癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

この手順の目的は、DNAベクターベースのRNA干渉を用いて遺伝子機能を決定することです。まず、特定の遺伝子を標的とするshRNA構築物を設計・作製します。次に、shRNA発現カセットを搭載したレンチウイルスを作製します。

次に、レンチウイルスを感染させて安定細胞株を構築し、そのレンチウイルス感染細胞をさまざまなin vitroおよびin vivoアッセイに使用して、目的遺伝子のサイレンシングによる影響を判定します。最終的に、使用するアッセイに応じて、in vitroでの増殖、遊走、浸潤アッセイ、およびin vivoでのゼノグラフト形成モデルを通じて、遺伝子ノックダウンの結果として細胞の腫瘍形成能に変化が生じることが示されます。本手順の実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるDaniel Stowellと、技術者のMa Juanです。

Changは博士研究員です。この手法は、特定の遺伝子が癌の発生と進展に役割を果たしているか、また、それらのプロセスのどの側面において重要であるかなど、癌研究分野における重要な疑問への解答に役立ちます。まず、記載された基準に基づいてオリゴヌクレオチドを設計し、注文します。標的遺伝子内の20〜23ヌクレオチドの標的配列を含む2本の相補的なオリゴを準備します。

これらは両端にEcoRIおよびHindIII部位を形成します。アニーリング後、標的配列のリバース相補配列およびその3'端を含む別のオリゴを、アップストリームプライマーを用いてH1またはU6プロモーターの3'端にアニールさせます。

PCRを用いて、両端にBamHIおよびHindIIIサイトを持つ断片を作成します。同時に、レンチウイルスベクターとPCR断片を消化します。その後、ベクター、PCR断片、およびAnnealオリゴヌクレオチドの間で3断片ライゲーション反応を行います。

1:10:10のモル比で反応させた場合、得られるベクターはループ領域にHindIII配列を持つ目的のshRNAを産生します。誘導性ベクターを使用する場合、shRNAの産生は、Tet-onシステムにおけるドキシサイクリンなどの誘導因子の存在に依存します。次に、ライゲーション産物を用いて、高効率のコンピテントE. coli DH5α細胞に形質転換を行い、コロニーPCRスクリーニングによって陽性ベクターを同定します。

ベクターと誘導性プロモーターのライゲーション部位にまたがる産物を増幅させます。市販のキットを用いて、陽性コロニーからプラスミドDNAを調製します。その後、Bam HIおよびEco RIによる消化と、アガロースゲル電気泳動により、インサートの存在を確認します。

さらに、LIGA nucleotide P fiveを用いて、プロモーターおよびS-H-R-N-Aを含む領域のシーケンシングを行います。エンドトキシンフリーのMIDIまたはmaxi prepキットを使用して、HRNA発現カセットを搭載したレンチウイルスDNAを調製します。260 nmでの光吸収度を測定してDNA濃度を決定し、260 nm/280 nmの吸光度比が1.8から2.0の間であることを確認してDNAの純度を担保します。

最後に、レンチウイルスプラスミドをエアロゲルで泳動し、超らせん構造（S coiled）であることを確認します。トランスフェクションの前に準備として、ピペットで溶液Bに空気を送り込みながら、0.9 mLの溶液Aを0.9 mLの溶液Bにゆっくりと滴下します。その後、混合液を室温で30分間インキュベートします。次に、この混合液0.6 mLを、HEK 293T細胞を播種した3枚の10 cmプレートにゆっくりと滴下します。

その後、4〜6時間後に細胞をインキュベーターに戻します。培地を7 mLの完全DMEM培地で交換します。24時間後、さらに5 mLの培地を添加し、さらに24時間後、レンチウイルスを含む培地を回収します。

回収した培地を室温で1500 RPMで10分間遠心分離します。0.45 µmフィルターを用いて上清をろ過します。レンチウイルスを含むろ過後の培地を、超遠心分離機で遠心分離します。

上清を5%bleachを含む廃棄容器にデカントします。レンチウイルスのペレットを0.5〜1 mLの冷えた1 XPBSで再懸濁します。その後、レンチウイルス溶液を50〜100 µLずつ分注し、-80 °Cで保存します。

最後に、信頼性の高い手法を用いてレンチウイルスのタイターを決定します。通常、細胞感染に進む前に、10 centimeterの培養皿から5,000万から1億の感染単位が得られます。本手順では、キットまたはR-T-P-C-Rを用いてレンチウイルスタイターのMOIを決定してください。

MOIは4未満にすることが推奨されます。まず、感染させる細胞を6ウェルプレートに30～40%のコンフルエンシーで播種し、一晩培養します。翌日、

培地を、poly brainまたはプロタミンを含む新鮮な培地1 mLに交換します。次に、蛍光マーカーまたは抗生物質マーカーを含むレンチウイルスを1〜2 million iu添加します。

