ガスクロマトグラフィーによるオペラントエタノール自己投与とエタノール判別中エタノールのマイクロダイアリシス

この手順の全体的な目標は、エタノール自己投与セッション中に脳透析液中のエタノールレベルを監視することです。この測定を同期自己投与行動と比較するために、これは最初にマイクロダイアリシスガイド、カニューレ、テザーボルトを外科的に埋め込み、次にラットにエタノールをオペラント的に自己投与するように訓練することによって達成されます。第2のステップは、ラットをヘッドステージテザーに慣れさせることで、マイクロダイアリシス中のエタノール自己投与を妨げないようにすることです。

次に、エタノール自己投与セッション中にマイクロダイアリシスが行われ、その間にダイアラレートの一部がエタノール分析のために調製されます。次に、ダイアリン酸サンプルを、水素炎イオン化検出を備えたガスクロマトグラフを使用してエタノール濃度を分析します。最終的に、得られた結果は、エタノール自己投与セッション中にエタノールが関心のある脳領域に到達する時間経過を示しています。

尾部や伏在静脈穿刺などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、この手順がサンプル収集時の混乱を最小限に抑え、動物が行動課題を実行している間に脳の関心領域で経時的に薬物を測定できることです。一般的に、この方法に不慣れな人は、多くの専門的なスキルが必要であり、その多くは繰り返しの練習や経験を通じてのみ習得できるため、苦労します。また、この手順を実演するのは、私たちの研究室の学部生の研究助手であるJeffrey Dilleyです。

示されているすべての動物手順は、テキサス大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されており、実験動物の管理および使用に関するすべてのガイドラインに準拠しています。テキサス大学オースティン校は、ALAC認定施設であり、関心のある脳領域の上に21ゲージのカニューレを外科的に移植した長いエバンスラットを取り扱い、これらの行動マイクロダイアリシス実験に使用されています。すべての動物は、少なくとも1週間の術後ケアと回復を受け、健康であることを確認してから、以下の手順を開始する必要があります。

ラットを、リヒター格納式レバーとティッパーチューブが取り付けられたメッドアソシエイツオペラントチャンバーに入れ、10%スクロース溶液にアクセスするためにレバーを押すように訓練します。ラットがショ糖溶液に反応するように訓練された後、エタノールが最後から2番目のオペラントセッションの前夜に複数の飲酒セッションにわたって溶液に徐々に追加される適切なトレーニングスケジュールで開始します。動物に麻酔をかけ、鎮静のレベルを確認した後、テザースプリングをラットヘッドステージのテザーボルトに取り付けて、カウンターバランスレバー、アーム、スイベルテザー、スプリング、リングスタンドで構成される装置に慣れさせます。

ラットが自宅のケージのオペラントルームでアドリド、餌、水と一緒に夜を過ごすことを許可し、その後、マイクロダイアリシス実験の前日にテザーと付随する機器を所定の位置に設置して翌日のトレーニングセッションを完了させます。ラットにイソフフッ素で麻酔をかけた後、つま先つまみを行って鎮静を確認し、人工脳脊髄液を灌流したマイクロダイアリシスプローブを挿入する。プローブを適切に固定してから、プローブの流量を毎分0.2マイクロリットルに調整します。

ラットをオペラントルームのホームケージに入れて、すべての透析装置を所定の位置に設置し、リブ、エサ、水を追加して夜を過ごします。実験開始の少なくとも2時間前にプローブを挿入した翌日、プローブをその動作流量まで上げます。ハミルトンシリンジを使用して、プローブの流量が一貫しており、設定された流量の少なくとも90%であることを確認します。

透析サンプル中の神経伝達物質を評価する場合は、実験のすべての段階でサンプルを採取します。まず、動物が自宅のケージにいる間に透析サンプルを採取します。サンプルは、後で分析するために適切な方法で保存してください。

