Name: 癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 10 s
Description: 学ぶDNAベクターベースのRNA干渉法を用いた遺伝子機能解析。レンチウイルス産生と安定細胞株構築により、in vitroおよびin vivoアッセイで遺伝子ノックダウン効果を評価し、がん研究における遺伝子機能を解明する。

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この作業は、研究Scholarのアメリカの癌協会からの補助金（116403-RSG-09から082-01-MGO）とGSのウェイクフォレスト大学健康科学の学内資金によって部分的にサポートされていました。 DBSは、NCI訓練助成金5T32CA079448によってサポートされていました。

<ol><li>Elbashir, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexes+of+21-nucleotide+RNAs+mediate+RNA+interference+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells.</a> Nature. 411, 494-498 (2001).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+vector-based+RNAi+technology+to+suppress+gene+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A DNA vector-based RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5515-5520 (2002).</li>
<li>Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+system+for+stable+expression+of+short+interfering+RNAs+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells.</a> Science. 296, 550-553 (2002).</li>
<li>Zhang, Q., Stovall, D. B., Inoue, K., Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oncogenic+role+of+Yin+Yang+1%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Oncog%22%5BJournal%5D)">The oncogenic role of Yin Yang 1.</a> Crit. Rev. Oncog. 16, 163-197 (2011).</li>
<li>Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+plays+an+essential+role+in+breast+cancer+and+negatively+regulates+p27%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 plays an essential role in breast cancer and negatively regulates p27.</a> Am. J. Pathol. , Forthcoming (2012).</li>
<li>Sui, G., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+by+a+DNA+vector-based+RNAi+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene silencing by a DNA vector-based RNAi technology.</a> Methods in Molecular Biology. 309, 205-218 (2005).</li>
<li>Trower, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+PCR-based+colony+screening+protocol+for+cloned+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A rapid PCR-based colony screening protocol for cloned inserts.</a> Methods Mol. Biol. 58, 329-333 (1996).</li>
<li>Lizee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction+as+a+method+for+determining+lentiviral+vector+titers+and+measuring+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction as a method for determining lentiviral vector titers and measuring transgene expression.</a> Hum. Gene Ther. 14, 497-507 (2003).</li>
<li>Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+significance+of+controlled+conditions+in+lentiviral+vector+titration+and+in+the+use+of+multiplicity+of+infection+%28MOI%29+for+predicting+gene+transfer+events%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Vaccines+Ther%22%5BJournal%5D)">The significance of controlled conditions in lentiviral vector titration and in the use of multiplicity of infection (MOI) for predicting gene transfer events.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 6(2004).</li>
<li>Geran, R. I., Greenberg, N. H., MacDonald, M. M., Schumacher, A. M., Abbott, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+screening+chemical+agents+and+natural+products+against+animal+tumors+and+other+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Chemother.+Rep%22%5BJournal%5D)">Protocols for screening chemical agents and natural products against animal tumors and other biological systems.</a> Cancer Chemother. Rep. 3, 1-103 (1972).</li>
<li>Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+imaging+in+living+subjects%3A+seeing+fundamental+biological+processes+in+a+new+light%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light.</a> Genes Dev. 17, 545-580 (2003).</li>
<li>Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Gene. 96, 23-28 (1990).</li>
<li>Toledo, J. R., Prieto, Y., Oramas, N., Sanchez, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine-based+transfection+method+as+a+simple+and+effective+way+to+produce+recombinant+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Biochem.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine-based transfection method as a simple and effective way to produce recombinant lentiviral vectors.</a> Appl. Biochem. Biotechnol. 157, 538-544 (2009).</li>
<li>Rubinson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lentivirus-based+system+to+functionally+silence+genes+in+primary+mammalian+cells%2C+stem+cells+and+transgenic+mice+by+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells, stem cells and transgenic mice by RNA interference.</a> Nat Genet. 33, 401-406 (2003).</li>
<li>Sui, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+is+a+negative+regulator+of+p53%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 is a negative regulator of p53.</a> Cell. 117, 859-872 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

