Name: ガスクロマトグラフィーによるオペラントエタノール自己投与とエタノール判別中エタノールのマイクロダイアリシス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 学ぶガスクロマトグラフィーによるマイクロダイアリシス法で、ラットのオペラントエタノール自己投与時の脳内エタノール濃度をリアルタイムにモニタリングする手法です。行動薬理学研究に有用です。

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この研究は、NIH / NIAAA（AA11852およびAA007471）からの補助金によって支えられている。

<ol><li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> J. Vis. Exp. (20), e880(2008).</li>
<li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dopamine+response+in+the+nucleus+accumbens+core-shell+border+differs+from+that+in+the+core+and+shell+during+operant+ethanol+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).</li>
<li>Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+activity+in+the+nucleus+accumbens+during+consummatory+phases+of+oral+ethanol+self-administration%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).</li>
<li>Pettit, H. O., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+dose+on+cocaine+self-administration+behavior+and+dopamine+levels+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens.</a> Brain Res. 539, 94-102 (1991).</li>
<li>Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Chemoarchitectonic+Atlas+of+The+Rat+Forebrain%22">Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain</a>. , Academic Press Inc. (1998).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press Inc. (1986).</li>
<li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSkoog%2C+DA+%22Principles+of+Instrumental+Analysis%22">Principles of Instrumental Analysis</a>. , 5th Edition, Thomson Learning, Inc. (1998).</li>
<li>Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+operant+self-administration+of+10%25+ethanol+plus+10%25+sucrose+on+dopamine+and+ethanol+concentrations+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens.</a> J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).</li>
<li>Carrillo, J., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+exposure+to+voluntary+ethanol+self-administration+produces+adaptations+in+ethanol+consumption+and+accumbal+dopamine+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling.</a> Alcohol. 45, 559-5566 (2011).</li>
<li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shell+of+the+nucleus+accumbens+has+a+higher+dopamine+response+compared+with+the+core+after+non-contingent+intravenous+ethanol+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration.</a> Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).</li>
<li>Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Ethanol+Concentrations+in+the+Extracellular+Fluid+of+the+Rat+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain.</a> J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).</li>
<li>Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Microdialysis+of+Ethanol+in+Rat+Striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).</li>
</ol>

