Name: ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: 学ぶ、一定圧力制御押出法によるナノサイズ脂質小胞の調製法。凍結融解サイクルと最適窒素圧を用いて、均一なサブミクロンリポソームを作製する。動的光散乱とナノ粒子追跡分析でサイズを評価し、ソニケーション法より優れた均一性を実現する。

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この作品は、コラボレーティブ·イノベーション·アワードハワードヒューズ医学研究所（HHMI）によってサポートされていました。 LAMは、保健研修助成金（T32 GM008759）とNIHルースL.キルシュシュタインプレドクトラルフェロー（CA165349-01）のシグナリングと生体調節研究所によってサポートされていました。我々は彼らの非常に貴重なコメントのために教授のマイケル·ストーウェル（CUボールダー）、教授ダグラス·リース教授ロブ·フィリップス（カリフォルニア工科大学）に感謝したいと思います。

1。リポソーム調製<ol><li>テフロンライニングキャップ付き20mLのガラスバイアルを取得します。 </li><li>汚染を防止するために使用する前にクロロホルムですべてのガラス器具や注射器を清掃します。 </li><li> 250μL気密ガラスシリンジを用いてガラスバイアルに試薬グレードのクロロホルム100μLを転送します。 </li><li> 100μL気密ガラスシリンジを使用して、同じガラスバイアルに試薬グレードのメタノール30μLを追加します。 </li><li> 2mMの7:1.5:1.5ホスファチジルコリン（POPC）を準備するには：ホスファチジルエタノールアミン（POPE）：コレステロール脂質溶液は、10 mg / mLのPOPC、10 mg / mLのPOPEと11 mg / mLの20μLの42μL216μLを転送20mLのガラスバイアルにCHCl 3中コレステロールソリューションを提供しています。 </li><li>脂質の薄膜をバイアルの底に観察されるまでが遅い流量アルゴンまたは窒素ガスを用いた有機溶剤を蒸発させる。 </li><li>残留溶媒を除去するために少なくとも30分間、真空デシケーター中で未キャップのガラスバイアルを置きます。 </li><li> TRバッファのansfer 2 mLのは、以前水和物脂質のガラスバイアルに、0.2ミクロンのフィルターを通過した。 </li><li> 4℃で一晩混合物をインキュベートし、48時間以内に使用します。 </li></ol> 2。凍結と融解：30のリポソームのサイズについて - 100 nmでのみ<ol><li> 15秒間以上、液体窒素中でのリポソーム懸濁液を凍結します。 </li><li> 42℃の加熱ブロックを用いてリポソーム懸濁液を解凍°〜3分間の温度。 </li><li> 5サイクルの合計に対して、手順2.1と2.2を繰り返します。 </li></ol> 3。押し出し正しく彼らのガイドブックに楽器のアウトラインを使用して、Liposofast LF-50押出機を組み立てるためAvestinの指示に従ってください。 <ol><li>サポートフィルタベースの大規模ホールのサポート画面が表示されます（円形の穴を持つ）を配置し、円形の焼結皿（穴なし）、1本のドレイン·ディスク（直径25mm）、1つのポリカーボネート膜（直径25ミリメートル）が続いている。 </li><li>小さな、黒を配置サポートフィルタをベースにそれを確保するための膜の上にO-リング。 </li><li> 4対応する穴に4本のネジを締めて、上部フィルター押出機を取り付けます。 </li><li>大型押出機のバレルの下にフィルタ押出機ユニットを組み立てる。シリンダーバレルにリポソーム溶液を追加します。ために、押出バレルの上に次のように配置します。大きな円形のOリング、狭いキャップ、大きな円形のOリング、円形のキャップ。 </li><li>押出機バレル上部にガスレギュレータを取り付け、圧力リリーフバルブなど、空気漏れを防ぐためにすべてのバルブを閉じます。 20mLのガラスバイアルまたは押出機フィルターユニットの下に50 mLの三角フラスコを置きます。安全弁は、レギュレータに接続されており、圧力は600 psiを超えた場合に解放されます。窒素ガスをオンにして押出機に接続されたガスのバルブを開きます。 </li><li> 400nmのリポソームは、100 nmのリポソーム125 PSI、30 nmのリポソームの400から500 PSI、25 PSIへの窒素の圧力を増加させます。 </li><li>リポソームsuspを見る窒素に押されながらensionそれはコンテナに排出されるとして。あなたは、もはやガラスバイアルに押出機フィルターを介して任意の液体の通過を観察しなくなるまで窒素が流れ続ける。 </li></ol> 4。動的光散乱（DLS）の分析<ol><li> 20μMリポソーム溶液50μLを準備します。 </li><li>電源とランプの源をオンにします。 </li><li> DynaProソフトウェアを開きます。 </li><li> &gt; 100 nmのリポソームを検出するためには30nmと100nmとMS800アルゴリズムモデルのリポソームを検出するためにMS / Xアルゴリズムのモデルにソフトウェアを設定します。 </li><li>ハードウェアに接続します。 </li><li>セルホルダーに石英キュベットとインサートにリポソームサンプルのピペットで14μL。 </li><li>開始を押します。 </li><li> 30買収 - 約20後に停止を押します。 </li><li>ヒストグラムに記録されている平均的なリポソームの直径のピークを分析します。 </li></ol> 5。ナノ粒子のトラッキング分析（NTA） <ol><li> 500μL、0.1μMのリポソームを準備するソリューションを提供します。 </li><li>水とエタノールを含むサンプルコンパートメントをすすぎます。 </li><li>糸くずの出ないペーパータオルを使用してサンプルコンパートメントを乾燥させます。 </li><li>レーザー電源とコンピュータの電源をオンにします。 </li><li>サンプルコンパートメントに0.1μMリポソーム溶液300μLを提供します。 </li><li>温度制御とナノ粒子トラッキング解析ソフトウェアを開きます。 </li><li>レーザーをオンにキャプチャボタンを押します。 </li><li>ステージを移動し、顕微鏡のフォーカスを調整するために水平方向および垂直方向の調整を使用しています。 </li><li>所望の温度（20℃）と録音時間（少なくとも30秒）を設定します。 </li><li>指定した時間のためにリポソーム粒子の複数の画像フレームを取得するために録音ボタンを押してください。それは各粒子の運動を追跡するようにヒストグラムの直径リポソームサイズに対応するピークを分析します。 </li></ol> 6。代表的な結果押出法を概説する方式では、pである図1に憤慨した。最適な結果を得るために、30nmの直径を有するリポソームの調製は、100 nmの〜500 PSIと直径の高圧を必要とする125 psiの圧力が急速にフィルタ率を達成する必要があります。 400nmの直径については、〜25 psiの低気圧は、小胞が細長いと大きく、均一なリポソームを形成することができ低速フィルタ率を達成することをお勧めします。我々は、一貫したサブミクロンサイズのベシクルを製造するための最適な圧力を決定するために一連の実験を行った。我々は圧力と同様に押出孔30の大きさ、100、400 nmのポリカーボネートフィルターを通過する数を変化させ、それぞれ所望の大きさのために適切な圧力を発見しました。 30nmの細孔には、500 psiの下の圧力が伸び、その結果より大きな小胞の大きさを引き起こして、流量を減らすことができます。 100nmの細孔については、定常流は125 psiで達成された。 400nmの細孔については、低圧（25 PSI）は小胞が大きい小胞の中に細長いすることができますizes。ゆっくりと滴下ろ過流量が大きく、サブミクロンベシクル13を作成するには最適です。 我々は、3つの異なる直径の大きさ、すなわち30、100と400nmを通して押し出さリポソームのサイズを決定するためにDLSを行った。 DLSは、粒径を決定するために散乱光を収集し、確立された方法です。 5 500 psiでポリカーボネート30nmの膜を介して我々2 mMの押し出し水和リポソームフィルター細孔を通過し、フィルター細孔を介して5を通過し、25 psiで400nmのポリカーボネート膜125 psiで100nmのポリカーボネート膜2フィルター細孔を通過します。リポソームおよび30のDLSによって測定の直径は、100〜400 nmの細孔径は66±28、138±18および360±25 nmの（ 図2）であった。それは47の直径は±16 nmを記録し、 図2に示すように50nmのポリスチレンビーズの懸濁液は、校正標準として使用されていました。パーセントpolydispersityは、リポソームのサイズ内で重複がないことを示しています。これは、この楽器は大きな粒子12の方へ持って知られているバイアスに起因するDLS解析を使用している場合が30nm以上の直径を観察するのが一般的です。大小の粒子からの散乱光強度は、サスペンション12のリポソームを解決する1つの検出方法から同時に収集し、このように難しくしています。この楽器の限界にもかかわらず、検量線に近い直線的な相関を示しています。 NTAは、粒子の屈折率や密度の独立した液体培地中での拡散の直接観察から、各粒子のサイズを測定する新しい技術です。