病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

次の実験の全体的な目標は、DNA修復と細胞核抽出物が修復されると蛍光を発する分子ビーコンを使用して、DNA修復と細胞核抽出物の速度をリアルタイムで測定することです。基本的な切除修復分子ビーコンは、ステムループ構造のデオキシオリゴヌクレオチドで構成されており、5つのプライムエンドに結合した6つの曲線のオキシフルオレセイン部分と、折りたたまれたときに3つのプライムエンドに結合したdil motiを持つ単一塩基病変が含まれています。6つのファムモティは、フォレスター共鳴エネルギー伝達を介して非蛍光性の方法でdabシルによって急冷されます。

DNA修復活性を評価するために、ビーコンは修復酵素を含む細胞核抽出物とインキュベートされます。DNAグリコシル酸が認識され、ビーコン内のDNA損傷が除去されます。得られたABA部位は、APエンドヌクレアーゼ1または類人猿1の基質であり、APEを認識すると、APE1はABA部位でDNA骨格を切断し、6つのファムを含むDNAがヘアピンから自由に解離することを可能にする。

クエンチャーからの分離は、DNA修復のレベルに比例する蛍光の増加をもたらし、定量的リアルタイムPCRマシンを使用してリアルタイムで評価することができます。DNA損傷を修復する能力は、すべての細胞とすべての生物にとって非常に重要です。多数の細胞DNA修復経路の中で、塩基除去修復標的、酸化的または化学的損傷に起因する可能性のある損傷した塩基は、塩基除去修復に影響を与える可能性のある個々の細胞要素の役割を解明することが、私たちの実験室研究の主要な目的の1つです。

そのため、DNA修復活性を正確かつ高感度に測定することは、当研究室の関心事となっています。このアッセイは、そのようなデータを提供することができます。この手法は、32 PN標識やゲル電気泳動による分析などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、放射性標識基板を使用せず、リアルタイムでダリー修復率を測定でき、ダイナミックレンジが非常に広いことです。

さらに、このアプローチでは、いくつかの異なるフルオロフォーおよび/または塩基病変を利用して、基質特異性を決定できます。このアッセイは、さまざまな設定で非常に定量的で非常に感度が高いことを示しました。この塩基切除修復分子ビーコンアッセイは、速度論的分析に適しています。

このアッセイの高い感度と特異性により、正確な塩基除去修復定量が可能となり、修復阻害剤のスクリーニングやバリデーションに有用です。さらに、ダリー修復活性の測定や、機能的なバイオマーカー測定のための組織や腫瘍細胞溶解物の測定にも適応可能です。このアッセイに使用する分子ビーコンを設計する際には、ここに示すように、長さが43塩基の以下のDNAオリゴヌクレオチドを考慮してください。

うまく機能します。DNA配列は一意ではありませんが、ヘアピン構造の形成を可能にする必要があります。ここに示すようにひざまずくと、ウラシルやテトラハイドロフリンなどの特定の塩基病変を挿入することで特異性が達成されます。

5 つのプライム エンドから X 6 ベースの位置では、GC 含有量は少なくとも 32% である必要があり、GB ベースは 5 つのプライム エンドに配置しないでください。6つのカルボキシフルオレセインまたは6つのfamを5つの素数末端に結合させ、3つの素数末端をdabシルで修飾する必要があります。これは、グリコシル放出の結合と活性を保証するためのDNA修復タンパク質の基質となります。

病変の位置は、ヘアピン構造とDNAの末端から十分なスペースを提供するように選択されています。ステムまたはヘアピンデュプレックスの長さは、最低でも15塩基対である必要があります。推奨されるループ長は13塩基です。

制御分子ビーコンは、DNA病変を含まないことを除いて、実験用分子ビーコンと同一である必要があります。したがって、DNA修復酵素によって認識されるべきではありません。分子ビーコンが手元にあったら、ビーコンが加熱されるまで蛍光を発しないことを確認するために、品質評価を実施する必要があります。

