Name: 微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学ぶ微小環境マイクロアレイ（MEArrays）の作製法と細胞接着・機能解析への応用。マイクロアレイ印刷ロボットを用いて多様な微小環境を作成し、接着細胞の分化や増殖への影響を免疫蛍光法で評価する。

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<ol><li>Bissell, M. J., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Context%2C+tissue+plasticity%2C+and+cancer%3A+are+tumor+stem+cells+also+regulated+by+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment.</a> Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>McBeath, R., Pirone, D. M., Nelson, C. M., Bhadriraju, K., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shape%2C+cytoskeletal+tension%2C+and+RhoA+regulate+stem+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment.</a> Dev. Cell. 6, 483-495 (2004).</li>
<li>LaBarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decsions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decsions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integrative Biology. 1, 70-79 (2009).</li>
<li>Kim, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+Methods+for+Polymers+in+Cell+and+Tissue+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Patterning Methods for Polymers in Cell and Tissue Engineering.</a> Annals of biomedical engineering. , (2012).</li>
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<li>Soen, Y., Mori, A., Palmer, T. D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+regulation+of+human+neural+precursor+cell+differentiation+using+arrays+of+signaling+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring the regulation of human neural precursor cell differentiation using arrays of signaling microenvironments.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 37(2006).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここに提示されMEArrayの方法は、細胞と組み合わせ微小環境との相互作用4の機能解析を可能にします。 MEArray分析は、基本的な微細化技術、細胞生物学、および多くのマルチ施設で利用可能なマイクロアレイプリンティングロボットや分析装置の使用を兼ね備えています。無血清培地製剤は添付ファイルを向上させることができますBSAまたは&lt;1％の血清を含むようにいくつかのケースで調整する必要があるかもしれませんがMEArray画面は、ほとんどの接着細胞タイプと互換性があります。このメソッドは、与えられた細胞機能を解析するための試薬の利用可能性によって制限されています。蛍光ベースのアッセイは、アレイベースのほとんどのイメージングシステムと互換性がありますが、比色アッセイはまた、うまく機能することができます。この方法の他のバリエーションは、複雑な微小環境が機能的に個々の微小環境の分子およびその組み合わせは、細胞機能の様々な遊びどのような役割を明らかにするために解剖することができる一般的な考え方が存在し、サポートtions 8,9。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>ガラスは、25ミリメートル×75ミリメートルをスライド</td><td> VWR </td><td> 48311-600 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ（その1）24ミリメートル×50ミリメートル</td><td> VWR </td><td> 48393-241 </td><td></td></tr><tr><td>染色皿（またはCOPLAN瓶） </td><td> VWR </td><td> 25461-003 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿（15センチ） </td><td> BDファルコン</td><td> 351058 </td><td></td></tr><tr><td>のNaOH（1.0N） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S2567 </td><td></td></tr><tr><td> APES（&gt; 98％（3 - アミノプロピル）トリエトキシシラン） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A3648 </td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G7651 </td><td>水中の50％ </td></tr><tr><td> APS（&gt; 98％過硫酸アンモニウム） </td><td> Sigmaアルドリッチ</td><td> A3678 </td><td> ddH 2 Oで10パーセントの作業溶液を調製</td></tr><tr><td> TEMED（N、N、N &#39;、N&#39;-テトラメチルエチレンジアミン） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9281 </td><td></td></tr><tr><td>アクリルアミド（40％） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4058 </td><td></td></tr><tr><td>ビスアクリルアミド（2％w / v）の</td><td>フィッシャーBioReagents </td><td> BP1404-250 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45μmのシリンジフィルター4mmのナイロン</td><td>ナルゲン</td><td> 176-0045 </td><td></td></tr><tr><td> FITC </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F4274 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS（ポリジメチルシロキサン） </td><td>ダウコーニング</td><td> 3097358-1004 </td><td>エルズワース接着剤を介して、シルガード184エラストマーキット</td></tr><tr><td> 2チャンバースライド</td><td> NUNC </td><td> 177380 </td><td></td></tr><tr><td>プルロニックF108 </td><td> BASF </td><td> 30089186 </td><td></td></tr><tr><td> AQUariumシーラント</td><td>ダウコーニング</td><td> DAP 00688 </td><td></td></tr><tr><td> Fluormount-G </td><td>サザンバイオテクノロジー</td><td> 0100から01 </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てのプラスチック製コップ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>舌圧子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製の顕微鏡スライドボックス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>スピンコーター</td><td> WS-400B-6NPP/LITE </td><td> Laurellテクノロジーズ株式会社</td><td></td></tr><tr><td>オーブン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デジタルホットプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 384ウェルプレート</td><td></td><td></td><td>マイクロアレイロボットに適したブランド</td></tr><tr><td>マイクロアレイプリンティングロボット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>逆位相と蛍光顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>軸索マイクロアレイスキャナー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>複数のコンフィギュレーションが存在し</td></tr></tbody></table>