この記事は、メッドアソシエイツ株式会社によって資金を供給された

アプリケーションと制限薬物自己投与は、モデル薬物中毒にげっ歯類で使用されています。この方法でモデル化され、虐待の多くの薬物は、薬物が中心コンパートメントに直接配信されて、静脈内に投与することができる。これは、自己管理セッションを介して投与量の綿密なモニタリングを可能にします。エタノールは経口通常自記式であるので、それは吸収と代謝の個体差に起因する薬物濃度を監視することは非常に困難です。興味のある脳領域からサンプルにマイクロダイアリシスを用いて、我々は唯一の領域に到達するエタノールのパターンをモニタすることはできませんが、我々はまた、同時に各々自己管理フェーズで時間をかけて同じ領域内の神経伝達物質の変化を監視することができます。 脳内の神経化学的な変化と薬物誘発性応答は薬物乱用と依存性に関連付けられている、したがって、同時に測定する能力を具体的な自己管理のフェーズで確認神経化学と薬物濃度は非常に強力でユニークなツールを提供しています。行動と検体の透析液の濃度を相関させるために心に留めておくべき一つの問題は、マイクロダイアリシス配管の物理的な特性である。具体的には、マイクロダイアリシスプローブの内腔からのコレクションチューブに転送する流体にかかる時間は重要であり、短い時間では優れています。私たちの研究室では、時間は約90秒になるようにプローブを構築。これらの条件を用いて、我々は、透析液のエタノール濃度の増加に伴って、ドリンクやポストドリンク期間の経過とともに減少し、エタノールの消費、開始時のaccumbalドーパミンの増加があることを発見した。2,3,8,9これらの実験は、 、薬理学的研究からのデータと組み合わせたとき、私たちはCHにエタノールと自己管理に伴う環境手がかりの厳密薬理作用を解析することができました神経伝達物質濃度のアンジェス。 これは、結合された行動 - マイクロダイアリシス技術のこの特定のアプリケーションは、我々の研究室の現在の研究対象に適していることに留意すべきである。それは、我々は同期自己管理行動にこれらの措置を関連付けることができるように、同じ領域内の神経伝達物質の変化のパターンと比較して脳に到達するエタノールの時系列パターンを評価するために設計されています。派生した透析液のエタノール濃度は、in vivoでのプローブ回復のために修正され、脳のエタノール組織中濃度のほんの一部ではありませんされています。エタノールの定量的な微小透析が必要な場合は、プローブへの細胞外空間から拡散することをエタノール抽出画分は、実験的に決定されるべきである。メソッドとさらなる議論のために我々の研究室から以前の資料を参照してください。10,11,12 このプロトコルは、ガスchの使い方を示していますが微小透析試料のヘッドスペースからのエタノールの固相マイクロ抽出と共にromatographyは、マイクロダイアリシスサンプルのエタノール含有量の分析のための他の方法を用いることができる。しかし、代替の方法は、いくつかの欠点に苦しむことがあります。例えば、機密性の低い分析方法は、ここに示されて5月7日分未満のサンプリング倍必要とサンプル量を増やす必要がある場合があります。ここで説明するシステムのタイプは、バイアルのヘッドスペースに配置ファイバへの吸収を可能にすることにより、密封されたサンプル瓶内の気相中のエタノールを濃縮固相マイクロ抽出を使用しています。これは、通常の蒸気の50から100マイクロリットルを注入することができます直接ヘッドスペースサンプリングと比べて検出限界を向上させます。ヘッドスペース法のもう一つの大きな利点は、分析のために注入されたサンプルは非常にきれいで、塩の自由であるということです。液体微小透析試料の直接注入も高いsensitと共に使用されるかもしれませんivityが、これは注入された塩をきれいにするために必要な定期的なメンテナンスのためのダウンタイムより楽器が必要になります。 トラブルシューティングやその他の注意事項<ol><li>あなたの実験を開始する前に、あなたのマイクロダイアリシスのセットアップが正常に機能していることを確認するために、すべての問題をトラブルシュートするために自分の時間の多くを与える。私たちはあなたと一緒に切り替える準備、ACSFで灌流し、セットアップ余分を持っていることを示唆しているほとんどのオペラントセッションが毎日特定の時間に発生する傾向があるので、自分の時間を節約するためにセットアップ誤動作。 </li><li>マイクロダイアリシスプローブはプローブが脳を貫通などの組織の剪断によって生成される組織の損傷を最小限にするために、約5分間かけて挿入されていることを確認してください。 </li><li>オペラントチャンバーにラットを転送する場合は、2番目の人は、搬送ライン（マイクロダイアリシスのセットアップの一部）がもつれになっていないこと、およびオペラントプログラムがinitをすることができるように支援しておくと便利です時間にiated。 </li><li>あなたが適切な温度に達するまでの時間のオートサンプラの水槽をたくさん与えることを確認してください。我々のシステムは、通常は2時間、50℃に到達するために必要また、あなたのサンプルが完全にサンプルを分析する前に気化されることを保証する。我々は一般的に視覚的に、これはサンプル分析を開始する前に発生したことを確認します。 </li><li>標準の良い分析化学プラクティスに従うべきである。これらには、個人、機器、および手順の検証が、これらに限定されない。要するに、我々は、次のガイドラインを採用しています個々のユーザは、複数日にわたって標準濃度と線形標準曲線（R2≥0.99）の再現性、ピーク高さの値を生成する能力を実証する必要があります。 GC-FIDシステムが正常に動作していることを確認するには、標準的には、すべての透析液サンプルが注入される前に解析することが常にあるべきである。生成された標準曲線はR2≥0.99を持っている必要があります。 </li><li>我々が使用する機器のほとんど2010年にアジレント·テクノロジーズに買収されたバリアン社を通じて購入した。この時点では、ブルカー·サイエンティフィックインスツルメンツはVarianの実験室ガスクロマトグラフィー機器事業を取得しました。今後の購入については、どちらかの会社に相談してください。 </li><li>本プロトコルでは、ラットを用いたオペラント行動を示していますが、ビューアは動作をより混乱が小さいマウスモデルで発生する可能性があることに注意する必要があります。注意すべきもう一つの問題は、その内側前頭前野や側坐核以外の脳領域に微小透析プローブの配置がここに示されているよりも大きくオペラント行動に支障をきたす場合がありです。密接にプローブ配置による被害が行動に深刻な変化をもたらすかどうかを判断するために、多数の行動のパラメータを調べることが重要です。 </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 95％エタノール</td><td> AAPERアルコールと化学株式会社シェルビーヴィル、ケンタッキー州</td><td> E190、111000190 </td></tr><tr><td>超純ショ</td><td> MPバイオメディカル、LLCは、ソロン、オハイオ州</td><td> 821721 </td></tr><tr><td>超高純度ヘリウム</td><td>空気ガス</td><td> HE UHP300 </td></tr><tr><td>空気</td><td>空気ガス</td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td>水素</td><td>空気ガス</td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> GCの2 mLバイアル</td><td>アジレント</td><td> ＃8010-0015 </td></tr><tr><td> PTFE /シリコンセプタム付きのGCバイアルキャップ</td><td>アジレント</td><td> ＃8010-0084 </td></tr></tbody></table> 表1に特異的な試薬