この高分解能技術はDLSでリポソームの測定を補完するために使用することができます。 NTAは、キャリブレーションのために使用された95の直径は±48および356±51 nmであり、2つの100 nmと400 nmのポリスチレン溶液を記録した。は30nmと100nmの脂質溶液は、より多くのお試し版を持っていることが観察された<html> DLSに耕地の直径の相対的な29の平均サイズは±14、95±17および359±73 nmの生産、 図3に示すように。 1000nmの - NTAは、その感度は50の粒子を測定することができますので、微細な粒子を定量化するための、より一般的な特性評価技術のかもしれません。検量線は、記録されたNTAの直径対ポリカーボネート膜の細孔間の線形相関を示しています。 <table border="1"><tbody><tr><td> リポソームサイズ </td><td> 検知閾値 </td><td> 予想される最小の粒径（nm）の </td></tr><tr><td> 30nmの</td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100nmの</td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400nmの</td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> 表1。Nanosightパラメータ。 ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; 圧力と窒素の流れが異なるリポソームの直径の均一性を制御する方法を記述する押出法の図1のフローチャート。リポソーム水和後、サイズの異なる単層小胞は、異なる圧力で異なるポリカーボネートメンブレンフィルター孔を通って押し出されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> 図2：押出後に定量的なリポソームのサイズを記述した動的光散乱（DLS）のデータ。 （1）バーグラフは3リポソーム試料の直径を記述するために示されています。 50nmのポリスチレン（PS）ビーズの校正標準を基準として使用されていました。平均的なリポソームの直径は、各サンプルのバーの上に示されています。 x軸は、ソリューションが押し出された細孔径を示しています。 y軸は、DLSによって記録された直径を示しています。が、30 nmおよび100 nmのサイズの記録大きい400nmの大きさが若干低いのサイズを記録しながら、edは、その細孔径よりも高い値を、検量線（b）は、x軸はポリカーボネート膜の細孔のサイズを表し、y軸は説明して近くに線形相関を示していますDLSでリポソームの直径を記録した。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> 押出成形後にリポソームのサイズを記述する図3。ナノ粒子トラッキング解析（NTA）のデータ。 （a）の棒グラフは、各リポソーム試料の直径を表しています。 x軸は、ソリューションが押し出された細孔径を示しています。 y軸はNTAによって記録されたサイズの直径を示しています。平均的なリポソームの直径は、それぞれのサンプルの上にラベルが付けられています。 （b）のNTAのキャリブレーション曲線が記録された直径対フィルター膜の孔径との間のDLSの較正曲線よりも直線的な相関を示しています。 x軸はポリカーボネート膜の細孔サイズを説明します。 y軸はNTAによって記録されたリポソームの直径を示しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> 図4。押し出し、続いて各リポソームサイズ（500μM）を示すネガティブ染色透過型電子顕微鏡（TEM）画像。炭素Formvarメッシュグリッドは負の水に1％酢酸ウラニルは34000倍の倍率で乾燥し、イメージングの前にサンプルを染色するために使用されたサンプルの染色、前に退院した。サイズは30、100、400 nmは互いに明確に区別されます。倍率は25000倍に設定されています。スケールバーは0.5μmを表しています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> 図5。タイムコース実験を3リポソームのサイズで行われた。動的光散乱（DLS）は、それぞれのリポソーム溶液直後に押し出しを測定した。すべてのリポソーム溶液は4に格納されていました°Cで一晩。その直径は、一晩インキュベーションした後DLSによって記録された。変更なしにはほとんどが16時間のインキュベーション期間の後に観察された。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

