不定冠詞のin vitro共同感染モデル熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）-HIV-1の相互作用

我々は開発した

この手順の全体的な目標は、マラリア原虫fparに感染した赤血球がヒト初代単球由来マクロファージにおけるHIV赤血球の複製に及ぼす影響を研究するためのinvitroモデルを開発することです。これは、最初にveacシステムを使用してマラリア原虫、偽のパラ感染赤血球を分離し、次にヒト単球由来マクロファージを感染細胞に曝露することによって達成されます。次に、赤血球に曝露された単球由来マクロファージは、完全複製HIVまたは単一複製ルシフェラーゼをコードするHIVに感染します。

最後に、感染後3日目、6日目、9日目、および12日目に培養上清を採取し、ルシフェラーゼをコードするウイルスの完全複製ウイルスを採取します。感染した細胞は、感染から72時間後に嘘になります。最終的に、ウイルスの複製は、Elizaが上清中のHIV One P 24キャプシドタンパク質の量を定量することでモニターでき、ウイルスの転写は細胞溶解物のルシフェラーゼ定量によってモニターできます。

この方法は、マラリア、HIVの重複感染の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、マラリア原虫の感染はHIVの複製にどのように影響しますか?この方法は、マクロファージにおけるマラリア原虫とHIVとの相互作用を研究するために開発されましたが、他の細胞タイプにも適用できます。

例えば、樹状細胞、単球、または手技を実証するCDの4つのT細胞は、グアダルーペ・アンドレアニである。研究室のポスドク研究員は、培養プレートから赤血球を採取することから始め、回収した細胞を単球由来マクロファージ培地10ミリリットルで洗浄し、次いでペレットを単球由来マクロファージ培養培地12ミリリットルに再懸濁する。次に、細胞懸濁液をMilton ECSカラムにゆっくりと加え、カラムを新鮮な培地で一度洗浄した後、懸濁液を流し、磁石から取り出して12ミリリットルの単球由来マクロファージ培養液を洗い流します。

カラムを中腹に培養し、感染した赤血球を滅菌チューブに逃がして、単球由来のマクロファージを感染した赤血球または未感染の赤血球に曝露します。単球由来マクロファージを含有する予め調製した24ウェルプレートの各ウェルに、適切な赤血球懸濁液量を添加する。4時間後に5%二酸化炭素中で摂氏37度で共培養物をインキュベートし、赤血球を含む培地を取り出し、次にそれぞれに600マイクロリットルのエンドトキシンを含まないPBSを穏やかに加え、各洗浄の直後にPBSを3回吸引します。

現在、200マイクロリットルの氷、冷たく滅菌された水を各井戸に注入し、20秒後に赤血球を吸引します。次いで、600マイクロリットルの単球由来マクロファージ培地を各ウェルに培養し、37°Cおよび5%二酸化炭素で24時間培養物をインキュベートする。HIVに対するマラリア原虫偽パレムの効果を評価するために、NLのP 24、4、3、BO、IV、1ウイルスのNLを含む単球由来マクロファージ培地300マイクロリットルで、単球由来マクロファージにおける1回の複製を、この図に示されているプロトコルと同様に適切なウェルに

共培養物を2時間インキュベートした後、600マイクロリットルのエンドトキシンフリーPBSで細胞を3回洗浄します。次いで、600マイクロリットルで、新鮮な単球由来マクロファージ培地を各ウェルに注入し、3日目、6日目、9日目、および12日目に共培養を継続し、最初のウイルス感染後、回収された細胞懸濁液を200マイクロリットルの新鮮な単球由来マクロファージに置き換えて、各スナットの200マイクロリットルを収穫する。中程度。その後、収穫した上清をマイナス20°Cで保存し、後でElizaが分析できるようにします。

HIVに対する寄生虫の影響を決定するために、単球由来マクロファージにおける1つの遺伝子発現を、ここに示されているプロトコルと同様に、目的のルシフェラーゼENC被覆ウイルスのP 24を含む単球由来マクロファージ培地の300マイクロリットルで行います。非ルシフェラーゼENCコーティングウイルスについて示したように、コード培養物をインキュベートおよび洗浄した後、感染後72時間で培地を取り出し、200マイクロリットルのルシフェラーゼアッセイを加えます。Hit Lysis bufferは、室温で穏やかに振とうしながら細胞を溶解し、その後、共培養物をマイナス20°Cで保存します。

プレートを解凍した後、40マイクロリットルのライセートを各ウェルから対応するウェルに移し、96ウェルのルミノメータープレートに入れます。次いで、それぞれに100マイクロリットルのルシフェラーゼアッセイキットルシフェラーゼ基質を添加する。さて、ついにホタルのルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定します。

この実験の製造元の指示に従って、単球由来マクロファージを感染した赤血球または非感染赤血球に曝露した後、NL43ブレンに感染しました。先ほど示したように、ウイルスタンパク質P 24の産生は、最初のウイルス感染後のさまざまな時点で、ELIZAによってHIVのHIVと無細胞上清中のP 24をモニターしました。寄生虫で前処理された単球由来マクロファージのスーパーナート中のHIV one P 24キャプシドタンパク質によって測定された12日目のウイルス粒子の放出の有意な減少に注意してください。

この実験では、単球由来マクロファージを感染した赤血球と感染していない赤血球に曝露し、次にルシフェラーゼをコードしたウイルスに感染させ、ルシフェラーゼ発現を最初にウイルスが感染してから72時間後に細胞溶解物で評価しました。単球由来のマクロファージ感染は、外因性VSのいずれかを保有するそのようなウイルスによる。VGまたはHIV1糖タンパク質は、p偽スパーに曝露された細胞におけるルシフェラーゼ産生を有意に減少させた。注目すべきは、VSVG擬似型ウイルスは、VSPG擬似型粒子の感染効率が高いため、対応するJRFLよりもはるかに大きなルシフェラーゼ活性をもたらしたことです。

この技術により、マラリア、HIV同時感染の分野の研究者は、いくつかの免疫細胞タイプの研究に適応可能なin vitroモデルで、これら2つの病原体間の相互作用を探求することができます。