また、最適な融解温度を決定するには、抽出手順中のすべてのステップを氷上または摂氏4度で実行する必要があります。タンパク質の安定性を確保するために、事前に冷却して実験の準備をします。サンプル透析バッファー透析チャンバー、マイクロ遠心分離機、チューブ、シリンジ、ニードルごとに2つの1リットルビーカー。

15ミリリットルの円錐形チューブにラベルを付け、氷の上に置きます。細胞から増殖培地を吸引し、次に2回目の洗浄後、7.5ミリリットルの冷たいPBSで2回洗浄します。各皿に5ミリリットルの冷たいPBSを追加し、セルリフターを使用してプレートから細胞をこすり落とします。

細胞を冷やした15ミリリットルの円錐管に移し、次いで摂氏4度でGの500倍で5分間遠心分離する。スピン後、上清を除去し、同様のチューブ内の既知の液体量と比較することにより、充填された細胞量を推定します。チューブをさらに1分間遠心分離し、残りのPBSをピペットレスで取り出します。

細胞ペレットを150マイクロリットルの核バスター抽出試薬に懸濁し、パックされた細胞容量50マイクロリットルごとに1つずつ。次に、再懸濁した細胞を予め冷却した1.5ミリリットルのチューブに移し、高速で15秒間ボルテックスします。ボルテックス後、チューブを氷上で5分間インキュベートし、次にさらに15秒間ボルテックスし、摂氏4度で5分間Gの13,000倍で遠心分離します。

スピン後、細胞質画分を含む上清を取り除き、廃棄します。Resusは、1マイクロリットルのresus懸濁100 xプロテアーゼ阻害剤カクテル、1マイクロリットルの100ミリモルDTT、および75マイクロリットルの核バスター抽出の混合物でペレットを懸濁します。試薬は、パックされた細胞容量の50マイクロリットルあたり2つ。

Vortexの細胞を高速で15秒間。氷上で5分間インキュベートし、再び高速遠心分離機で15秒間ボルテックスし、摂氏4度でGを13,000倍で5分間遠心分離します。スピンに続いて、シリンジを使用して、核タンパク質を含む上清を7, 000分子量のカットオフを持つスライド透析カセットに移します。

次に、500ミリリットルの予冷透析緩衝液に500マイクロリットルの1モルDTTを加え、ライセートを4°Cで穏やかに攪拌しながら90分間透析します。90分後、透析カセットをDTTで0.5リットルの予冷透析緩衝液が入った2番目のビーカーに移し、透析します。ライセートを4°Cで90分間、透析後に穏やかに攪拌しながら、高タンパク質濃度のために抽出物が結晶化した可能性があります。

次に、カセットの注入に使用したものとは異なるポートに新しいシリンジを挿入し、透析カセットから透析した核タンパク質溶液を採取します。透析した核タンパク質溶液を取り除くときは、曇ったように見える結晶を含めるようにしてください。サンプルを20マイクロリットルのマイクロ遠心分離チューブに分注し、ドライアイスで急速冷凍し、必要になるまで摂氏マイナス80度で保存します。

タンパク質の濃度を決定し、添付文書に記載されているように品質管理を行います。モレキュラービーコンアッセイを行うには、1ミリモルのDTTを含む塩基性シシオン修復反応バッファーで細胞ライセートを融解し、細胞ライセートをタンパク質1マイクロリットルあたり2マイクログラムに希釈し、分子ビーコンを塩基性切除修復反応バッファーで200マイクロモルに希釈します。定量リアルタイムPCR装置は通常、蛍光計として使用しないため、定量リアルタイムPCR装置の実行方法を変更して、摂氏37度で20秒ごとに少なくとも180サイクルデータを収集するようにしてください。

次に、20秒ごとに分子ビーコンの最大蛍光で15サイクルを行い、正規化のためのデータを取得します。反応量を25マイクロリットルに設定します。次に、実験タイプとして標準曲線を選択し、適用されたバイオシステムソフトウェアを使用して装置上でプレートデザインを設定し、プレートレイアウトを完成させます。

