微小環境マイクロアレイの作製と利用（MEArrays）

次の実験の全体的な目標は、接着細胞タイプの細胞機能に対するさまざまな微小環境の影響を測定することです。これは、それらを多様な組み合わせ子微小環境のコレクションに並行してさらすことにより、接着細胞の種類です。これは、まず、微小環境タンパク質の混合物の吸収をサポートするための印刷基板を作製することによって達成されます。次に、微小環境タンパク質のマスタープレートを調製し、クイルまたはキャピラリーピンマイクロアレイ印刷ロボットを使用してMEアレイを印刷します。

次に、微小環境タンパク質のマスタープレートを調製します。次に、接着細胞をMEアレイ上で培養し、細胞数を制限するオプションを使用します。得られた結果は、免疫蛍光分析に基づいて、分化や増殖などの細胞機能に対するさまざまな微小環境の影響を示しています。

この手法のアイデアは、組織の微小環境がヒトの記憶幹細胞の運命決定に及ぼす影響を定量化したいと考えたときに最初に思いつきましたが、in vivoでの作業は不可能であることに気付きました。開発された今では、細胞生物学、研究、創薬に多くの応用がされています。PDMSは、安価で調製が容易で印刷が容易であるため、より硬い組織を模倣する基質として使用されます。

しかし、PDMSの疎水性は、PDMSを使用した場合、一部の細胞株と不適合となることがあります。ラテックス以外の手袋は、ラテックスとしてPDMSの重合を阻害することができます。使い捨てのプラスチックカップから始めるには、シガー184シリコーンエラストマーベースと硬化剤を10対1の比率で組み合わせ、木製またはプラスチック製の舌圧子と激しく混合します。

次に、室温の真空ベルで30分間混合物を脱気します。次に、スピンCoerの作動真空チャックに標準的な顕微鏡スライドを中央に配置し、0.5ミリリットルの混合エラストマーポリマーをスライド表面の中心に振りかけ、60秒間000RPMでスピンコートします。PDMSコーティングされたスライドを摂氏70度で4時間から一晩硬化させます。

スライドは、室温で数ヶ月間気密保存することができます。PAは、PA細胞が細胞接着をサポートするタンパク質がある場所にのみ付着する範囲の柔らかい組織を模倣できるハイドロゲルです。まず、スライドに水酸化ナトリウムをエッチングします。

スライドを摂氏80度のヒートブロックに置きます。0.1の通常の水酸化ナトリウムの1ミリリットルを各スライドに落とします。スライド面全体を覆わないと、PAが故障します。

水酸化ナトリウムを蒸発させて白い膜を残します。表面が完全に覆われていない場合は、このプロセスを繰り返します。スライドは、必要に応じて室温で数日間保存できます。

次に、ヒュームフードにPESでスライドをコーティングします。スライドを15ミリリットルの皿に入れます。水酸化ナトリウムエッチングされた各スライドに300マイクロリットルのPESを追加します。

A PESを水酸化ナトリウムスライドと正確に5分間反応させます。しかし、そうではありません。スライドの両側で脱イオン水でAPESを2〜3回完全に洗い流します。

そうしないと、酸化して次のステップでスライド上に茶色の堆積物を形成します。次に、スライド面から各皿までのすべての溶液を吸引します。PBSに25ミリリットルの0.5%グルタルアルデヒドを加えます。

スライドを暗闇に置き、30分待ちます。30分後、スライド表面からすべてのグルタルアルデヒド溶液を吸引します。次に、糸くずの出ない吸収性の紙を使用してスライドを注意深く乾かします。

スライドは、必要に応じて室温で一晩保存できるようになりました。PA混合物を調製して脱気した後、氷上に置いて重合を遅くします。氷上の各混合物にスライドを準備する直前に、硫酸塩とテミドあたりのアンモニウムを加え、ピペットを使用して5〜10秒間三量化します。

次に、PA混合物をスライド面にピペットで移します。PAの量は、必要なゲル硬度によって異なります。次に、気泡の形成を避けるために、圧力をかけずにガラスカバースリップをPAの上に置きます。

PAゲルを2時間重合させてから、脱イオン水でカバースリップをはがします。PAゲルスライドを大きなコプランジャーで水で一晩洗います。翌日に非反応性アクリルアミドを除去するには、PAゲルが完全に固まるまでスライドを乾燥させます。

その後、スライドは4°Cで密閉されたスライドボックスに1か月間保存できます。まず、プラスチックチャンバーが2チャンバースライドから印刷されたアレイを囲むように取り付けられます。チャンバーを取り外し、かみそりの刃で半分に切ります。

