微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

本実験の目的は、接着性細胞を多様なCombinator微小環境に並行してさらすことで、異なる微小環境が細胞機能に及ぼす影響を測定することです。この目的を達成するため、まず微小環境タンパク質の混合物の吸着をサポートするプリント基板を作製します。次に、微小環境タンパク質のマスタープレートを調製し、クイルまたはキャピラリーピン・マイクロアレイ・プリンティングロボットを用いてMEアレイをプリントします。

次に、微小環境タンパク質のマスタープレートを調製します。続いて、細胞数を制限するオプションを用いて、MEアレイ上に接着細胞を培養します。得られた結果から、免疫蛍光分析に基づき、分化や増殖などの細胞機能に対する異なる微小環境の影響を明らかにします。

この手法のアイデアは、ヒト記憶幹細胞の運命決定に対する組織微小環境の影響を定量化したいと考えた際に得られましたが、in vivoでの検討は不可能であることに気づきました。開発された現在、この手法は細胞生物学、研究、および創薬において多くの応用が可能です。PDMSは安価で調製が容易であり、プリントもしやすいため、より硬い組織を模倣する基質として使用されます。

しかし、PDMSの疎水性により、PDMSを用いた作製を行う際、一部の細胞株との適合性が低くなる場合があります。ラテックスはPDMSの重合を阻害するため、ノンラテックスの手袋を使用してください。まず、使い捨てプラスチックカップにSylgard 184シリコーンエラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で合わせ、木製またはプラスチック製の舌圧子で激しく混ぜ合わせます。

次に、室温の真空ベルジャー内で混合物を30分間脱気します。続いて、スピンコーターの駆動式真空チャックの上に標準的な顕微鏡スライドガラスを中央に配置し、混合したエラストマーポリマー0.5 millilitersをスライド表面の中央に滴下し、6,000 RPMで60秒間スピンコートします。PDMSをコーティングしたスライドガラスを70 °Cで4時間から一晩硬化させます。

スライドは室温で気密保存し、数ヶ月間保管することができます。PAは、PAの範囲内のより柔らかい組織を模倣できるハイドロゲルであり、細胞は細胞接着をサポートするタンパク質が存在するスポットにのみ付着します。まず、水酸化ナトリウムでスライドをエッチングすることから始めてください。

スライドを80 °Cに設定したヒートブロック上に置きます。各スライドに0.1 Nの水酸化ナトリウムを1 mL滴下します。PAを確実に成功させるため、スライド表面全体を必ず覆ってください。

水酸化ナトリウムを蒸発させ、白い膜を形成させます。表面が完全に覆われていない場合は、この工程を繰り返してください。必要に応じて、スライドは室温で数日間保存可能です。

次に、ドラフトチャンバー内でスライドをPESでコーティングします。15 milliliterのディッシュにスライドを入れます。水酸化ナトリウムでエッチングした各スライドに、300 microlitersのPESを加えます。

APESを水酸化ナトリウム処理したスライドガラスと正確に5分間反応させます。5分を超えないようにしてください。スライドガラスの両面を脱イオン水で2〜3回十分に洗浄し、APESを取り除きます。

そうしないと、次のステップでスライド上に褐色の沈殿物が形成されます。ここで、スライド表面からすべての溶液を各ディッシュへ吸引します。PBSで調製した0.5% glutaraldehydeを25 milliliters加えます。

スライドを暗所に置き、30分間待機します。30分後、スライド表面からグルタルアルデヒド溶液をすべて吸引します。その後、吸収性のある低リンターペーパーを用いて、スライドを慎重に乾燥させます。

必要に応じて、スライドは室温で一晩保存することが可能です。PA混合液を調製し脱気した後、重合速度を抑えるために氷上に置きます。氷上の各混合液を用いてスライドを調製する直前に、過硫酸アンモニウムとTEMEDを添加し、ピペットで5〜10秒間トリチュレーション（攪拌）します。

次に、PA混合液をスライド表面にピペットで分注します。PAの量は、必要とされるゲルの硬度に応じて調整します。その後、気泡の形成を防ぐため、圧力をかけないように注意しながら、PAの上にガラスカバースリップを載せます。

PAゲルを2時間重合させた後、脱イオン水中でカバースリップを取り除きます。PAゲルのスライドを大型のコプランジャーに入れ、一晩水で洗浄します。翌日、未反応のアクリルアミドを除去するため、PAゲルが完全に硬化するまでスライドを乾燥させます。

