マルチアングル照明とピクセル超高解像度を採用しLensfreeオンチップ·トモグラフィー顕微鏡

この手順の全体的な目標は、大量のイメージングボリュームで生体試料のレンズフリーオンチップ3次元イメージングを実現することです。これは、最初にサンプルをセンサーチップに直接配置し、部分的にコヒーレントな照明を提供することによって実現されます。2番目のステップは、記録するさまざまな位置の光源を横方向にシフトすることです。

サブピクセルは、サンプルのホログラフィック画像をシフトしました。次のサブピクセルがシフトされました。ホログラフィック画像は、断層撮影のために複数の照明で記録されます。

最後のステップはデータ処理で、取得したデータセットをデジタルで再構築し、最終的にサンプルの3次元断層画像を取得します。この手法は、従来の光学顕微鏡などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、コンパクトなアーキテクチャでハイスループットのイメージングを提供できることです。これにより、当社のプラットフォームはレバノンのチッププラットフォームとの統合に特に役立ちます。

このレポートでは、静的サンプルのトモグラフィーに向けたベンチトップ実装の基本的なイメージングセットアップについて説明します。キセノンランプを備えたモノクロメーターを調整して、中心波長450〜650ナノメートルの周囲に約1〜10ナノメートルのスペクトル幅の出力を提供しました。この部分的にコヒーレントな出力は、マルチモード光ファイバーに結合され、部分的にコヒーレントな光をシステムに供給します。

光ファイバを電動回転ステージに搭載し、照明の角度を変化させます。光源が取り付けられた電動ステージは、2次元の線形XYステージに取り付けられており、検出のために特定の角度で光源を平坦にシフトするために使用されます。2.2ミクロンのピクセルサイズを持つ5メガピクセルのA-C-M-O-Sセンサーアレイが使用されます。

検出器は、サンプルの広視野ホログラフィック画像を記録するために使用されます。センサーアレイを光源の回転軸と同じ軸面に配置して、センサーが大きな照明角度で十分な光を受け取っているかどうかを確認することが重要です。レンズフリーの光トモグラフィーは、細胞や微生物など様々な物体を撮影することができますが、ここではメスやヘラを用いてウミエルガン試料を3次元顕微鏡で観察することで、その基本原理を実証しています。

シーラー臓器の培養物が入ったシャーレからAGAの小片を取ります。各寸法に沿って数ミリメートルの立方片には、数百の線虫が含まれます。1ミリリットルの脱イオン水が入ったポリプロピレンバイアルに寒天の小さな塊を入れます。

30秒から1分間、穏やかに渦巻きます。10〜15分後、ワームは寒天から脱イオン水に這い出るはずです。ワームは、ワームと5〜10ミリモルリマの1ミリリットルを一時的に固定するために、ここで見るには小さすぎることに注意してください。

だから解決策を解決し、10分待ちます。バイアルの底から5〜10マイクロリットルのサンプルをピペットで取り出し、2枚のカバースリップの間に挟みます。このサンプルには、一時的に固定化されたワームが多数含まれていますが、検出器に載せてデータ取得を開始することができます。

このセクションでは、デモンストレーションのために、一般的なレンズフリーの光断層撮影またはLOT実験の画像取得手順をまとめていますが、カスタム開発されたラボビューインターフェースを使用してプロセス全体を自動化しています。手動の手順を開始するには、回転ステージの初期角度を負の 50 度に調整します。ここで、0 度は光源の垂直位置に対応します。XYステージの初期位置をゼロゼロ(ホームポジション)に調整します。

検出器の露光時間を調整して、回転ステージの角度を変更せずに、画像が飽和ピクセルなしでできるだけ明るくなるように、そのダイナミックレンジを最大限に活用します。各画像につき 9 枚の画像をキャプチャします。XY ステージを 3 x 3 の正方形グリッド内の新しい位置に移動し、各イメージが前のイメージと比較して約 4 分の 1 ピクセルシフトするようにします。

各角度でより多くの画像を取得すると、オブジェクトの種類と信号対雑音比に応じて解像度が向上する場合があります。初期角度で9枚の画像を収集した後、XYステージの位置をゼロゼロの位置に戻します。次に、回転ステージの角度を 2 度ずつ増やし、正の 50 度に達します。

新しい角度ごとに増分した後、説明されている手順を繰り返します。角度増分は、取得時間とイメージング解像度の最適化に応じて、細かくなったり粗くなったりします。データ取得に続いて、51の異なる照明角度のそれぞれに対して9つのサブピクセルシフト画像を含む459枚の画像が取得されます。

9枚の画像の各セットは、ピクセル超解像アルゴリズムを使用してデジタル処理され、1つの高解像度投影が得られます。その後、角度ピクセルごとのホログラムのスーパー結果がデジタル的に再構築され、51枚の投影画像が取得されます。ここでは、ラップトップを使用したデータ処理を示しています。

再構成は、グラフィカル処理ユニットを使用した全視野で1秒未満かかります。この 51 枚の投影画像のセットは、Tom OJA プラグインを使用して再投影されます。画像 J の場合、投影画像は最初に画像 J に読み込まれ、その後で Tom OJ プラグインが呼び出されます。

各投影画像の視野角を提供するルックアップテーブルがOJにロードされます。加重後方投影法を使用すると、標本の3次元断層撮影画像を取得できます。ここでは、レンズフリーの光トモグラフィーの広い視野が、サンプルが検出器アレイの上部に直接配置されることで示されています。物体のホログラフィック画像は、24ミリメートル四方の視野で記録でき、より大きなアクティブエリアを持つ新しい検出器アレイを使用してさらに増やすことができます。

検出器アレイのピクセルサイズは、記録されたホログラフィック画像の解像度を制限しますが、ピクセル超解像技術はこの問題を軽減します ここで示すのは、ピクセル超解像ホログラムと、照明の3つの異なる角度に対してサブマイクロメートルの空間分解能を提供する再構成された投影画像です。投影画像は、断層撮影画像再構成技術を使用して組み合わせ、標本のTOM根拠を計算することができます。線虫の前方を通るXY平面の3つのスライス画像がここに示されており、咽頭管はZを通るスライスでのみ見え、約5ミクロンの外径を持つこのほぼ円筒形の構造から予想されるように、8ミクロンに相当します。

さらに、XZ平面の断面画像は、線虫と内部の咽頭管の境界を明確に示しており、咽頭の3Dイメージングが成功したことを示しています。この技術の開発により、研究者は数十ミリメートルのイメージングボリュームで3次元顕微鏡法を行う道を開くことができます。したがって、レンズフリーの光トモグラフィーは、レバノンのチッププラットフォームでのハイスループットイメージングアプリケーションに役立つツールになる可能性があります。