ナノサイズの脂質小胞の調製のための一定の圧力制御押出法

次の実験の全体的な目標は、生物学的に関連性のある脂質小胞の堅牢な調製方法を提示することです。これは、リン脂質を混合してガラスバイアルに移し、水性バッファーで水和してマルチラメラSLE懸濁液を作成することで達成されます。第2のステップとして、凍結融解法が行われ、その結果、マルチラメラベシクルからエラベシクルが生成されます。

次に、リポソーム懸濁液を、所望のサイズの均質な脂質小胞を生成するために、決定された最適な圧力を用いて押出機に通す。動的光散乱とナノ粒子追跡分析に基づいて、一貫したサブミクロン小胞サイズを示す結果が得られました。超音波処理や沈降のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、この方法が効率的な脂質小胞サイズの調製のために最適に決定された窒素流量の圧力制御システムを使用することです。

この手順を開始するには、テフロンで裏打ちされたキャップ付きの20ミリリットルのガラスバイアルを取り出し、使用前にすべてのガラス器具と注射器をクロロホルムで洗浄して汚染を防ぎます。.250マイクロリットルの気密ガラスシリンジを使用して、100マイクロリットルの試薬グレードのクロロホルムをガラスバイアルに移します。100マイクロリットルの気密ガラスシリンジを使用して、同じガラスバイアルに30マイクロリットルの試薬グレードのメタノールを加えます。

リットルあたり10ミリグラムのポップCの216マイクロリットル、1ミリリットルあたり10ミリグラムのポップC42マイクロリットルを移すことにより、2ミリモルのポップCケシコレステロール脂質溶液を準備します。Pop eと1ミリリットルあたり11ミリグラムの20マイクロリットル。20ミリリットルのガラスバイアルへのコレステロール溶液は、脂質の薄膜がバイアルの底に観察されるまで、低速フローのアルゴンまたは窒素ガスを使用して有機溶媒を蒸発させ、キャップされていないガラスバイアルを真空乾燥させて少なくとも30分間置く。

残留溶媒を除去するには、0.2ミクロンのフィルターを通過した2ミリリットルの緩衝液をガラスバイアルに移し、脂質を水和させます。混合物を摂氏4度で一晩インキュベートし、30〜100ナノメートルのリポソームサイズで48時間以内に使用します。リポソーム懸濁液を液体窒素中に15秒間放出します。

次に、42°CのSIUで加熱ブロックを使用してリポソーム懸濁液を約3分間解凍します。凍結融解プロセスを合計5サイクル繰り返します。凍結して解凍すると、マルチラメラ小胞からElla Lesが生成され、押出成形時の脂質捕捉効率が向上します。

次に、アバスチンの指示に従ってリポを慎重に組み立てて押し出しの準備をします。LF 50押出機の正しい組み立ては、望ましい流量に影響を与える窒素漏れを防ぐために重要です。成功を確実にするために、次の手順を慎重に実行してください。

気密シールを製作するため。大きな穴のサポートスクリーンをサポートフィルターベースに配置し、続いて円形の中央皿、1つのドレンディスク、および1つのポリカーボネートメンブレンを配置します。小さな黒いOリングをメンブレンの上に置き、サポートフィルターベースに固定します。

対応する4つの穴に4本のネジを締めて、上部フィルター押出機を取り付けます。フィルター押出機ユニットを大型押出機バレルの下に組み立てます。リポソーム溶液を押出バレルの上のシリンダーバレルに加えます。

大きな円形のOリング、狭いキャップ、大きな円形のOリング、円形のキャップを取り付けます。ガスレギュレーターを押出機のバレル上部に取り付け、圧力逃がし弁を含むすべてのバルブを閉じて空気漏れを防ぎます。20ミリリットルのガラスバイアルまたは50ミリリットルの三角フラスコを押出機フィルターユニットの下に置きます。

レギュレーターには安全弁が接続されており、圧力が600PSを超えると解放されます。窒素ガスをONにし、エクストルーダーに接続されているガスバルブを開けます。窒素圧を400ナノメートルのリポソームで25 PSIに、100ナノメートルのリポソームで125 PSIに、30ナノメートルのリポソームで400〜500 PSIに上げます。リポソーム懸濁液が窒素に押されながら容器に排出されるまで観察してください。