その後、スライドは密閉されたスライドボックスに入れ、4 °Cで1ヶ月間保存できます。まず、2チャンバー付スライドのプリントアレイを囲むようにプラスチックチャンバーを装着します。チャンバーを取り外し、カミソリで半分に切断します。

1 mLのピペットチップを使用して、チャンバーの端にアクアリウム用シリコンを薄く塗布し、Emmyアレイの表面に押し付けます。シリコンがアレイの構造部分に触れないように注意してください。培養ウェルをEmmyアレイにしっかりと密着させることが極めて重要です。密着が不十分なウェルからは培地が漏れ出し、広範囲にわたる細胞死を招く可能性があるためです。

PDMSコーティングスライドの場合、ゲルの種類に関わらず、1%onic F 108水溶液中で真空状態で15分間インキュベートしてスライドをブロッキングし、その後、抗生物質を含む細胞培養液で3回（1回につき5分間）アレイを洗浄します。これにより、PAゲルの場合に細胞に毒性を示す可能性がある未反応モノマーを除去します。3回目の洗浄後、ゲルの再水和のために培養液中でさらに30分間インキュベートします。

次に、4～5個のアレイを15 cmの滅菌ペトリ皿に入れます。皿に、目的の細胞を必要な濃度で調製した最終培地量の半分を加えます。MEアレイは、使用する細胞種の維持に適したインキュベーター内に配置してください。

顕微鏡下で15〜20分ごとに観察し、細胞がプリントされた構造体に均一に接着しているかを確認します。MEアレイを軽く揺すり、接着した細胞と浮遊している細胞を区別してください。接着にかかる時間は異なりますが、PAコード化されたMEアレイでは通常2時間以内に完了します。

細胞の接着が飽和したか、または制限時間に達した後、未結合の細胞を吸引し、PDMSコーティング済みのMEアレイ上のディッシュを最終容量まで満たします。培地をすべて除去すると細胞が死滅するため、これらのスライドでのすべての培地交換において、まず培地容量の半分を順次交換し、その後ディッシュを最終容量まで満たしてください。

通常の培地交換を行うことで、培養を数日間にわたって継続させることができます。パラホルムアルデヒドやメタノール・アセトンなどの一般的な固定液は、Emmyアレイシステムと互換性があります。PDMSコーティングされたMEアレイを染色する場合でも、常に湿った状態を維持させる必要があることに注意してください。

続いて、半分容量置換法を用いて、染色したMEアレイのスライドを調製します。カミソリの刃でチャンバーを取り除き、フローラを用いてカバーガラスを封入します。Gタンパク質は、クイルピン上の正方形チップシリコンピンを用いて、プリントされたPDMSコード付きMEアレイ上に配置されました。

マイクロアレイプリントロボットによる様々なタンパク質のデポジションは、抗体を用いた免疫蛍光法により検証されました。マスタープレート内のタンパク質溶液の希釈倍率は、プリント基材表面にデポジションされた量と相関しており、プリントされた各スポットに細胞が明確なパターン状に付着しました。同様に、40,000パススケールでEmmyアレイをプリントした場合にも、同じ明確な細胞付着パターンが認められました。

PAゲル上の2つの微小環境タンパク質は、ヒト多能性乳腺上皮前駆細胞株において、濃度依存的なケラチン発現プロファイルを誘導した。ケラチン8信号に対するケラチン14信号の対数比は、信号の変動と再現性を示している。24時間の培養後、未結合の細胞を洗浄して除去し、12個のmeアレイを解析した。

タイプIコラーゲンとリコンビナントヒトp-カドヘリンの異なる希釈濃度がケラチンの発現に変化をもたらすかどうかを判断するために、標準的な統計解析を用いました。当初、細胞を付着させた直後の特性においては、平均値からの変動は見られませんでした。しかし、24時間後には、高濃度のタイプIコラーゲンによってケラチン8の発現が有意に上昇しました。

一方で、ここでの高濃度のPCAは、強いkeratin 14シグナルを誘発しました。この知見は、二能性メモリー前駆細胞に関する先行報告と一致しています。これらの細胞と微小環境の相互作用は動的かつ相補的であるため、細胞自体がプリントされた微小環境の組成を変化させることがあります。

したがって、プリントした微小環境による急性影響を理解するためには、本手順に従った後の曝露時間は48時間を超えないようにしてください。蛍光または化学的に測定可能なあらゆる理論的プロセスを微小環境の関数として評価することで、「異なる微小環境が癌細胞株における薬物反応をどのように変化させるか」といった追加の疑問に答えることができます。これは、アポトーシスと増殖の変化によって測定されます。

あるいは、微小環境がいかにして前駆細胞の分化を変化させるかについて。