プレートを10秒間ゆっくりと振って混ぜ合わせ、6時間インキュベートします。6時間後、培地を通常の完全培地に交換し、細胞を2日間培養します。使用したレンチウイルスの種類にかかわらず、2日後は抗生物質や誘導剤を含まない培地を使用してください。

レンチウイルスに抗生物質マーカーが含まれている場合は、適切な抗生物質を添加します。同様に、レンチウイルスが誘導性である場合は、培養液の半分に誘導剤を添加します。抗生物質および誘導剤存在下でさらに2〜3日間細胞を培養した後、キセノグラフト用のトリプシン処理を行う前に、ウェスタンブロット分析を実施して標的遺伝子のノックダウンを確認します。

大きな細胞培養ディッシュから細胞を回収し、50% Matrigelを含む元の培地で再懸濁します。がん細胞の再懸濁液（50% Matrigel含有）およびシリンジは、必ず氷上で保持してください。そうしないと、Matrigelが凝固し、感染操作に支障をきたす恐れがあります。

手術部位を70% ethanolで十分に清浄し、十分な換気を行い、導入チャンバーにisof fluorineスカベンジャーフィルターを装着した状態で麻酔を実施します。細胞接種の3〜5分前に、2% isof fluorineと1.5% oxygenの混合ガスを用いてサイマウス（thymic nude mice）を麻酔します。その後、ノーズコーンを通じて2% isof fluorineとoxygenの混合ガスを用いて麻酔を維持します。

マウスを30°Cに設定したヒーティングパッドの上に配置します。皮下注射用には25.5Gの針を、同所性注射用には28～30Gの針を装着したシリンジに細胞を充填します。麻酔導入の5分後に、1～2か所に100万～1000万個の細胞を200µLのボラス投与で注入します。

細胞数は、がん細胞の悪性度または侵襲性に依存します。恒常的に活性を持つベクターについては、標的遺伝子 S-H-R-N-A またはスクランブル S-H-R-N-A を発現する細胞を注入した2群のマウスを使用します。これと同じ2群を用い、それぞれを飲水中に誘導剤を添加するかしないかのサブグループに分けます。

水を入れたボトルを週に2回交換します。腫瘍の体積を、キャリパーを用いて毎週または隔週で測定します。腫瘍体積が施設またはIACUCの制限を超えないようにし、広範な潰瘍、壊死、明らかな感染、制御不能な出血、または末期症状を示した動物は安楽死させてください。生物発光マーカーを用いて腫瘍の成長と転移をモニタリングするには、作業エリアを消毒し、イメージングチャンバー内で気化麻酔を用いてマウスを麻酔します。

まず、2〜5分間の露光を行い、信号強度を確認してから適宜調整します。腫瘍の大きさが1000 cubic millimetersまたは施設で定められたサイズ制限を超える場合は、屠殺時に動物を安楽死させ、腫瘍サイズを記録して、その後の解析のために保存してください。このプロトコルは、胸腺欠損ヌードマウスに移植したルシフェラーゼ発現ヒト乳腺腺癌細胞のキセノグラフト腫瘍形成に対するwhy Y oneノックダウンの影響を研究するために使用されました。

ヒトYY1のS-H-R-N-A標的配列と、既知のヒト転写産物と有意な類似性のないスクランブル対照S-H-R-N-Aの両方をテストしました。その結果、2種類のレンチウイルスベクターを構築し、2種類のレンチウイルスを産生しました。これらを用いて2つの異なる細胞集団を感染させ、ポリクローナルな細胞集団を得ました。

ピューロマイシン選択後、ウェスタンブロット分析により、これらの感染細胞株においてDS誘導性YY oneのノックダウンが確認されました。次に、誘導性YY one shRNAおよびコントロールshRNAを感染させたクローン3のポリクローナル細胞集団を用いました。

YY1の枯渇が浸潤に及ぼす影響を検討するために、レンチウイルスを使用しました。その結果、YY1の枯渇によって細胞の浸潤性が低下することが観察されました。ウェスタンブロット解析により、YY1 shRNAを導入した細胞ではYY1のサイレンシングが誘導されたことが確認されましたが、コントロールを含む細胞ではそのような結果は見られませんでした。

S-H-R-N-Aではこの効果は見られませんでした。その後、これらの細胞を異種移植マウスモデル研究に使用し、対照群およびS-H-R-N-Aを移植したマウスと比較しました。水を投与した群では、バイオルミネッセンスによる可視化および期待通りに測定した腫瘍重量において、腫瘍形成が有意に抑制されていることが示されました。これらの異種移植腫瘍におけるYY oneのサイレンシングは、ウェスタンブロットによって容易に確認されました。

研究にあたり、レンチウイルスの取り扱いは極めて危険であることに留意してください。レンチウイルスベクターを用いた研究に関するNIHの安全性上の検討事項に従い、すべてのラボ環境においてバイオセーフティーレベル2（BSL-2）の封じ込め手順が必須となります。