物質による汚染を避けるために、その後シリンジを交換します。収集し、プール均質化したサンプルを15 mLの試験管内および顕微鏡分析のために150μlのサンプルを取る。異なるサンプルを続行する前に、ボールホモジナイザーを解体し、洗浄してください。 </li><li> 4℃で氷の上でシェーカー上で30分間またはオーバーヘッドスピニングホイール（10〜20 rpm）で2％CSやFCSでホモジネートをブロック℃、 </li><li>アフィニティー精製SIDCに対する一次抗体（希釈1:3000）またはLCV膜への排他的に結合する他の細菌のマーカーに対してを使用してブロッキングした後。ホモジネートに追加する前に、渦抗体溶液。 4℃で氷の上でシェーカー上で1時間またはオーバーヘッドスピニングホイール（10〜20回転）でサンプルをインキュベート</li><li>その間に、Histodenz勾配を準備します。勾配あたり15 mLの試験管を使用して、一つのサンプルの3 75センチメートル2フラスコ。モミ聖、チューブに35％Histodenzの5.75 mLを加え、そして第二に、慎重の上に10パーセントHistodenz液5.75 mLを加える。その後、慎重に1時間水平にチューブを捨てる。 </li><li>ブロッキング試薬、一次抗体、4ペレット°Cの試料で15分間600×gで遠心したホモジネートのインキュベーション後に。上清を捨て、1.5 mLのHSバッファーでペレットを再懸濁します。新鮮な15 mLの試験管にサンプルを転送し、後に顕微鏡分析のために40μlのサンプルを取る。 </li><li>二次抗体を用いてペレットをインキュベートします - MACSヤギ抗ウサギIgGマイクロビーズ（希釈1:25） - シェーカー上で30分間に4℃でその間に、MACS磁気ホルダーに列を入れて、0.5 mLのHSバッファでそれらを平衡化します。 </li><li>その後、カラムにサンプルを適用します。フロースルー、その後の顕微鏡分析のための150μlを収集します。 0.5 mLのHSバッファーでカラムを3回洗浄します。 </li><li> tから列を削除潮吹き即座0.5 mLのHSバッファを持つ彼は、磁石と溶出液商用車。顕微鏡分析のために20μlのサンプルを取る。免疫磁気分離による精製工程は、1当たりの収量が期待される×10 7感染D. discoideumの細胞約1×10 6をそのまま小型商用車、約七倍のフロースルー13と比較して溶出液中に濃縮されています。 </li><li>垂直の位置に戻しHistodenz勾配管を入れて、慎重に上に溶出液をロードします。 4℃で1時間3350×gでチューブを遠心℃、 </li><li>遠心分離後の長いガラスパスツールピペットを用いて試験管の底から始めて1.5 mLの画分を取る。完全に8分画、チューブの底からそれぞれを収集します。目に見える層が連続Histodenz勾配で観察されていません。小型商用車の最高収率は通常、〜2の割合で分4で期待されているあたり1×10 5をそのまま小型商用車×10 7でアメーバ13ロード·レギュレーション小型商用車のマイナー量は、それぞれの画分3と5にも存在しています。したがって、精製された小型商用車の全体的な収率は〜1×10 6×10 7あたり6無傷の小型商用車が感染しているD. discoideumの細胞 13。小型商用車の回収は、室温（RT）で行い、小型商用車は数時間安定して見えることができます。 </li></ol> 3。収集されたサンプルの顕微鏡分析<ol><li>ポリ-L-リジンコートしたカバースリップを24ウェル平底組織培養プレートを準備します。 </li><li> 24ウェルプレートにすべてのLCVの精製時に採取したサンプルに加え、それぞれの密度勾配分画の150μlをピペット。高Histodenz濃度を希釈するために各ウェルに0.5mLのHSバッファを追加します。その後、4℃で10分間600×gでプレートを遠心分離℃に慎重に上清を除去し、室温で20分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）でサンプルを修正します。固定後のサンプルを2回洗浄する。私達D.の電子SorC RAW264.7マクロファージdiscoideumのとPBS。 </li><li><ol class="lalpha"><li> D.を発現している GFP-カルネキシンからのサンプルをマウントします。直接、例えばVectashieldを用いたガラススライド上にLCVの分離、中に別の手順で撮影discoideumの 、。 </li><li> RTで10分間ブロッキング溶液（1％PBSにBSA）で、LCVの分離中に別の手順で撮影したRAW264.7マクロファージから、サンプルをインキュベートします。 （;をブロッキングバッファーで1:1000アフィニティー精製ウサギ抗SIDC）商用車を染色し、室温で湿潤チャンバー内で1時間インキュベートし、抗SIDC一次抗体を使用しています。その後、PBSでサンプルを3回洗浄。室温でウェットと暗室で30分間、二次抗体（ブロッキング溶液で1:200例えば抗ウサギCy5）ででインキュベートします。最後に、PBSでサンプルを3回洗浄し、例えばVectashieldを用いたガラススライド上にマウントします。 </li></ol></li><li> GFP-カルネキシンから分離された小型商用車の形態、整合性と量が発現しているD. DIScoideumまたはRAW264.7マクロファージからは、適切なフィルタを搭載した蛍光顕微鏡で分析されています。 </li></ol> 4。代表的な結果免疫親和性分離と密度勾配遠心分離によりLCV浄化の品質と収率は、蛍光顕微鏡（ 図1）を続けることができます。サンプルの概要は、DからLCVの分離中に収集さdiscoideu mまたはマクロファージ（ 図2）が表示されます。 L.のホモジネートレジオネラ感染貪食細胞の破片や細胞外細菌の多くもそのまま小型商用車を示していますが、。サンプルをペレット化した後、画像は時々、ビット密度の高いホモジネートに似ています。無傷の小型商用車が列に固執する必要があるため、フロースルーは、主に細胞外細菌や細胞の破片を含んでいます。カラムからサンプルを溶出後、溶出液が大量にそのまま商用車が含まれています。私たちの手の中に、LCV purificati<html>には 、Dのためのより効果的であると思われるマクロファージよりdiscoideumの 。 D.でdiscoideumの病原体胞が丸く表示され、孤立した小型商用車の収率はマクロファージ（ 図3）と比べて10倍以上高くなっています。無傷のマクロファージでは、異なる抗体で染色されるLVCは、より不規則な形が表示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> LCVの分離図1回路図の概要。 LCV膜に排他的にローカライズし、細菌のエフェクタータンパク質SIDCに対するアフィニティー精製抗体を用いた免疫磁気分離により、小型商用車のA）の単離。二次MACSマイクロビーズ結合抗体と磁石は、細胞破片から小型商用車を分離するために使用されています。 B）免疫磁気分離LCVをした後、さらにHistodenz密度勾配遠心により精製される。小型商用車は、画分4に濃縮されています。 upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。LCVの精製中に収集したサンプル。ホモジネート、ペレット、D.からのフロースルーと溶出液からの画像タマホコリカビやマクロファージが描かれている。サンプルはLを示すD.でDsRedを·エクスプレス（赤）を製造するレジオネラ GFP-カルネキシン信号を生成するdiscoideumの （緑、上部のパネル）又は抗SIDC抗体（シアン、下部パネル）で染色したマクロファージインチバー、10μmである。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> 図3 DからLCVを精製したタマホコリカビやマクロファージ。サンプルは、LのHistodenz密度勾配遠心分離後、画分4を表示（A）D.でDsRedを·エクスプレス（赤）を製造するレジオネラdiscoideumのは抗SIDC抗体（シアン）で染色したマクロファージではGFP-カルネキシン信号（緑）または（B）を生成します。バー、10μmである。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