このプロトコルは、shRNAを用いて遺伝子をノックダウンし、in vivoでの腫瘍細胞増殖の生物発光イメージングを使用して、その生物学的効果を可視化する方法について説明します。shRNAのターゲットサイトが使用される3つの制限部位のいずれか（をBamHI、HindIII及びEcoRI）を含めるべきではありませんサブクローニングのために。以下のいずれのサイトが存在するときにまれなシナリオでは、追加の制限酵素は、コンストラクトを生成する際にそれを置き換えるために使用することができます。 このプロトコルのいくつかの重要なステップは、shRNAレンチウイルスベクターの構築をスピードアップします。最初に、U6またはH1プロモーターを含むプラスミドのPCRテンプレートがレンチウイルスベクター（典型的にはアンピシリン）とは異なる抗生物質耐性遺伝子（カナマイシンなど）があります。これはプラスミドテンプレートによって引き起こされる転換の背景を減らすことができます。第二に、 大腸菌コンピを使用する必要がある変換の...

RNAとタンパク質の解析や細胞培養に使用される一般的な実験装置に加えて、以下の材料および試薬は、このプロトコルが必要になります。 <table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td></tr><tr><td>バイオセーフティレベル2の封じ込めに適したバイオセーフティキャビネット</td></tr><tr><td> PCRサーマルサイクラー</td></tr><tr><td>超遠心</td></tr><tr><td>イソフルランスカベンジャーによる麻酔誘導室</td></tr><tr><td>デジタルノギス</td></tr><tr><td> IVISイメージングシステム</td></tr><tr><td>有能DH5a大腸菌</td></tr><tr><td>をEcoRI、BamHI部位、及びHindIII制限酵素</td></tr><tr><td> T4 DNAリガーゼ</td></tr><tr><td>第三世代レンチウイルスパッケージングプラスミド、VSV-G、PRSV-RevおよびpMDLg / pRRE </td></tr></tbody></table> 材料リスト

癌における遺伝子機能を研究するdnaベクターベースのrna干渉

DNA Vector-based RNA Interference to Study Gene Function in Cancer

RNA干渉（RNAi）が特異的に分解する標的mRNAによる遺伝子発現を阻害する。遺伝子サイレンシング1の二本鎖の小さな干渉RNA（siRNA）の発見以来、RNAiは遺伝子機能の研究において強力な研究ツールとなっています。遺伝子欠失に比べて、RNAiによる遺伝子サイレンシングは、そのようなことが行われると使いやすさと、ほとんどの細胞株への適合性など多くの利点を持っています。複数の研究は癌研究でのRNAi技術の応用を実証した。特に、U6またはH1プロモーターにより駆動される小さなヘアピンRNA（shRNA）を生成するDNAベクターベースの技術の開発が可能2,3サイレン長期および誘導性遺伝子を行いました。このようなレンチウイルスなどの遺伝子組み換えウイルスベクターと組み合わせて、その使用は、安定したshRNA発現のためにゲノムDNAにshRNAの配信、および/または統合の高効率​​を容易にします。 我々はdetaileを記述するdの手順では、shRNAは、レンチウイルスの生産と細胞感染、マウス異種移植モデルを用いた機能研究を表現するレンチウイルスベクターの構築を含む、遺伝子機能を決定するDNAベクターベースのRNAi技術を使用します。 様々な戦略がshRNAコンストラクトを生成する際に報告されている。プロトコルは、PCR増幅を採用し、3断片ライゲーションが直接かつ効率的にshRNAをコードする配列に余分な塩基の隣接を離れることなく、レンチウイルスコンストラクトをshRNAを含む生成するために使用することができますここで説明する。この戦略によって作成されたshRNAの発現カセットを制限酵素によって切断することができるので、それらは容易に異なる蛍光または抗生物質マーカーを有する他のベクターに移動​​することができます。ほとんどの市販のトランスフェクション試薬は、レンチウイルス生産に使用することができます。しかし、このレポートでは、我々は90％のトランスフェクション効率を上に実現することができますリン酸カルシウム沈殿を用いた経済的な方法を提供する293T細胞。構成のshRNA発現ベクターに比べ、誘導性のshRNAシステムは、細胞増殖に必須の遺伝子をノックダウンに特に適しています。我々は、陰陽1（YY1）、TETオン誘導shRNAのシステムおよび腫瘍形成に及ぼす影響によって乳癌4,5、の潜在的な癌遺伝子の遺伝子サイレンシングを示しています。レンチウイルスを用いた研究は、研究者の所属機関のバイオセーフティ委員会によるバイオプロトコルのレビューと承認を必要とします。動物モデルを用いた研究では、アニマルケア、動物プロトコルのレビューと承認を必要とし、研究者の機関の委員会（ACUC）を使用します。