ガスクロマトグラフィーによるオペラントエタノール自己投与とエタノール判別中エタノールのマイクロダイアリシス

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

オペラント自己管理の方法は、一般的にエタノールを含む虐待の多くの薬剤の行動や薬理作用を研究するために使用されています。しかし、エタノールは、一般的に経口投与した自己ではなく、虐待の多くは、他の薬のように静脈内にされています。経口投与された薬物の薬物動態は、静脈内投与される薬よりも複雑です。エタノールの薬理学的および行動への影響の関係を理解することは、エタノールの経時的変化の知識が飲酒中や後に脳に到達する必要があるので、我々は時間をかけて脳透析液のエタノール濃度を監視するために水素炎イオン化検出器のin vivoマイクロダイアリシスとガスクロマトグラフィーに使用します。 組み合わせたマイクロダイアリシス - 行動実験は、いくつかの技術の使用を含む。自己投与と神経の多くをテストするために適合させることができ、この記事では、定位手術、行動訓練とマイクロダイアリシス、rochemical中心仮説は、彼らだけがサンプル採取および透析液エタノール分析の後続フェーズとどのように関係するかを説明するために含まれています。エタノールの研究に固有の炎イオン化検出付きガスクロマトグラフィーによるエタノール濃度分析を透析液、詳細に記載されている。これらのメソッドによって生成されたデータは、自己管理手順の間に脳に到達するエタノールのパターンを明らかにし、同じ透析液サンプルの神経化学的解析と組み合わせた場合、結論はエタノールの薬理と行動への影響についての定めをすることができます。

オペラントエタノール自己投与時のラットの脳におけるエタノール濃度の経時変化を決定するための方法が記載されている。水素炎イオン化検出器付きガスクロマトグラフィーは、それが生成される小さなボリュームに必要な感度を持っているので、透析液サンプル中のエタノールを定量化するために使用されます。