Avestin Liposofast LF-50押出機を用いて、我々は小型、合成リポソームは圧力制御システムを介して作成されている方法を紹介しました。多層小胞が小さいナノ粒子の製造につながる可能性がありリポソーム水和、以下の自発的に形成することに注意することが重要です。これらの小さな多層小胞は、必然的に大規模なフィルター細孔によって生成されたユニラメラベシクル溶液中で不均一性を引き起こし、大規模なポリカーボネート膜の孔径を通って流れます。したがって、それは大きな細孔サイズは均一性を増加し、脂質の大きな小胞に融合し、細長いするのに十分な時間を与えるために（400 nmの直径は、前述のように毛穴のためにすなわち25 psi）で使用されている場合の窒素フローの圧力を軽減することを推奨します。ソリューションを提供します。 &lt;100 nmであり、高圧（上記のように30〜100 nmのすなわち400-500 psi）の直径を有するリポソームの脂質捕集効率を高めるために迅速な押し出しに適用されると大きさの均一性。 いくつかの注目すべきステップは、正確で再現性の高いリポソーム製剤を確保する...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 02432-25ML </td><td> 95％の安定剤</td></tr><tr><td>ハイグレードのメタノール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50押出機</td><td> Avestin株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リン脂質</td><td>アヴァンティ極性脂質</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート孔</td><td> Avestin株式会社</td><td></td><td>直径25mmの</td></tr><tr><td>ドレインディスクPE </td><td> Avestin株式会社</td><td> 230600 </td><td>直径25mmの</td></tr></tbody></table>