RNA干渉（RNAi）は遺伝子ノックアウトよりも多くの利点を有し、広範に遺伝子機能研究のツールと​​して使用されています。 DNAベクターベースのRNAi技術の発明は、長期的および誘導性遺伝子のノックダウンを可能にした、また、遺伝子サイレンシングの可能性を増加している<emin vivoでの&gt;</em&gt;。

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

RNA干渉（RNAi）は、標的mRNAを特異的に分解することで遺伝子発現を抑制します。二本鎖の小型干渉RNAの発見以来、...

この手順の目的は、DNAベクターベースのRNA干渉を用いて遺伝子機能を決定することです。まず、特定の遺伝子を標的とするshRNA構築物を設計・作製します。次に、shRNA発現カセットを搭載したレンチウイルスを作製します。次に、レンチウイルスを感染させて安定細胞株を構築し、そのレンチウイルス感染細胞をさまざまなin vitroおよびin vivoアッセイに使用して、目的遺伝子のサイレンシングによる影響を判定します。最終的に、使用するアッセイに応じて、in vitroでの増殖、遊走、浸潤アッセイ、およびin vivoでのゼノグラフト形成モデルを通じて、遺伝子ノックダウンの結果として細胞の腫瘍形成能に変化が生じることが示されます。本手順の実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるDaniel Stowellと、技術者のMa Juanです。Changは博士研究員です。この手法は、特定の遺伝子が癌の発生と進展に役割を果たしているか、また、それらのプロセスのどの側面において重要であるかなど、癌研究分野における重要な疑問への解答に役立ちます。まず、記載された基準に基づいてオリゴヌクレオチドを設計し、注文します。標的遺伝子内の20〜23ヌクレオチドの標的配列を含む2本の相補的なオリゴを準備します。これらは両端にEcoRIおよびHindIII部位を形成します。アニーリング後、標的配列のリバース相補配列およびその3'端を含む別のオリゴを、アップストリームプライマーを用いてH1またはU6プロモーターの3'端にアニールさせます。PCRを用いて、両端にBamHIおよびHindIIIサイトを持つ断片を作成します。同時に、レンチウイルスベクターとPCR断片を消化します。その後、ベクター、PCR断片、およびAnnealオリゴヌクレオチドの間で3断片ライゲーション反応を行います。1:10:10のモル比で反応させた場合、得られるベクターはループ領域にHindIII配列を持つ目的のshRNAを産生します。誘導性ベクターを使用する場合、shRNAの産生は、Tet-onシステムにおけるドキシサイクリンなどの誘導因子の存在に依存します。次に、ライゲーション産物を用いて、高効率のコンピテントE. coli DH5α細胞に形質転換を行い、コロニーPCRスクリーニングによって陽性ベクターを同定します。ベクターと誘導性プロモーターのライゲーション部位にまたがる産物を増幅させます。市販のキットを用いて、陽性コロニーからプラスミドDNAを調製します。その後、Bam HIおよびEco RIによる消化と、アガロースゲル電気泳動により、インサートの存在を確認します。さらに、LIGA nucleotide P fiveを用いて、プロモーターおよびS-H-R-N-Aを含む領域のシーケンシングを行います。エンドトキシンフリー

dna-vector-based-rna-interference-to-study-gene-function-in-cancer

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Medicine

医学

ウイルス感染に関与する新規の宿主因子は、機能のRNAiスクリーニングの細胞ベースのゲノムワイドな損失を介して識別できます。...