液体が観察されなくなるまで窒素を流し続けます。押出機フィルターをガラスファイルに渡してDLS分析を実行します。まず、リン酸緩衝生理食塩水またはPBSで希釈した20マイクロモルのリポソーム溶液を50マイクロリットル調製します。

次に、電源とランプの電源をオンにします。dynaproソフトウェアを開くに進みます。ソフトウェアをアルゴリズムモデルに設定して、目的のサイズでリポソームを検出します。

リポソームサンプルの14マイクロリットルをハードウェアピペットに接続し、石英veteに接続し、セルホルダーに挿入した後、約20〜30の買収に続いて開始を押し、停止を押します。ヒストグラムに記録された平均リポソーム直径ピークを解析します。ナノ粒子追跡分析は、PBSに可溶化された500マイクロリットルの0.1マイクロモルリポソーム溶液の調製から始まり、サンプルコンパートメントを水とエタノールですすいでください。

次に、糸くずの出ないペーパータオルでサンプルコンパートメントを乾かします。レーザー電源をオンにすると、コンピューターは300マイクロリットルの0.1モルリポソーム溶液をサンプルコンパートメントに供給します。温度制御およびナノ粒子追跡分析ソフトウェアを開きます。

キャプチャボタンを押してレーザーをオンにします。水平および垂直調整を使用して、ステージを移動し、顕微鏡の焦点を調整します。希望の温度と記録時間を設定します。

記録ボタンを押すと、指定した時間、リポソーム粒子の複数の画像フレームが撮影されます。ヒストグラム上の直径リポソームサイズに対応するピークを解析し、各粒子の動きを追跡します。DLSは、散乱光を収集して粒子径を決定する確立された方法であり、リポソームサイズを決定するために実施されました。

水和リポソームは、書面によるプロトコルに記載されているように、さまざまなサイズと圧力でポリカーボネート膜を介して押し出されました。DLSで測定した30ナノメートルの細孔径のリポソームの直径は、66±28ナノメートルであった。100ナノメートルの孔径は138±80ナノメートル、400ナノメートルの孔径は360±25ナノメートルでした。

50ナノメートルの研磨されたアイリーンビーズの懸濁液をキャリブレーション標準として使用し、47±16ナノメートルの直径を記録しました。ポリ分散率の割合は、リポソームサイズ内に重複がないことを示しています。DLS分析を使用すると、この装置がより大きな粒子に偏っていることが知られているため、30ナノメートルを超える直径を観察するのが一般的です。

この計器的な制限にもかかわらず、検量線は非線形相関を表します。ナノ粒子追跡分析は、粒子の屈折率や密度に関係なく、液体媒体中の拡散を直接観察して各粒子のサイズを測定する新しい技術です。この高分解能技術は、DLSによるリポソームの測定を補完するために使用でき、NTAが記録した直径95±48ナノメートルと356±51ナノメートルの直径を、2つの100ナノメートルと400ナノメートルのポリスチレン溶液で較正に使用しました。

脂質溶液は、DLSと比較してより同等の直径を持ち、30ナノメートルの細孔サイズで29プラスマイナス14ナノメートル、100ナノメートルの細孔サイズで95プラスマイナス17ナノメートル、400ナノメートルの細孔サイズで359プラスマイナス73ナノメートルの平均サイズを生成します。NTAは、その感度により50〜1000ナノメートルの粒子の測定が可能であるため、微視的な粒子を定量化するためのより一般的な特性評価手法である可能性があります。検量線は、ポリカーボネート膜の一時停止と記録されたNTA直径の負の染色透過との間の線形相関を示しています 電子顕微鏡画像は、押出サイズ3、100、400ナノメートルに続く各リポソームサイズが互いに明確に異なることを示しています。

倍率は25, 000倍に設定され、スケールバーは0.5ミクロンを表しています。3つのリポソームサイズで時間経過実験を行いました。DLSは、押出し直後に各リポソーム溶液について測定しました。

すべてのリポソーム溶液を摂氏4度で一晩保存しました。それらの直径は、一晩のインキュベーション後にDLSによって再度記録されました。60時間のインキュベーション期間後、ほとんどまたはまったく変化が観察されませんでした この手順を試みる際には、押出フィルターを複数回通過すると、Vesco溶液の均一性が向上することを覚えておくことが重要です。

また、クロロホルムからのポリプロピレンチューブによる浸出による汚染を防ぐために、サンプル調製にはガラスバイアルとシリンジを使用することを忘れないでください。