微小環境マイクロアレイの作製と利用（mearrays）

Fabrication and Use of MicroEnvironment microArrays (MEArrays)

細胞とその周囲の微小環境との相互作用が細胞挙動のために機能的な結果をもたらす。単一細胞レベルでは、異なる微小環境は、分化、遊走および増殖表現型を課すことができ、組織レベルでの微小環境は、形態形成および腫瘍形成1のような複雑な処理します。のみならず、内微小環境への影響の細胞および分子細胞内容物をしますが、とても弾力性2、組織の幾何学3を行う。細胞間、ECM-、および-可溶性因子の相互作用の総和として定義されて、物理的な特性に加えて、微小環境は複雑である。組織内の細胞の表現型は、それらのゲノムコンテンツやmicroenviroment持つ組み合わせの相互作用に起因して部分的に部分的に起因している。主要な課題は、独特の行動と微小環境の成分の特定の組み合わせをリンクすることです。 ENT &quot;&gt;ここでは、コンビナトリアル4微小環境との相互作用の細胞ベースの機能的スクリーニングのための微小環境マイクロアレイ（MEArray）プラットフォームを提示します。方法は分子組成と弾性率の同時制御を可能にし、広く利用可能なマイクロアレイの使用を組み合わせと微細技術。MEArray画面では、以下のよう成体前駆細胞などの珍しい種類の細胞の機能研究を容易にアレイあたり10,000細胞、できるだけ少ない必要があります。テクノロジーの限界は、その全体組織微小環境が完全MEArraysに要約されることができないですが、との比較多数の関連微小環境に同じ細胞型の応答は、例えば特定の組織を特徴付けるECMタンパク質のペアの組み合わせは、微小環境の成分が組織特異的機能の表現型を引き出す方法についての洞察を提供します。 MEArraysは、組換えGROの多種多様を使用して印刷することができますwthの因子、サイトカイン、および精製されたECMタンパク質、およびそれらの組み合わせが含まれる。プラットフォームは、特定の試薬の利用可能性によって制限されています。 MEArraysは、時間経過の分析に適しているが、ほとんどの場合、蛍光プローブを用いた測定可能である細胞の機能のエンドポイントの解析に使用されています。例えば、DNA合成、アポトーシス、分化した状態の取得、または特定の遺伝子産物の生産は、一般的に測定されています。簡単に言えば、MEArray実験の基本的な流れは、印刷基層でコーティングスライドを準備し、印刷されるタンパク質のマスタープレートを準備することです。アレイはマイクロアレイロボットで印刷されその後、細胞培養中で成長し、接続を許可され、その後、化学実験のエンドポイントに達した時点で固定されています。従来の顕微鏡やマイクロアレイスキャナーで画像化蛍光または比色アッセイは、関連する分子や細胞の表現型を示す（ 図1）を明らかにするために使用されています。

細胞機能上の微小環境の分子組成の影響についての洞察を得るためのコンビナトリアル機能的スクリーニング方法が記載されている。この方法は、細胞接着および機能解析をサポートしていることを定義したコンビナトリアル微小環境の配列を生成するために、既存のマイクロアレイベースの技術を活用しています。

微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

細胞とその周囲の微小環境との相互作用は、細胞の挙動に機能的な影響を及ぼします。単一細胞レベルでは、...