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

リポソームは人工的に広く、モニター薬物送達4,5、およびカプセル化4タンパク質-タンパク質及びタンパク質-脂質相互作用の3を勉強するためのプラットフォームを模倣して細胞膜として使用されている天然および合成のリン脂質からなる小胞を用意されています。リン脂質は当然ミセルから自分自身を区別し、湾曲した脂質二重層を作成します。6リポソームは、伝統的に二重層のサイズと数、すなわち大規模単層小胞（LUVs）、小型単層小胞（SUV）やマルチラメラベシクル（MLV）は7に分類されています。特に、さまざまなサイズの均一なリポソームの調製は、細胞シグナリング、エンドおよびエキソサイトーシス、膜融合、およびタンパク質輸送8に重要な役割を果たしている膜の曲率を研究するために重要である。 400 - いくつかのグループは、タンパク質は、膜の曲率を伴うため、径のリポソームを調製プロセスが&lt;100を変調するために使用されるかを分析細胞の機能3の行動を研究するためにnmである。その他の関心の9薬剤を運ぶ提供する媒体としてリポソームを勉強して、リポソーム薬物カプセル化に焦点を当てています。リポソーム形成9の間に報告された薬剤のカプセル化を達成することができます。私たちの押出工程はふたつの理由からカプセル化された薬に影響を及ぼしてはならない、すなわち、（1）薬物のカプセル化は、このステップの前に達成されるべきである、（2）リポソームは安全に水性コアに薬剤を運ぶ、その自然の生物物理学的安定性を保持する必要があります。これらの研究目標は、さらに安定したサブミクロンの脂質小胞を設計するために最適化された方法の必要性を示唆している。 それにもかかわらず、現在のリポソーム調製技術（超音波10、凍結と融解10、沈殿）が非常に湾曲した表面とリポソームの調製を許可していない（すなわち、直径&lt;100 nm）で高い一貫性と効率10,5と、生物物理学を制限するemergiの研究膜曲率センサーのngのフィールド。ここで、我々は生物学的に関連したリポソームの様々な堅牢な調製法を提示する。 ガスタイトシリンジとポリカーボネート膜10,5を使用して手動で押し出しが一般的ですが、適用されたマニュアルの圧力の変動に起因するために孔径&lt;100 nmを使用する場合は、異質性がしばしば観察される。我々は、直径30〜400nmの間の範囲の合成リポソームを調製するための一定の圧力制御の押出装置を採用しています。動的光散乱（DLS）10、電子顕微鏡11とナノ粒子トラッキング解析（NTA）12は、我々のプロトコルで説明したように校正標準として使用される市販のポリスチレン（PS）ビーズで、リポソームのサイズを定量化するために使用された。近くに線形相関が満たされている私たちの圧力制御リポソーム製剤の高忠実度を示す、自営業細孔の大きさと実験的に決定したリポソームの間に観察されたHOD。さらに、私たちは、この脂質ベシクルの調製法は、様々なリポソームサイズの独立した、一般的に適用可能であることが示されている。最後に、我々はまた、これらの準備されたリポソームは、最大16時間にわたって安定したことを時​​間経過の研究で実証されている。代表的なナノサイズのリポソーム調製プロトコルは以下に示されています。

このプロトコルは、同質性の高いサブミクロンサイズの脂質小胞を調製するための押出法を説明します。このメソッドは、リポソーム調製のための制御された窒素の流量と圧力制御システムを使用しています。脂質の準備<sup&gt; 1,2</sup&gt;、リポソーム押し出し、サイズの特性は、本明細書に表示されます。

リポソームは、天然および合成のリン脂質から構成される人工的に調製された小胞であり、細胞膜を模倣したプラットフォームとして広く利用されています。

本実験の目的は、生物学的に重要な脂質小胞の堅牢な調製方法を提示することである。これは、リン脂質をガラスバイアルに混合・移送し、水性バッファーで水和させることで多層小胞（MLV）懸濁液を作成することにより達成される。第2段階として、凍結融解法を行い、これにより多層小胞から単層小胞（ULV）を生成させる。次に、決定した最適圧を用いてリポソーム懸濁液をエクストルーダーに通し、目的のサイズの均質な脂質小胞を作製します。動的光散乱法およびナノ粒子トラッキング解析に基づき、一貫したサブミクロンサイズの小胞が得られるという結果が得られました。超音波処理や沈降法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、最適に決定された窒素流量を持つ圧力制御システムを使用することで、効率的な脂質小胞サイズの調製が可能である点にあります。この手順を開始するために、テフロンライナー付きキャップを備えた20 milliliterのガラスバイアルを用意し、コンタミネーションを防ぐため、使用前にすべてのガラス器具とシリンジをクロロホルムで洗浄します。250 microliterの気密ガラスシリンジを用いて、試薬グレードのクロロホルム100 microlitersをガラスバイアルに移します。次に、100 microliterの気密ガラスシリンジを用いて、同じガラスバイアルに試薬グレードのメタノール30 microlitersを加えます。10 mg/mLのPop Cを216 µL、10 mg/mLのPop Eを42 µL、および11 mg/mLのコレステロール溶液を20 µL、20 mLのガラスバイアルに移し、2 mMのPop C/Pop E/コレステロール脂質溶液を調製します。バイアルの底に脂質の薄膜が観察されるまで、低流量のアルゴンまたは窒素ガスを用いて有機溶媒を蒸発させます。蓋を外した状態のガラスバイアルを真空デシケーターに入れ、少なくとも30分間静置します。残留溶媒を除去するため、あらかじめ0.2 micronフィルターでろ過したバッファーを2 mLガラスバイアルに移し、脂質を水和させます。混合物を4 °Cで一晩インキュベートし、リポソームサイズが30 to 100 nmの場合は48時間以内に使用してください。リポソーム懸濁液を液体窒素中で15秒間凍結させます。次に、ヒーティングブロックを用いて42 °Cで約3分間、リポソーム懸濁液を融解させます。この凍結融解プロセスを合計5サイクル繰り返します。凍結後に融解させることで、マルチラメラベシクルから単層ラメラベシクルが生成され、エクストルージョン時の脂質トラップ効率が向上します。次に、Avastinの指示に従い、Lipo So Fast LF 50エクストルーダーを慎重に組み立てて、押し出しの準備をします。窒素の漏れは所望の流速に影響するため、正し