以前に公開された方法とは対照的に、このプロトコルは、2つのステップは、最初の免疫磁気アプローチによる小型商用車の分離、そして第二に、密度勾配遠心分離により小型商用車の精製に基づいています。 LCVの分離が容易に蛍光標識した細菌やGFP産生細胞または抗体染色のいずれかが使用されている蛍光顕微鏡、続くことができます。ここで説明するプロトコルは、高純度の小型商用車の濃縮、その結果、単純なストレートフォワード方式です。重要なのは、均質化緩衝液中のプロテアーゼ阻害剤は、RAW264.7マクロファージために必要ですが、D. discoideumのは 13のオプションです。 原理的には、プロトコルが分離工程のために必要とされる、特定の、選択的にローカライズするマーカーが存在する限り、他の病原体または宿主細胞のために採用することができます。理想的には、異なるマーカーは、細菌由来の液胞の膜に輸送されるndは選択的にそこにローカライズ。他の宿主細胞の区画を持つ病原体胞の共精製不要で、宿主細胞のマーカー可能性が高い結果をターゲットに。 <p class="...

病原体胞の精製から<em&gt;レジオネラ菌</em&gt;感染した食細胞

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

日和見病原体レジオネラはまた、このように重症肺炎&quot;レジオネラ症&quot; 1の原因となる肺胞マクロファージで複製アメーバ耐性菌です。原生動物や哺乳類の食細胞で、L.レジオネラは 、特定の複製許容コンパートメント、 &quot; レジオネラ菌を含む液胞&quot;（LCV）を形成するために保存されたメカニズムを採用しています。 LCVの形成は、宿主細胞に、多くの275 &quot;エフェクター&quot;のタンパク質を移行し、細菌ICM /ドットIV型分泌系（T4SS）が必要です。エフェクターは宿主タンパク質と同様に脂質を操作し、分泌、エンドソームやミトコンドリアの細胞内小器官2から4と ​​通信します。 小型商用車の形成は、還元の方法で把握することが困難であり、複雑な堅牢かつ冗長なプロセスを表します。統合的なアプローチは、パスのグローバルな分析を含む、包括的にLCVの形成を理解する必要がありますogen - 宿主因子の相互作用とそれらの時間的および空間的ダイナミクス。この目標に向けた第一歩として、無傷の商用車は、プロテオミクスとリピドミクスで精製し、分析されます。 組成や病原体を含有する液胞の形成は、液体クロマトグラフィーや質量分析に結合された2-Dゲル電気泳動を用いたプロテオーム解析により検討されています。社会的な土壌アメーバキイロタマホコリカビや哺乳類の食細胞のいずれかから単離された小胞は、 リーシュマニア 5、 リステリア菌 6 菌 7、 ロドコッカス 8、 サルモネラ 9またはレジオネラ属菌をかくまった10。彼らは、例えば電子顕微鏡は、LCVの形態、整合性と純度を分析する必要がしかし、これらの研究で用い精製プロトコルは、時間のかかる退屈な作業です。さらに、これらのプロトコルは、専用のために病原体胞の特定の機能を利用しないrichment。 ここで紹介する方法は、Dを用いることにより、これらの制限を克服ホスファチジルイノシトール4 -リン酸（PtdIns（4）P）3,11に結合することにより、蛍光LCVマーカーを生産し、細菌のエフェクタータンパク質SIDCを対象に、どのLCV膜に選択的にアンカーでdiscoideumの 。小型商用車は、古典的Histodenz密度勾配遠心分離12,13（ 図1）第二段階に続いて磁気ビーズに結合されたSIDCと二次抗体に対するアフィニティー精製一次抗体を使用して、免疫磁気分離による最初のステップで濃縮され。 D.から単離された小型商用車のプロテオーム研究discoideumのは 13前にLCVの形成に関与していない食胞、ミトコンドリア、小胞体とゴルジ体と同様に、いくつかの低分子量GTPase、関連付けられたタンパク質を含む560以上の宿主細胞タンパク質を、明らかにした。小型商用車はで濃縮および精製プロトコルは、さらに顕微鏡（免疫蛍光法、電子顕微鏡）、生化学的方法（ウエスタンブロット）およびプロテオミクスまたはlipidomicアプローチによって分析することができますここで概説した。

この資料では、無傷の単離および精製する方法を説明します<em&gt;レジオネラ菌</emアメーバやマクロファージからの&gt;を含む液胞（商用車）。 2ステップのプロトコルは、密度勾配遠心法により細菌のLCVマーカー、さらに精製することに対する抗体を用いた免疫磁気分離による濃縮LCVで構成されています。

日和見感染菌であるLegionella pneumophilaは、アメーバ耐性を持つ細菌であり、肺胞マクロファージ内でも増殖することで、重篤な...