に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

RNA干渉は、遺伝子の機能を解析することは非常に効果的であることが証明されています...

dsRNAをインジェクションによるRNAiの干渉にショウジョウバエ胚

出典：Fuchs, M. 他. アデノフェクション：枯渇・レスキュー実験による細胞形態力学における分子シャペロンの役割を研究するための手法. J. Vis. Exp. (2016)このビデオでは、子宮頸がん細胞における、siRNA-リン酸カルシウム導入法と組み合わせたアデノウイルス媒介による蛍光トランスジェンの導入法を実演します。アデノウイルスは蛍光置換タンパク質を発現させ、一方でsiRNAはRISC結合を介して標的mRNAの分解を誘導します。この逐次的な共導入により、内因性タンパク質のノックダウンとトランスジェンによる機能的レスキューを同時に行うことができ、蛍光イメージングを通じてタンパク質の置換を可視化し確認することが可能になります。 Fuchs, M. 他 アデノフェクション：枯渇・レスキュー実験による細胞形態動態における分子シャペロンの役割を研究するための手法 J. Vis. Exp. (2016)このビデオでは、子宮頸がん細胞における、アデノウイルスを介した蛍光トランスジェンの導入と、siRNA-リン酸カルシウム transfection...

がん細胞におけるアデノウイルス導入とsiRNAによるノックダウンの併用

ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。...

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、 Dermestes maculatus

リップ-タグを利用した体細胞遺伝子の転送システムを実証するためのプロトコルを提案します。RIP tvaマウス モデル転移遺伝子の機能を研究します。鳥のレトロ ウイルスは、成体マウスの膵 β 細胞の前癌性、非侵襲的病変への遺伝子導入を確保するため intracardiacally...

同定と新規リップ-タグ; に遺伝子導入による転移因子の解析RIP tvaマウスモデル

ここで我々 はプロトコルを記述する腫瘍溶解性ウイルス治療を高めるために操作することができますホスト ターゲットを明らかにするハイスループット RNAi スクリーニングを採用するため特に rhabodvirus ワクシニア...

腫瘍溶解性ウイルス治療を調節するホストの要因を識別するために全ゲノム RNAi スクリーニング

このプロトコルは、マイクロRNAクラスターネットワーク解析のための、規則的に間隔をあけた短い回文反復(CRISPR)遺伝子編集ワークフローをクラスター化したハイスループットのクラスター化を記述しており、1回の実験で35...

マイクロRNAクラスターネットワーク解析のためのCRISPR遺伝子編集ツール

多くのアップレギュレーションされた遺伝子は、腫瘍細胞の遊走と浸潤を刺激し、予後不良につながります。どの遺伝子が腫瘍細胞の遊走と浸潤を制御しているかを決定することは非常に重要です。このプロトコルは腫瘍のセルの移動そして侵入に対する遺伝子の高められた表現の効果をリアルタイムで調査するための方法を示す。...

合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

本プロトコルは、乳頭 を介した...

インビボ 乳腺内注射によるマウス乳腺上皮細胞への遺伝子導入

この研究では、黒色腫細胞の長いノンコーディングRNAを標的とするデュアルCRISPRiシステムを示しています。これは、組み合わせ遺伝子ノックダウンと合成致死スクリーニングを可能にし、潜在的な治療戦略のためのがん特異的なlncRNA相互作用を特定します。...

がん細胞のノンコーディングRNA間の合成致死的相互作用を標的とするためのデュアルCRISPR干渉戦略

学ぶDNAベクターベースのRNA干渉法を用いた遺伝子機能解析。レンチウイルス産生と安定細胞株構築により、in vitroおよびin vivoアッセイで遺伝子ノックダウン効果を評価し、がん研究における遺伝子機能を解明する。

癌における遺伝子機能を研究するDNAベクターベースのRNA干渉

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