本実験の目的は、接着性細胞を多様なCombinator微小環境に並行してさらすことで、異なる微小環境が細胞機能に及ぼす影響を測定することです。この目的を達成するため、まず微小環境タンパク質の混合物の吸着をサポートするプリント基板を作製します。次に、微小環境タンパク質のマスタープレートを調製し、クイルまたはキャピラリーピン・マイクロアレイ・プリンティングロボットを用いてMEアレイをプリントします。次に、微小環境タンパク質のマスタープレートを調製します。続いて、細胞数を制限するオプションを用いて、MEアレイ上に接着細胞を培養します。得られた結果から、免疫蛍光分析に基づき、分化や増殖などの細胞機能に対する異なる微小環境の影響を明らかにします。この手法のアイデアは、ヒト記憶幹細胞の運命決定に対する組織微小環境の影響を定量化したいと考えた際に得られましたが、in vivoでの検討は不可能であることに気づきました。開発された現在、この手法は細胞生物学、研究、および創薬において多くの応用が可能です。PDMSは安価で調製が容易であり、プリントもしやすいため、より硬い組織を模倣する基質として使用されます。しかし、PDMSの疎水性により、PDMSを用いた作製を行う際、一部の細胞株との適合性が低くなる場合があります。ラテックスはPDMSの重合を阻害するため、ノンラテックスの手袋を使用してください。まず、使い捨てプラスチックカップにSylgard 184シリコーンエラストマーベースと硬化剤を10:1の比率で合わせ、木製またはプラスチック製の舌圧子で激しく混ぜ合わせます。次に、室温の真空ベルジャー内で混合物を30分間脱気します。続いて、スピンコーターの駆動式真空チャックの上に標準的な顕微鏡スライドガラスを中央に配置し、混合したエラストマーポリマー0.5 millilitersをスライド表面の中央に滴下し、6,000 RPMで60秒間スピンコートします。PDMSをコーティングしたスライドガラスを70 °Cで4時間から一晩硬化させます。スライドは室温で気密保存し、数ヶ月間保管することができます。PAは、PAの範囲内のより柔らかい組織を模倣できるハイドロゲルであり、細胞は細胞接着をサポートするタンパク質が存在するスポットにのみ付着します。まず、水酸化ナトリウムでスライドをエッチングすることから始めてください。スライドを80 °Cに設定したヒートブロック上に置きます。各スライドに0.1 Nの水酸化ナトリウムを1 mL滴下します。PAを確実に成功させるため、スライド表面全体を必ず覆ってください。水酸化ナトリウムを蒸発させ、白い膜を形成させます。表面が完全に覆われていない場合は、この工程を繰り返してください。必要に応じて、スライドは室温で数日間保存可能です。次に、ドラフトチャンバー内でスライドをPESでコーティングします。15 milliliterのディッシュにスライドを入れます。水酸化ナトリウムでエッチングした各スライドに、300 microlitersのPESを加えます。APESを水酸化ナトリウム処理したスライドガラスと正確に5分間反応させます。5分を超えないようにしてください。スライドガラスの両面を脱イオン水で2〜3回十分に洗浄し、APESを取り除きます。そうしないと、次のステップでスライド上に褐色の沈殿物が形成されます。ここで、スライド表面からすべての溶液を各ディッシュへ吸引します。PBSで調製した0.5% glutaraldehydeを25 milliliters加えます。スライドを暗所に置き、30分間待機します。30分後、スライド表面からグルタルアルデヒド溶液をすべて吸引します。その後、吸収性のある低リンターペーパーを用いて、スライドを慎重に乾燥させます。必要に応じて、スライドは室温で一晩保存することが可能です。PA混合液を調製し脱気した後、重合速度を抑えるために氷上に置きます。氷上の各混合液を用いてスライドを調製する直前に、過硫酸アンモニウムとTEMEDを添加し、ピペットで5〜10秒間トリチュレーション（攪拌）します。次に、PA混合液をスライド表面にピペットで分注します。PAの量は、必要とされるゲルの硬度に応じて調整します。その後、気泡の形成を防ぐため、圧力をかけないように注意しながら、PAの上にガラスカバースリップを載せます。PAゲルを2時間重合させた後、脱イオン水中でカバースリップを取り除きます。PAゲルのスライドを大型のコプランジャーに入れ、一晩水で洗浄します。翌日、未反応のアクリルアミドを除去するため、PAゲルが完全に硬化するまでスライドを乾燥させます。その後、スライドは密閉されたスライドボックスに入れ、4 °Cで1ヶ月間保存できます。まず、2チャンバー付スライドのプリントアレイを囲むようにプラスチックチャンバーを装着します。