胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

このプロトコルの実施には3時間を割り当ててください。習熟すれば、解剖する胚の数に応じて、完了まで1.5時間から2時間程度で済むようになります。本プロトコルでは、迷走神経管を含む組織を単離するために、受精後9.5日の胚を中耳板（mid otic plaque）レベルで切断し、体節4を分離する方法について説明します。切断工程。

体節16および22において、体幹神経管を含む組織を分離します。迷走神経堤は迷走神経管から遊走します。一方、体幹神経堤は体幹神経管から遊走しますが、分離した組織をコラゲナーゼ溶液で酵素消化し、洗浄した後、非神経性の外胚葉および中胚葉を切り離します。

単離した神経管をさらに2回洗浄し、自己 renewing 培地に播種します。私はヴァンダービルト大学 Bosky 研究室の Elise Graph です。本日は、explant 培養において神経管から神経堤を単離する方法を実演します。

この手法により、神経堤の特性をin vitroで研究することができます。それでは始めましょう。まず、1 mg/mLのフィブロネクチン100 µLを、滅菌済みのDPBS 3.2 mLで希釈します。

4ウェルプレートの各ウェルの底面を覆うのに十分な量の30 µg/mLフィブロネクチン溶液を分注します。4ウェルプレートの隅を軽く叩き、すべてのウェルに均一に広がっていることを確認します。培地の調製とろ過を行う間、プレートをそのままにしておきます。

プレートを少なくとも15分間静置してください。培地を調製するために、以下の試薬を用意します。培地は、使用直前にバイオセーフティキャビネット内で調製します。

常に無菌操作を徹底してください。4ウェルプレートからfiber ninを取り出し、フードの奥で蓋を開けたまま乾燥させます。fiber ninが乾燥するまでに約15分かかります。

プレートが乾燥したら、各ウェルに自己複製培地を500 µL加えます。プレートを37 °C、5% CO2の加湿インキュベーターに設置します。解剖を開始する直前に、5 mLのDPBSに50 µLのcollagenase disc spaceを混合します。効率的な消化を行うため、必ずcollagenase dispaをすべて加えてください。

0.2 µmのシリンジフィルターを用いて、コラゲナーゼdispa溶液を12ウェルプレートの3つのウェルに分注します。5 mLの溶液を各ウェルに3分の1ずつ分注してください。残りの各ウェルに、洗浄用培地を約1 mLずつピペットで加えます。分離した組織を消化するまで、プレートを氷上に置いてください。

次に、滅菌済みのカミソリで P 20 ピペットチップの先端を、面取りされた縁のすぐ下で切り落とします。胚や単離した組織片が溶液間の移動時にチップに付着しないよう、チップを洗浄液に浸します。

定時交配させた雌マウスから、P 1000のチップを用いて同様の操作を行います。雌マウスから子宮を取り出します。滅菌済みのDPBS中で解剖を完了させます。

加熱滅菌などの任意の方法を用いて、解剖器具を滅菌します。DPBSが濁った場合は、カットしたP 1000を用いて、切除した組織から胚を新しい滅菌済みDPBSのディッシュに移動させます。子宮組織を脱落膜から慎重に剥離させます。

次に、脱落膜内から胚を慎重に取り出します。胚の位置をここにある模式図で示しています。受精後9.5日の胚を単離した後、インスリン針を用いて卵黄嚢を慎重に除去します。

プロトコルにジェノタイピングが必要な場合は、卵黄嚢および残りの胚組織を清潔で滅菌済みのDPBSで洗浄します。組織を1.5 mLチューブに入れ、DNAを単離するまで-80°Cで保存します。胚の解剖学的構造を確認してください。

体節4、16、22の正中耳管PLAコードにて切断を行います。体節数を数えるために、顕微鏡の焦点を調整してください。まず、正中耳管PLAコードで最初の切断を行います。

神経管の他の部分を傷つけないように、針をハサミの刃のように使用します。第2切開はsomite 4の直後に行います。次にsomite 15まで切り進め、その直後で切断します。

胚が発達段階のより早い段階にある場合は、22体または最後の体節の後に最終的な切断を行います。迷走神経管を含む組織を分離するため、この組織には体幹神経管が含まれています。

中耳プラトー（mid otic plateau）と第4鰓弓（fourth somite）の間の組織から心臓を切り出します。分離された組織片の大きさの違いに注目してください。迷走神経管を含む組織片は、もう一方よりも幅が広くなっています。

この物理的な区別により、2つの組織をまとめて処理することが可能です。P 20 カッターを使用して、神経管をコラゲナーゼ溶液へ移します。残りの組織はジェノタイピング用に保管してください。

前述の通り、単離した組織片をコラゲナーゼ溶液が入ったウェルのいずれかに配置します。室温で10分間静置してください。

10分間のインキュベーションの間に、次の胚の解剖を開始してください。10分後、コラゲナーゼ溶液から分離した組織を取り出し、洗浄液を用いてピぺッティングにより洗浄し、消化した組織をDPBSに入れます。これが消化後の組織の状態です。

次のステップでは、非神経外胚葉と中胚葉を除去します。まず、非神経外胚葉を神経管から剥がします。次に、中胚葉を神経管から除去します。

非神経性の皮膚および中胚葉の除去を実演するため、ここでは迷走神経管に焦点を当てます。同様の手順を体幹神経管でも行うことができます。まず、1本の針で非神経組織を固定します。

もう一方のチップを用いて、神経外胚葉以外の部分を慎重に除去します。次に、神経管に隣接する体節を慎重に除去し、非神経組織の残渣を取り除きます。先端をカットしたP20ピペットチップを用いて、この操作を慎重に繰り返します。

神経管を洗浄液で2回洗浄します。神経管を自己複製培地に浸した後、準備済みの4ウェルプレートに播種します。

4ウェルプレートを低酸素チャンバーに入れます。チャンバーが密閉されていることを確認してください。酸素分析計を取り付け、混合ガスの供給源をオンにします。

1%酸素、6%二酸化炭素、および93%窒素の混合ガスを使用します。低酸素チャンバーにガスを充填し、酸素濃度を3%にします。混合ガスの供給を停止し、低酸素チャンバーを37 °Cに設定します。

24時間後。神経管の平面図を確認します。神経管から神経堤細胞が遊走しているはずです。非神経堤組織との混入を防ぐため、インスリン針を用いて神経管の外周を囲む実線に沿って切り出します。

次に、外植片から神経管および残存する非神経堤細胞を除去します。培地を新鮮な自己複製培地に交換し、プレートを低酸素チャンバーに戻します。チャンバーにガスを充填し、37 °Cに設定します。

培養から24時間後、神経堤は神経管から遊走します。成長の範囲を破線で示しています。矢印で強調されたこの神経堤の成長部位は約96%の純度であり、細胞は P75、SOX10、および FoxD3 を発現しています。

これらの培養神経堤細胞を用いて実施可能な実験には、以下が含まれますが、これらに限定されません。培養状態が最適でない場合、効率的なアウトグロースが得られないことがあります。その際は、低酸素条件、フィブロネクチン濃度、およびコラゲナーゼによる組織消化時間を再確認してください。DYS Space 本日、神経管から神経堤を培養するための基本について実演しました。

実験の成功をお祈りいたします。