本実験の全体的な目的は、感染した食細胞から、VAEまたはLCDを含む無傷のレジオネラ菌を単離することです。まず、ステンレス製ボールホモジナイザーを用いて感染した食細胞をホモジナイズします。次に、LCV膜に局在する細菌エフェクタータンパク質を特異的に標的とする一次抗体でホモジネートをインキュベートし、続いて磁性ビーズが結合した二次抗体でインキュベートすることでこれを達成します。次に、抗体で修飾されたlc vs.を磁場によって保持し、洗浄および溶出を行います。最終的に、磁気的に濃縮されたLCDは、密度勾配遠心分離法によってさらに精製することが可能です。本手法の既存手法に対する主な利点は、感染した寄生体のコンパートメント特異的な分子特性を利用して、無傷の病原細菌を精製できる点にある。LCV単離の4日前、グリセロールストックからDS Red Expressを発現するLegionella pneumophilaを、5 µg/mLのクロラムフェニコールを含むチャコール酵母エキス寒天培地にストリークして播種する。細菌を37 °Cで培養し、感染の1日前に、Calnexin GFPを発現するDictyostelium discoideumを1 × 10⁷個、75 cm²の組織培養フラスコに分注する。アメーバを、G418を含む10 mLのHL5培地を用い、23 °Cで培養する。実験前日に、3 mLのYE培지와 5 µg/mLのクロラムフェニコールを含む15 mL試験管に、約100 µLのL. pneumophila懸濁液を接種する。600 nmにおける光学密度を0.1にするため、分離を開始する前に、夜間培養物を回転ホイールを用いて37 °Cで21〜22時間培養します。まず、抗生物質を除去するためにdedis qadium細胞の培地を交換します。次に、10倍に希釈したL. pneumophila夜間培養物の光学密度を測定します。この値は通常0.3前後になります。次に、L. pneumophila懸濁液を約500 microlitersずつ各フラスコに移し、dsco Dium細胞に感染させます。500 times G、25 degrees Celsiusで10分間遠心分離して細菌を細胞上に沈降させることで感染を同期させ、その後、dqu dium細胞を25 degrees Celsiusで1時間インキュベートします。感染後、培地を除去し、氷冷したソースCバッファーでアメーバを1回洗浄します。細胞外細菌を除去するため、プロテアーゼ阻害剤を添加したHSバッファーを各フラスコに3 mL加え、セルスクレーパーを用いて細胞を回収します。感染細胞のホモジナイズは、本手順の中で最も困難な工程です。成功の鍵は、細心の注意を払って洗浄したステンレス製ボールホモジナイザーの使用、適切なボールホモジナイザ

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Jung, A. L. et al., Legionella pneumophila 外膜小胞: マクロファージにおける炎症誘発性の分離と分析。J. Vis.

外膜小胞で前処理されたマクロファージにおけるレジオネラニューモフィラ複製のアッセイ

出典:ユング、A. L.、他レジオネラ肺炎菌外膜小胞:マクロファージにおける炎症促進作用の単離と解析。J. Vis. Exp.(2017年)このビデオは、逐次遠心分離、無菌ろ過、超遠心分離を用いて レジオネラ...

レ ギオネラ・ニューモフィラ 外膜小胞の超遠心分離による分離

出典:シガル、N.ら。マクロファージ細胞内の細胞内培養リステリア・モノサイトゲネスからのRNA精製。 J. Vis.

感染した宿主細胞からの細胞内病原性細菌の単離

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

この手法は、収穫する方法を提供するものであり、哺乳動物細胞の感染に先立って自然原虫の宿主細胞にあらかじめ栽培されている細菌性病原体の細胞内増殖を正常化し、定量化する。このメソッドは、プライミング段階のための宿主細胞、ならびに標的細胞の種類の多種多様に対応するように変更することができます。...

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使用<em&gt;ハチノスツヅリガ</em&gt;モデル生物として研究する<em&gt;レジオネラ·ニューモフィラ</em&gt;感染症

私たちは、骨髄由来マクロファージにおける細胞質および液胞性サルモネラ菌のチフス菌の定量化を、ディジタニン透過化を用いて記述します。...

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

ここでは、 レジオネラ・ニューモフィラ （L.ニューモ ）液体培養物から外膜小胞（OMVを）の精製を記載しています。これらの精製された小胞は、次いで、それらのプロ炎症性の可能性を分析するために、マクロファージの治療のために使用されます。...

レジオネラ・ニューモ外膜小胞：マクロファージ上における炎症誘発ポテンシャルの単離と解析

簡単で迅速なサルモネラの分離法をご紹介-ビオチンとストレプトアビジン菌をコーティングすることによりマクロファージからファゴゾームを含みます。...

サルモネラの分離-大食細胞のファゴゾームを含む

細菌細胞のイメージングは、大きな高分子機械の機能を決定する静的および動的プロセスの定義に焦点を当てた新しいシステム生物学アプローチです。ここでは、定量的ライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の統合により、レジオネラ菌型肺炎球体系IV型分泌系のアーキテクチャと機能を研究しています。...

レジオネラ肺球菌ドット/Icm分泌系の空間的特徴を解決するためのライブ細胞イメージングとクライオ電子断層撮影の適用

学ぶ、食細胞からレジオネラ菌を含む液胞を精製する方法。免疫磁性分離と密度勾遠心を用いて、高純度の病原体胞を単離し、細菌の病原性メカニズムを研究するための信頼性の高いプロトコルを確立する。

病原体胞の精製から

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