ラットをオペラントチャンバーに慎重に移し、チャンバーを制御するオペラントプログラムを開始します。ラットは、レバーが伸びる前に2サンプルがチャンバーに伸びるのを待っている間、サンプルの採取を続けます。エタノール分析のために各透析液サンプルの一部を採取するには、適切な透析液分を2ミリリットルのガラスバイアルにピペットで移し、バイアルを密閉性のあるセプタムで密封し、ピペットでエタノールサンプルを迅速に密封します。

エタノールは揮発性でサンプル量が少ないため、サンプル調製に一貫性がない、または遅いと、結果が不正確になります。残りは神経伝達物質の分析のために保管します。20分間の飲酒時間は、メッド・アソシエイツのコンピューター・プログラムがレバーをチャンバーに伸ばし、ラットがレバーを押して飲用液のボトルにアクセスした後に始まります。

飲酒期間終了後、飲用期間全体を通してサンプルを採取し続けると、コンピュータープログラムがボトルをチャンバーから引き込みます。マイクロダイアリシス実験の終了時に、飲酒後さらに20分間、動物をチャンバー内に保管します。ラットに麻酔をかけた後、プローブを取り外してください。

動物がすぐに人道的に安楽死させられない場合は、プローブ管の視覚化を確保するためにオブテレーターを交換してください。実験から3日以内に脳を採取してください。水素炎イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフ、摂氏 50 度に加熱されたヘッドスペースオートサンプラー、および移動相としてヘリウムを使用したキャピラリーカラムを使用して、サンプルを外部エタノール標準物質とともに分析します。

クロマトグラムの記録と分析には、クロマトグラフィーワークステーションソフトウェアを使用して、エタノール分析用のシステムを調製します。再循環水浴を使用して、自動車のサンプラープレートを加熱し、空気タンクと水素タンクを開きます。次に、スタートアッププログラムを開始します。

準備ができたら、20分間の燃焼を開始し、繊維を除染します。100ミリリットルのメスフラスコを使用して、238マイクロリットルの95%エタノールを水で希釈し、最終容量100ミリリットルまで標準を作成します。1対1の段階希釈を使用して標準液を作成します。

標準試料をガラスバイアルにピペットで入れ、サンプルが調製されたとおりに正確に密封します。必ずあなたの基準と一緒に水ブランクを実行してください。標準試料とサンプルをオートサンプラートレイに入れ、液体アリコート全体が気化するまで加熱します。

標準試料とサンプルを分析するには、どのサンプルがどのオートサンプラースロットにあるか、および各サンプルをパンクチャする必要があることを記録したサンプルリストを作成します。選択したフォルダにデータファイルをルーティングしたら、サンプルの方法を選択して実行を開始します。システムがサンプルを実行した後、プログラムが各ピークを正しく波形解析したことを確認します。

プロット、各既知の外部標準の関数としてのピーク高さ。エタノール濃度。点によって与えられる線形関数を使用して、各透析液サンプルのエタノール濃度を補間します。

この図は、エタノール自己投与セッションの終了時に収集された 3 つの濃度のエタノール標準試料とラット透析液サンプルの 1 つのクロマトグラムの例を示しています。エタノールのピークは比較的対称的で、保持時間が一定で、S/N比が10より大きい必要があります。これらの基準を満たさないと、システムはメンテナンス、高品質のクロマトグラフィーを必要とし、標準が正しく生成され、エタノール自己投与動物から自己投与の過程で収集された透析液サンプルのエタノール濃度を計算するために使用される線形標準曲線が生成されます。

導出された透析液エタノール濃度は、in vivoプローブ回収のために補正されておらず、脳エタノール組織濃度のほんの一部です。エタノールの定量的マイクロダイアリシスが必要な場合、細胞外空間からプローブに拡散するエタノールの抽出画分を実験的に決定します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば約4〜5時間で完了します。

これは、行動セッションの長さによって異なります。実験のマイクロダイアリシスフェーズが成功裏に完了するかどうかは、準備フェーズの品質に大きく依存します。この手順を試みる間、ラットが適切に処理されていること、および動物の自己投与行動が影響を受けないように、透析実験中に発生する可能性のある気を散らす可能性のある刺激にラットを慣れさせていることを確認することが重要です。