癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

この手順の全体的な目標は、DNAベクターベースのRNA干渉を使用して遺伝子機能を決定することです。これは、最初に特定の遺伝子を標的とするS-H-R-N-Aコンストラクトを設計し、生成することによって達成されます。第2のステップは、SH RNA発現カセットを担ぐレンチウイルスを作製することです。

次に、レンチウイルスを細胞に感染させることにより安定な細胞株を作製し、レンチウイルスに感染した細胞をさまざまなin vitroおよびin vivoアッセイで使用して、目的遺伝子のサイレンシングの効果を決定します。最終的には、利用するアッセイに応じて、結果は、in vitro 増殖、遊走、および浸潤アッセイ、および in vivo 異種移植片形成モデルの使用による遺伝子ノックダウンの結果として、細胞の腫瘍性性の変化を示すことができます。手順を実演するのは、ダニエル・ストウェル、マ・フアン、そしてダニエルは私の研究室の大学院生です

チャン博士研究員。この方法は、特定の遺伝子ががんの発生と進行に関与しているかどうか、これらのプロセスのどの側面が重要であるかなど、がん研究分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。記載された基準に基づいてオリゴヌクレオチドの設計と注文を開始するには、標的遺伝子に20〜23ヌクレオチドの標的配列を含む2つの逆相補型オリゴをアニルします。

それらは、両端にeco R oneとHindi 3のサイトを形成します。ひざまずいた後、別のオリゴには、ターゲット配列への逆相補配列とその3つのプライムエンドが含まれています。上流のプライマーでH 1またはU 6プロモーターの3つのプライムエンドにニールします。

PCRを使用して、両端にBAM H 1およびHindiの3つのサイトを持つフラグメントを作成します。その間、レンチウイルスベクターとPCRフラグメントを消化します。次に、ベクター、PCRフラグメント、およびAnilオリゴヌクレオチドとの間で3フラグメントライゲーション反応を行います。

1 対 10 対 10 のモル比で、結果として得られるベクターは、ループ領域にヒンディー語の 3 配列を持つ目的の HRNA を生成します。誘導性ベクターを使用する場合、HRNAの産生は、テトオンシステム用のドキシサイクリンなどの誘導分子の存在に依存します。次に、ライゲーションされた製品を使用して、高効率で有能な大腸菌DH 5アルファ細胞を形質転換し、コロニーベースのPCRスクリーニングを使用して陽性ベクターを同定します。

ベクターと誘導性プロモーターライゲーション部位にまたがる製品を増幅します。市販のキットを使用して、陽性コロニーから血漿DNAを調製します。次に、BAM H oneおよびECO R oneの消化、およびDNAアガロース電気泳動により、インサートの存在を確認します。

さらに、プロモーターとS-H-R-N-Aを含む領域をLIGAヌクレオチドP 5を用いて配列決定します。エンドトキシンフリーのMIDIまたはマキシ調製キットを使用して、HRNA発現カセットを担持したレンチウイルスDNAを調製します。260ナノメートルの光吸収を測定してDNA濃度を測定し、260〜280ナノメートルの光吸収比が1.8〜2.0の間にあることを確認してDNaの純度を確認します。

最後に、レンチウイルスプラスミドをエアロゲル上で実行し、Sコイル状になっていることを確認します トランスフェクションの前に、まず0.9ミリリットルの溶液Aを0.9ミリリットルの溶液Bにゆっくりと落下させ、ピペットで溶液Bに空気をバブリングしながらトランスフェクションの準備をします。次に、混合物を室温で30分間インキュベートします。次に、0.6ミリリットルの混合物をHEK 2 93 T細胞を含む3つの異なる10センチメートルプレートにゆっくりと滴下します。

その後、4〜6時間後に細胞をインキュベーターに戻します。培地を7ミリリットルの完全なDMEM培地と交換します。24時間後、さらに5ミリリットルの培地を追加し、さらに24時間後にレンチウイルスを含む培地を収穫します。

回収した培地を室温で1500 RPMで10分間回転させます。0.45マイクロメートルのフィルターを使用して上清をろ過します。レンチウイルスを含む培地に流れを超遠心分離で回転させます。

上清を5%漂白剤を含む廃棄物容器にデカントします。レンチウイルスペレットを冷たい1つのXPBSの半分から1ミリリットルに再懸濁します。次に、レンチウイルス溶液を50〜100マイクロリットルのアリコートに分割して、摂氏マイナス80度で保存します。

最後に、信頼性の高い技術を使用してレンチウイルスの力価を決定します。通常、10cmの培養皿は、細胞感染に進む前に5000万から1億の感染ユニットを生成します。この手順では、キットまたはR-T-P-C-Rを使用してレンチウイルス力価のMOIを決定します。

MOI は 4 未満にすることをお勧めします。まず、感染する細胞を6ウェルプレートに播種し、30〜40%coの流暢さで培養します。翌日。

培地を、ポリブレインまたはプロタミンを含む1ミリリットルの新鮮な培地と交換します。次に、1〜200万iuを追加します。蛍光マーカーまたは抗生物質マーカーを含むレンチウイルス。