オペラント自己投与法は、エタノールを含む多くの乱用薬物の行動学的および薬理学的効果を研究するために一般的に用いられています。

本手順の全体的な目的は、エタノールの自己投与セッション中における脳ダイアリゼート中のエタノール濃度をモニタリングすることです。この測定値を同期した自己投与行動と比較するため、まずマイクロダイアリシスガイド、カニューレ、およびテザーボルトを外科的に植え込み、次にラットにエタノールのオペラント自己投与を訓練させます。第2のステップでは、マイクロダイアリシス中にエタノールの自己投与が妨げられないよう、ラットをヘッドステージテザーに慣れさせます。次に、エタノール自己投与セッション中にマイクロダイアリシスを行い、透析液の一部をエタノール分析用に準備します。続いて、水素炎イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフを用いて、透析液サンプルのエタノール濃度を分析します。最終的に、得られた結果から、エタノール自己投与セッション中に目的の脳領域にエタノールが到達する時間経過が示されます。この手法の、尾静脈や伏在静脈からの採血などの既存の方法に対する主な利点は、サンプル採取時の侵襲性が最小限に抑えられ、動物が行動課題を遂行している間に、目的の脳領域における薬物濃度を経時的に測定できることです。一般的に、この方法に慣れていない人は、多くの専門的なスキルを必要とするため苦労しますが、その多くは繰り返しの練習や経験を通じてのみ習得できます。なお、本手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室の学部研究助手であるJeffrey Dilleyです。示されているすべての動物実験 procedure は、テキサス大学の施設内動物ケアおよび使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって承認されており、実験動物の飼育および使用に関するすべてのガイドラインおよび規制に従っています。テキサス大学オースティン校は ALAC 認定施設であり、これらの行動マイクロダイアリシス実験では、関心のある脳領域の上に 21 gauge のカニューレを外科的に留置した long Evans ラットが適切に扱われています。すべての動物は、以下の手順を開始する前に、少なくとも 1 週間の術後ケアと回復期間を経て、健康な状態でなければなりません。ラットを、Lichter社製の格納式レバーとティッパーチューブを備えたMed Associates社製のオペラントチャンバーに入れ、10% sucrose溶液を得るためにレバーを押すよう訓練させます。ラットがsucrose溶液に対して反応するよう訓練された後、適切な訓練スケジュールを開始します。このスケジュールでは、最後から2番目のオペラントセッションの前夜から、複数回の飲水セッションにわたって溶液にエタノールを徐々に添加していきます。動物を麻酔し、鎮静レベルを確認した後、ラットのヘッドステージにあるテザーボルトにテザースプリングを取り付け、カウンターバランスレバー、アーム、スイベルテザー、スプリング、およびリングスタンドで構成される装置に慣れさせます。マイクロダイアリシス実験の前日に、ラットをホームケージに入れ、自由摂取の餌と水を与えてオペラント室で一晩過ごさせます。その後、テザーおよび付属機器を装着した状態で翌日のトレーニングセッションを完了させます。イソフルランでラットを麻酔した後、足指へのピンチテストで鎮静状態を確認し、人工脳脊髄液を還流させたマイクロダイアリシスプローブを挿入します。プローブを適切に固定し、プローブの流量を0.2 microliters per minuteに調整します。ラットをオペラント室内のホームケージに入れ、すべての透析装置を装着した状態で一晩過ごさせ、餌と水を自由にとれるようにします。プローブ挿入の翌日、実験開始の少なくとも2時間前に、プローブを動作流量まで上げます。ハミルトンシリンジを用いて、プローブの流量が安定しており、設定流量の90%以上であることを確認してください。透析サンプル中の神経伝達物質を評価する場合は、実験の全フェーズでサンプルを採取してください。まず、動物がホームケージにいる間に透析サンプルを回収し始めてください。回収したサンプルは、後の解析に適した方法で保存します。ラットを慎重にオペラントチャンバーに移し、チャンバーを制御するオペラントプログラムを開始します。