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バイオエンジニアリング（生体工学）

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私たちは、原子間力顕微鏡と力分光法を使用して、支持脂質二重膜の調製とその特性評価のためのプロトコルを記述します。...

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

単一鎖両親媒性分子を含むリポソーム、特に脂肪酸、一本鎖両親媒性分子のユニークな化学的性質によるこれらの含まれている diacylphospholipids...

準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

固相担、タンパク質-無料、ダブル リン脂質二重膜 (DLBM) 複雑で動的な脂質ナノチューブ ネットワークに変換することができます、小胞体の 2 D のボトムアップ...

自発的な形成と小胞体のボトムアップ モデル人工脂質ナノチューブ ネットワークの転位

本研究では、ナノリポソーム調製の薄い脂質膜法を用いた古典的な水和を説明し、続いてナノ粒子の特性を説明する。47...

生体活性親水性球状タンパク質の捕捉に対するナノリポソームの調製と特性解析

本論文では、脂質膜の中性子スピンエコー(NSE)研究におけるサンプル調製、データ削減、データ解析のプロトコルについて述べる。脂質の重水素標識は、重要な生物学的プロセスが起こるメソスコピック長および時間スケール上の異なる膜動力学へのアクセスを可能にする。...

脂質膜動態と膜タンパク質相互作用に対するユニークなプローブとしての中性子スピンエコー分光法

このプロトコルは、ユニ脂質および多脂質小胞、支持脂質二重層、および懸濁された脂質二重層を模倣する細胞の形成を記述する。これらの in vitro モデルは、様々な脂質タイプを組み込むために適応することができ、様々な分子および高分子相互作用を調査するために使用することができる。...

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

ここでは、ナノバー支持脂質二重層システムが開発され、 in...

in vitroでの膜曲率感知タンパク質の研究のためのナノバー支持脂質二重層システム

この初心者向けガイドでは、液滴移動法による巨大単層小胞(GUV)の調製に関する一般的なプロトコルを紹介し、重要なステップについて説明し、合成生物学やマイクロロボティクスなどのさまざまな用途に必要な調整に役立つ洞察を提供します。...

液滴移動法による巨大単層小胞の確実な作製

グラミキシジンAドープされた液滴界面二重層を組み立て、電気刺激し、解析する実験プロトコルを提示します。脂質-タンパク質の構造-機能関係は、膜面積、イオンフラックス、単一チャネル伝導の変化を測定し、これらの応答を電気シナプスに着想を得た膜モデルにおける可塑性様のイオン伝導変化と関連付けることで定量化されます。...

液滴界面二重層を用いた脂質-タンパク質膜構造-機能の特徴解析

学ぶ、一定圧力制御押出法によるナノサイズ脂質小胞の調製法。凍結融解サイクルと最適窒素圧を用いて、均一なサブミクロンリポソームを作製する。動的光散乱とナノ粒子追跡分析でサイズを評価し、ソニケーション法より優れた均一性を実現する。

ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

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