コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島
2012年9月7日
マウス膵島分離の詳細な説明はコラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製組み合わせのin situ膵管カニュレーションと灌流の技法を用いて説明する。
この手順の全体的な目標は、マウスの膵臓からアイレットを成功裏に分離することです。これは、最初に膵臓を周囲の組織から分離することによって達成されます。次に、胆管をカニューレ挿入して、コラゲナーゼプロテアーゼ混合物で膵臓を膨らませることができます。
膨らませたら、膵臓を取り外し、アイレットを慎重に解離します。最後に、分離されたアイレットはろ過され、将来の使用のためにメッキされます。最終的には、精製されたコラゲナーゼと中性プロテアーゼを用いたこのアイレット単離法を使用して、アイレットの収量を最大化し、最適なアイレット形態を得ることができます。
この手法が既存のアイレット単離法と比較した場合の主な利点は、精製酵素を使用することでロット間のばらつきを排除したことです。さらに、アイレットの形態を改善するために、一部のプロトコルを変更または改善しました。安楽死後、肛門から横隔膜まで腹腔を完全に開く前に、胴体を70%エタノールで覆います。
次に、マウスを解剖顕微鏡のプラットフォームに置きます。盲腸と上行結腸を引き出し、それらを体腔の外側の左側にセットし、肝臓の葉を横隔膜に対して変位させます。彼らが自分でそこにとどまらない場合は、体腔の開口部を増やしてください。
湾曲した鉗子で十二指腸をつかみ、肝臓につながる肝動脈門脈と胆管束を見つけます。湾曲した鉗子の別のペアで。動脈静脈と管束の下に縫合糸を挿入し、できるだけ肝臓に近づけて締めます。
2対の湾曲した鉗子を使用して、十二指腸を慎重につかみ、取り付けられている胆管を見つけます乳頭で、鉗子の1つのトングを使用して、胆管のすぐ下と乳頭の近くで膵臓と結合組織を突き刺します。すぐに、鉗子を穴に通し、縫合糸を挿入します。ゆるく。胆管の周りに縫合糸を結び、90度の鉗子を使用して小さな円を作ります。
胆管がタウになるまで小腸を引っ張ります。腸を保持したまま乳頭から胆管を外さずに、超極細のハサミで乳頭を横切って水平に1回切り込みを入れます。カニューレを胆管に挿入し、カニューレの周りで縫合糸をしっかりと引っ張ります。
次に、3ミリリットルのシリンジに2.0ミリリットルのコラゲナーゼプロテアーゼ混合物を満たします。この混合物をゆっくりと一定のペースでカニューレに注入します。膵臓の膨張が完了したら、胆管からカニューレを取り出します。
下行結腸から始めて、胆管に到達するまで腸を引き上げながら結合組織を切り取ります。次に、膵臓を脾臓および周囲の組織から分離します。最後に、縫合糸を切り取り、膵臓を切除します。
取り外したら、氷上に5ミリリットルのHBSSが入った50ミリリットルのチューブに膵臓を入れます。すべてのサンプルが収集されたら、膵臓組織を含む50ミリリットルのチューブを摂氏37度の水浴に入れます。15分間、チューブを静かに揺らし、組織の解離を確認します。
ティッシュが簡単にバラバラになることを確認し、チューブを蓋で保持します。12回渦巻いて、組織をさらに解離させます。30ミリリットル以下のHBSSを加えて遠心分離します。
上清を慎重に吸引し、細胞パレットを乱さないように、下部に少量の上清を残します。14ゲージの針に取り付けられた30ミリリットルの注射器を使用して、10ミリリットル以下のHBSSを追加し、サスペンションを上下に2回吸引します。細胞混合物をプラスチック製のTストレーナーでろ過し、50ミリリットルのチューブに入れます。
さらに10ミリリットル、HBSSおよび遠心分離機ですすいでください。上清をデカントし、チューブを反転させて吸収性ペーパータオルで1分間水気を切ります。各チューブを10ミリリットルに再懸濁します。
コールド1100。彼の不透明なオーバーレイ、彼の不透明は10ミリリットル、HBSSと遠心分離機で。大口径の25ミリリットルのピペットを使用して20ミリリットルの上清全体を取り除き、上清を逆70ミクロンのフィルターに通します。
アイレットを直接ペトリ皿にろ過し、10ミリリットルのアイレット培地をフィルター培養物でピペッティングしてすすぎます。実験の準備ができるまで、組織培養インキュベーター内のアイレット。アイレットの収率、形態、および品質は、アイレット分離の成功を判断するために使用される一般的なパラメーターです。
典型的なアイレットの形態を以下に示します。アイレットは、比較的均一なサイズの円形から長方形の形状をしています。ここは。単離されたアイレットは、グルコース刺激インスリン分泌について分析されました。
シグマタイプ11で調製したアイレット間のインスリン刺激は、ci zyme TM、MABPと比較して同程度であり、アイレット調製の品質が高いことを示しています。このビデオを見た後、マウスの胆管をカニューレ挿入する方法をよく理解しているはずです。ザイムコラゲナーゼおよびニュートロプロテアーゼを使用して、あらゆるアッセイでまぶたを分離します。
概要
この記事では、in situ 膵管カニューレ挿入とコラゲナーゼ-プロテアーゼ混合物を使用して、マウスの膵臓からアイレットを分離する詳細な手順について説明します。この方法は、アイレットの収率と形態を改善しつつ、変動性を最小限に抑えることを目的としています。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 内分泌学
背景
- アイレット細胞はインスリン生成に不可欠です。
- 従来の分離方法では結果の変動性が生じる可能性があります。
- 精製酵素を使用することで、分離されたアイレットの品質を向上させることができます。
- 改良されたプロトコルは、アイレットの形態をより良くすることができます。
研究目的
- マウスの膵臓からアイレットを効果的に分離すること。
- 酵素製剤のバッチ間での変動性を減少させること。
- 研究応用のためにアイレットの形態を最適化すること。
使用された方法
- 周囲組織からマウスの膵臓の分離。
- 酵素注入のための胆管のカニューレ挿入。
- コラゲナーゼ-プロテアーゼ混合物による膵臓の膨張。
- 実験用の分離されたアイレットのろ過と培養。
主な結果
- アイレットの分離と成功した解離。
- 分離後に観察された改善されたアイレットの形態。
- インスリン分泌テストによって示された高品質のアイレット製剤。
- 従来の技術と比較して、変動性が低いことが示された方法。
結論
- 記述された方法は、高品質のアイレットを分離するのに効果的です。
- 精製酵素を使用することで、結果の信頼性が向上します。
- この技術は、アイレットを含む様々なアッセイに有益である可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