レバーがチャンバー内に伸びてくる前の2サンプル分、ラットが待機している間もサンプリングを継続します。各透析液サンプルの分画をエタノール分析用に採取するため、適切な量のアリコートを2 mLのガラスバイアルにピペットで移し、気密性セプタムでバイアルを封止します。エタノールサンプルのピペット操作と封止は迅速に行ってください。エタノールは揮発性が高く、サンプル量も少ないため、サンプル調製に不整合があったり時間がかかったりすると、不正確な結果につながります。残量は神経伝達物質分析用に保存してください。20分間の飲水期間は、Med Associatesのコンピュータプログラムによってレバーがチャンバー内に押し出され、ラットがそれを押して飲水ボトルにアクセスできた時点から開始されます。飲水期間中はずっとサンプリングを継続し、飲水期間が終了した後、コンピュータープログラムによってボトルをチャンバーから回収します。マイクロダイアリシス実験の最後に、さらに20分間の飲水後期間として動物をチャンバー内に保持します。ラットを麻酔した後、プローブを抜去します。動物を直ちに人道的に安楽死させない場合は、プローブの経路を確実に可視化させるためにオブテレーターを再度挿入します。実験から3日以内に脳を採取してください。サンプルを、50 °Cに加熱したヘッドスペースオートサンプラー、ヘリウムを移動相としたキャピラリーカラムを備えた、水素炎イオン化検出器付きガスクロマトグラフを用い、外部エタノール標準品とともに分析します。クロマトグラムの記録と分析には、クロマトグラフィー・ワークステーション・ソフトウェアを使用して、システムをエタノール分析に備えさせます。循環水槽を用いてオートサンプラープレートを加熱し、空気および水素タンクを開きます。次に、スタートアッププログラムを開始します。準備が整ったら、20分間の燃焼を行い、ファイバーを汚染除去します。100 mLのメスフラスコを用いて、238 µLの95%エタノールを水で100 mLまで希釈し、標準液を作成します。1対1の段階希釈を用いて標準系列を作成してください。標準物質をガラスバイアルにピペットで分注し、試料の調製時と全く同様に密閉します。標準物質と共に必ず水ブランクを測定してください。標準物質と試料をオートサンプラーのトレイにセットし、液体分注量全体が気化するまで加熱します。標準物質およびサンプルを分析するため、どのサンプルがどのオートサンプラーのスロットにあるかを記載したサンプルリストを作成し、各サンプルを穿刺（プンクチャー）する必要があることを明記します。データファイルの保存先フォルダを指定した後、サンプルに適したメソッドを選択し、分析を開始します。システムによるサンプルの分析が完了した後、プログラムが各ピークを正しく積分しているかを確認してください。各既知の外標準物質に対するピーク高さをプロットします。エタノール濃度。得られた点から線形関数を用いて、各透析液サンプルのエタノール濃度を補間します。この図は、3つの濃度のエタノール標準物質および、エタノール自己投与セッションの終了時に採取されたラット透析液サンプルの例となるクロマトグラムを示しています。エタノールのピークは比較的対称であり、保持時間が一定で、S/N比が10より大きい必要があります。これらの基準を満たさない場合は、システムのメンテナンスが必要です。高品質なクロマトグラフィーと正しく調製された標準物質によって線形な標準曲線が得られ、これを用いて、自己投与期間中にエタノール自己投与動物から採取された透析液サンプルのエタノール濃度を算出します。算出された透析液中のエタノール濃度は、in vivoでのプローブ回収率による補正が行われておらず、脳組織中のエタノール濃度のわずか一部に過ぎません。エタノールの定量的なマイクロダイアリシスが必要な場合は、細胞外液からプローブへと拡散するエタノールの抽出率を実験的に決定します。この手法に習熟すれば、適切に実施することで約4〜5時間で完了させることができます。これは行動セッションの長さに応じて異なります。本実験のマイクロダイアリシス相を正常に完了できるかは、準備段階の質に大きく依存します。この手順を行う際は、ラットが十分にハンドリングされており、ダイアリシス実験中に起こり得る注意散漫を誘発する刺激に動物を慣れさせ、動物の自己投与行動に影響が出ないようにすることが重要です。

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神経科学

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