プレートを10秒間ゆっくりと振って混合し、6時間インキュベートします。6時間後、培地を正常で完全な培地と交換し、細胞を2日間増殖させます。培地には、2日後に使用するレンチウイルスに関係なく、抗生物質や誘導剤を含んではいけません。

レンチウイルスに抗生物質マーカーが含まれている場合は、適切な抗生物質を追加します。同様に、レンチウイルスが誘導性である場合は、培養物の半分に誘導剤を追加します。抗生物質と誘導剤でさらに2〜3日間細胞を培養した後、西洋の血液分析を実施して、異種移植トリプシンの目の前に標的遺伝子のノックダウンをテストします。

大きな細胞培養皿からの細胞を、50%マトリゲルを含む元の培地に再懸濁します。がん細胞を再懸濁し、50%マトリゲルとシリンジを氷上に保持することが不可欠です。さもなければ、マトリゲルが固化し、感染がそれについてABしなければならないリスクがあります。

手術部位を70%エタノールで徹底的に洗浄して準備し、換気の良い状態で麻酔を行い、誘導室に取り付けられたアイソフッ素スカベンジャーフィルターを使用します。細胞接種の3〜5分前に、2%isofフッ素と1.5%酸素を混合して胸腺ヌードマウスに麻酔をかけます。次に、鼻円錐を通して酸素と混合された2%isofフッ素を使用して麻酔を維持します。

マウスを摂氏30度に設定された加熱パッドに置きます。皮下注射の場合は25.5ゲージ針、同所注射の場合は28〜30ゲージ針の注射器に細胞をロードします。1つまたは2つの部位に麻酔を導入してから5分後に、200マイクロリットルのボーラスに1〜1000万個の細胞を注入します。

細胞数は、がん細胞の悪性度または侵攻性によって異なります。恒常的に活性なベクターについては、標的遺伝子S-H-R-N-AまたはスクランブルされたS-H-R-N-A fortetをベクター上に発現する細胞を注入した2群のマウスを利用します。同じ2つのグループを使用し、それぞれを水中にインデューサーが供給されているサブグループまたは供給されていないサブグループに分けます。

水を含むドキュメントは週に2回交換してください。腫瘍の量を毎週または隔週で監視します C.腫瘍の量が施設またはCUCの制限を超えないようにし、広範な潰瘍、壊死、明らかな感染、制御されていない出血、または末期の病気を示す動物を安楽死させます。生物発光マーカーを介して腫瘍の成長と転移をモニタリングするには、作業領域を消毒し、気体麻酔でイメージングチャンバー内でマウスに麻酔をかけます。

まず、2〜5分間の露光を行い、信号強度を確認してから、それに応じて調整します。腫瘍のサイズが1000立方ミリメートルを超える場合、または施設のサイズ制限が犠牲時に動物を安楽死させる場合は、腫瘍のサイズを文書化し、さらなる分析のためにそれらを保持してください。このプロトコルは、腺ヌードマウスに移植されたヒト乳房腺癌細胞を発現するルシフェラーゼの異種移植片腫瘍形成に対するYワンノックダウンの影響を研究するために使用されました。

ヒトYY oneのS-H-R-N-A標的配列と、既知のヒト転写産物と有意な類似性を示さなかったスクランブルコントロールS-H-R-N-Aの両方を試験した。その結果、2つのレンチウイルスベクターが構築され、2つのレンチウイルスを作製するために使用されました。両方とも2つの異なる細胞集団に感染するために使用され、ポリクローナル細胞集団が得られました。

purマイシンの選択後。ウェスタン血液分析により、これらの感染細胞株でDSがYYワンノックダウンを誘導したことが確認されました。次に、誘導性YY1に感染させたクローン3のポリクローナル細胞集団S-H-R-N-Aと対照群。S-H-R-N-A.

レンティウイルスは、YY oneの枯渇が侵入に及ぼす影響をテストするために使用されました。YYの1つの枯渇が細胞の侵襲性を低下させることを観察しました。西洋の血液分析により、ドキュメントは、INDU YY 1 S-H-R-N-Aの細胞でYY 1をサイレンシングを誘発したのに対し、コントロールを含む細胞を確認しました。

S-H-R-N-Aはこの効果を示さなかった。次に、これらの細胞を異種移植マウスモデル研究で使用し、対照群のinduと比較した、水を含むdosを供給されたYY1つのS-H-R-N-A移植マウスは、生物発光によって視覚化され、腫瘍の重量が予想どおりに測定された場合に、腫瘍形成の有意な減少を示しました。これらの異種移植片腫瘍におけるYY1つのサイレンシングは、ウェスタンブロットによって容易に確認されました。

研究 レンチウイルスを扱う作業は、NIHBの安全性に関する考慮事項によれば、レンチウイルスベクターを用いた研究では非常に危険であることを忘れないでください。強化されたBの安全性レベル2の封じ込めプロトコルは、すべての実験室環境で必要です。