チャンバーを取り外し、カミソリで半分に切断します。1 mLのピペットチップを使用して、チャンバーの端にアクアリウム用シリコンを薄く塗布し、Emmyアレイの表面に押し付けます。シリコンがアレイの構造部分に触れないように注意してください。培養ウェルをEmmyアレイにしっかりと密着させることが極めて重要です。密着が不十分なウェルからは培地が漏れ出し、広範囲にわたる細胞死を招く可能性があるためです。PDMSコーティングスライドの場合、ゲルの種類に関わらず、1%onic F 108水溶液中で真空状態で15分間インキュベートしてスライドをブロッキングし、その後、抗生物質を含む細胞培養液で3回（1回につき5分間）アレイを洗浄します。これにより、PAゲルの場合に細胞に毒性を示す可能性がある未反応モノマーを除去します。3回目の洗浄後、ゲルの再水和のために培養液中でさらに30分間インキュベートします。次に、4～5個のアレイを15 cmの滅菌ペトリ皿に入れます。皿に、目的の細胞を必要な濃度で調製した最終培地量の半分を加えます。MEアレイは、使用する細胞種の維持に適したインキュベーター内に配置してください。顕微鏡下で15〜20分ごとに観察し、細胞がプリントされた構造体に均一に接着しているかを確認します。MEアレイを軽く揺すり、接着した細胞と浮遊している細胞を区別してください。接着にかかる時間は異なりますが、PAコード化されたMEアレイでは通常2時間以内に完了します。細胞の接着が飽和したか、または制限時間に達した後、未結合の細胞を吸引し、PDMSコーティング済みのMEアレイ上のディッシュを最終容量まで満たします。培地をすべて除去すると細胞が死滅するため、これらのスライドでのすべての培地交換において、まず培地容量の半分を順次交換し、その後ディッシュを最終容量まで満たしてください。通常の培地交換を行うことで、培養を数日間にわたって継続させることができます。パラホルムアルデヒドやメタノール・アセトンなどの一般的な固定液は、Emmyアレイシステムと互換性があります。PDMSコーティングされたMEアレイを染色する場合でも、常に湿った状態を維持させる必要があることに注意してください。続いて、半分容量置換法を用いて、染色したMEアレイのスライドを調製します。カミソリの刃でチャンバーを取り除き、フローラを用いてカバーガラスを封入します。Gタンパク質は、クイルピン上の正方形チップシリコンピンを用いて、プリントされたPDMSコード付きMEアレイ上に配置されました。マイクロアレイプリントロボットによる様々なタンパク質のデポジションは、抗体を用いた免疫蛍光法により検証されました。マスタープレート内のタンパク質溶液の希釈倍率は、プリント基材表面にデポジションされた量と相関しており、プリントされた各スポットに細胞が明確なパターン状に付着しました。同様に、40,000パススケールでEmmyアレイをプリントした場合にも、同じ明確な細胞付着パターンが認められました。PAゲル上の2つの微小環境タンパク質は、ヒト多能性乳腺上皮前駆細胞株において、濃度依存的なケラチン発現プロファイルを誘導した。ケラチン8信号に対するケラチン14信号の対数比は、信号の変動と再現性を示している。24時間の培養後、未結合の細胞を洗浄して除去し、12個のmeアレイを解析した。タイプIコラーゲンとリコンビナントヒトp-カドヘリンの異なる希釈濃度がケラチンの発現に変化をもたらすかどうかを判断するために、標準的な統計解析を用いました。当初、細胞を付着させた直後の特性においては、平均値からの変動は見られませんでした。しかし、24時間後には、高濃度のタイプIコラーゲンによってケラチン8の発現が有意に上昇しました。一方で、ここでの高濃度のPCAは、強いkeratin 14シグナルを誘発しました。この知見は、二能性メモリー前駆細胞に関する先行報告と一致しています。これらの細胞と微小環境の相互作用は動的かつ相補的であるため、細胞自体がプリントされた微小環境の組成を変化させることがあります。したがって、プリントした微小環境による急性影響を理解するためには、本手順に従った後の曝露時間は48時間を超えないようにしてください。蛍光または化学的に測定可能なあらゆる理論的プロセスを微小環境の関数として評価することで、「異なる微小環境が癌細胞株における薬物反応をどのように変化させるか」といった追加の疑問に答えることができます。これは、アポトーシスと増殖の変化によって測定されます。あるいは、微小環境がいかにして前駆細胞の分化を変化させるかについて。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