1ミリリットルのピペットチップを使用して、水槽用シリコーンの薄いビーズをチャンバーの端に塗布し、エミー賞アレイの表面に押し付けます。アレイ機能のどの部分にもシリコンに触れないでください。エミー賞の配列に文化的なクジラを良好に付着させることは、付着クジラのペリアがチャンバーから媒体を漏らすことを可能にし、その結果、広範囲にわたる細胞死につながる可能性があるため

PDMSコーティングスライドの場合、スライドを水性1%onic F 108で真空下15分間インキュベートしてブロックし、いずれのゲルタイプでもスライドをブロックし、細胞培養培地で抗生物質を含むアレイを3回、1回の洗浄で5分間すすぎます。これにより、PAゲルの場合、細胞に毒性を持つ可能性のある非反応性モノマーが除去されます。3回目の洗浄後、培地でさらに30分間インキュベートしてゲルを再水和します。

次に、4〜5個のアレイを15センチメートルの滅菌ペトリ皿に入れます。ディッシュに、最終培地容量の半分を、アプリケーションに必要な濃度の目的の細胞を加えます。MEアレイは、使用する細胞タイプの維持に適したインキュベーターに配置する必要があります。

観察しながら、顕微鏡下で15〜20分ごとに細胞が印刷された特徴に均一に付着しているかを確認します。MEアレイを静かに振って、付着したセルとフローティングセルを区別します。接続時間は異なりますが、PAコード化されたMEアレイでは通常2時間以内に完了します。

アタッチメントが飽和状態になった後、または制限時間に達した後、結合していない細胞を吸引し、PDMSコーティングされたMEアレイでディッシュを最終容量まで満たします。すべてのメディアを削除すると、細胞が強制終了します。したがって、これらのスライド上のすべてのメディア変更について、メディアボリュームの半分を連続して交換し、次にディッシュに最終ボリュームを入れます。

培養は、通常の培地交換で何日も進めることができます。パラフォーム、アルデヒド、メタノールアセトンなどの一般的な固定剤は、エミーアレイシステムに適合します。PDMSコーティングされたPDMSを染色する場合でも、MEアレイは濡れたままでなければならないことを忘れないでください。

したがって、染色されたMEアレイのスライドを準備するために、ハーフボリューム交換技術を続行します。カミソリの刃を使用してチャンバーを取り外し、植物を使用してカバースリップを取り付けます。マウントGタンパク質は、クイルピン上の先端が正方形のシリコンピンを使用して、印刷されたPDMSコードMEアレイ上に堆積しました。

マイクロアレイ印刷ロボットによる各種タンパク質の作製を、抗体を用いた免疫蛍光法により検証した。マスタープレート中のタンパク質溶液の希釈は、プリントされたフィーチャーに付着したプリント基層表面細胞に沈着した量を明らかなパターンで反映していました。同様に、エミー賞の配列が40, 000パススケールで印刷されるときも、セルの付着の同じ明らかなパターンが発生します。

PAゲル2つの微小環境タンパク質は、ヒト多能性乳腺上皮前駆細胞株における濃度依存性ケラチン発現プロファイルを誘発しました。ケラチン 8 シグナルとケラチン 14 シグナルの対数比は、シグナルの変動性と再現性を示しています。24時間の培養後、結合していない細胞を洗い流します 12 meアレイの分析で。

標準的な統計解析を用いて、1型コラーゲンと組換えヒトpカドヘリンの異なる希釈がケラチン発現に変化をもたらすかどうかを検討しました。当初、付着直後の特徴上のセル間の平均値からの変動はありませんでした。しかし、24時間後には1型コラーゲン濃度が高いと、ケラチン8の発現が有意に高くなりました。

一方、本明細書中の高濃度のPCAは、強いケラチン14シグナルを誘発した。この知見は、バイポテントメモリー前駆細胞に関するこれまでの報告と一致しています。これらの細胞微小環境相互作用の動的かつ相互的な性質により、これらの細胞自体が印刷された微小環境の組成を変化させる可能性があります。

したがって、印刷した微小環境の急性の影響を理解するには、この手順の後で48時間を超えないようにする必要があります。蛍光または細胞で測定できる理論プロセスは、さまざまな微小環境ががん株の薬物反応をどのように変化させるかなどの追加の質問に答えるために、微小環境の関数として資産にすることができますか?それは眼瞼下垂と増殖の変化によって大きくなっています。

または、微小環境は前駆細胞の分化をどのように変化させますか。