カスタムmicroRNAのマイクロアレイの実験を行うの簡単な手順が説明されています。手順は、ハイブリダイゼーションシグナルを定量化し、分析、マイクロアレイのスキャン、マイクロアレイにサンプルをハイブリダイズ、RNA、標識RNAとリファレンスのDNAを単離することがあります。...

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このビデオでは、ペプチドマイクロアレイ技術を適用して、ヒストンペプチド上の翻訳後修飾(PTM)を認識する抗体の特異性をプロファイリングする技術を示しています。既知のPTMの組み合わせを持つ固定化された蛍光色素標識ヒストンペプチドを含むマイクロアレイスライドを、標的PTM特異的抗体で処理します。このプロセスは、標的に対する抗体の特異性と、非標的PTMとの潜在的な交差反応性を特定するのに役立ちます。...

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は、接着細胞と微細構造基質との間の機械的相互作用を定量化するためのプロトコルです。これらの相互作用は、遊走、増殖、分化、アポトーシスなどの重要な細胞挙動と密接に関連しています。このプロトコルには、MechProfilerと呼ばれるオープンソースの画像解析ソフトウェアが用意されており、各マイクロポストの関与する力を決定できます。...

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

細胞分化は、マトリックス組成物と基板材料の特性の両方を含む微小環境因子の宿主によって調節されます。ここでは細胞分化および微小環境のコンテキストの関数としての生体力学的な細胞 - 基質相互作用の両方を評価するための牽引力顕微鏡と組み合わせて、細胞マイクロアレイを利用した技術が記載されています。...

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微生物群集の発達は、環境構造、メンバーの豊富さ、形質および相互作用を含む複数の要因の組み合わせに依存する。このプロトコルは、ニッチサイズや閉じ込めなどの重要な要素を近似できるフェムトリットルウェルに含まれる数千のコミュニティを同時に追跡するための合成の微細加工環境を記述しています。...

マイクロウェルアレイプラットフォーム内での微生物コミュニティ開発の組み立てと追跡

この資料は、物理と化学の高スループット操作キューが模倣した生体内で細胞微小と多重化人工細胞微小環境 (MACME) 配列を準備する詳細な方法についてを説明します単一セルのプロファイリングとひと多能性幹細胞 (hPSCs)...

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マイクロアレイを用いてがん細胞型に及ぼす微小環境への影響を調知る

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微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

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