この表に例が示されており、付属のドキュメントにも記載されています。標準曲線として選択したウェルには何も追加しないでください。塩基性切除修復反応バッファーDTT細胞ライセートを1マイクロリットルあたり2マイクログラムの濃度で置き、実験で使用したすべての分子ビーコンを氷上に置きます。

次に、DTTを基本切除修復反応バッファーに最終濃度1ミリモルピペットまで加えます。15マイクロリットルのDTT入りの基本切除修復反応バッファーを、氷上の互換性のある光学Q-R-T-P-C-Rプレートの各ウェルに注入します。次に、プレートのレイアウトに従って、ビーコンを適切なウェルにピペットで移します。

ライセートと分子ビーコンまたはコントロールの各組み合わせは、トリプリケートでアッセイする必要があります。最後に、希釈した核溶解物のウェルあたり5マイクロリットルを適切なウェルにピペットで移します。すべてのMolecular Beacon試薬を冷たく保ち、最後のステップとしてライセートをプレートにピペットで入れることを忘れないことが重要です。

ライセートには活性タンパク質が含まれており、反応混合物にピペットで移されるとすぐに分子ビーコンの修復を開始することを忘れないでください。したがって、測定を開始する前に発生するビーコン修理の量を最小限に抑えるために、すべての試薬を冷たく保つことが非常に重要です。すべて追加したら、プレートを光学接着フィルムで密封し、プレートを軽くたたいて混ぜます。

次に、遠心分離機で10秒間の迅速なスピンを行い、スピン後にチューブまたはプレートの底に溶液を収集し、プレートを定量的リアルタイムPCRマシンに挿入し、完了後にアッセイを開始し、生データをExcel形式でエクスポートし、必要な計算が行われたら、添付のドキュメントの指示に従ってデータを分析します。正規化された蛍光データを、LN 4 28 細胞と LN 4 28 MPG として指定された MPG 過剰発現細胞株からの核抽出物の DNA 修復活性と品質を評価するための、対応するエラーのある散布図に、時間に対する自由 fam の割合として秒単位でプロットします。このビデオで説明されているアッセイは、APE one substrate tetra furinをポジティブコントロールとして含む分子ビーコンを使用して実施しました。

この図に示すように、両細胞株は、急な傾斜で示されるように、MPG基質の除去に特異的なDNAグリコセート活性を有するAPE1の活性を有する。HXとして示された低ヒポキサンチンは、両方の細胞株の核溶解物で測定されました。各ライセートは、基本的切除修復制御分子ビーコンまたは塩基除去修復HX分子ビーコンのいずれかを用いて分析した制御ビーコンLN4 28は緑色で示され、LN4 28 MPGはハイポビーコン用として紫色で示されています。

LN 4 28 は青色で、LN 4 28 MPG はオレンジ色で示しています。結果は、平均蛍光単位であるAと正規化された蛍光単位であるBとして報告されます。HX修復を示す蛍光の時間依存的な増加が各細胞で発生しました。

ライセートは、予想どおりHX分子ビーコンとインキュベートされました。オレンジ色のトレースで示されるLN 4 28 MPG細胞株は、蛍光の急速な蓄積によって示されるように、MPGタンパク質が最小限である親のLN 4 28細胞株よりもはるかに高い修復率を示しました。したがって、特異的修復タンパク質による特定のDNA病変の修復速度は、非特異的DNA切断のバックグラウンドレベルを最小限に抑えて、細胞抽出物からリアルタイムで測定できます。

このビデオを見れば、分子ビーコンの設計方法と、精製タンパク質または細胞溶解物を使用したリアルタイムのDNA修復率の測定方法について十分に理解できるはずです。分析に関しては、ダイナミックレンジとバックグラウンド値を評価することが不可欠です。そのためには、ポジティブおよびネガティブコントロールビーコンの有無などの制御反応を含めることによって評価します。ウェル間の変動性を考慮すると、個々のウェルのデータを入力値に正規化すると便利です。

これらは、融解温度でのより細かいステップによって決定されます。これに加えて、ロックダイなどの他の色素を含めることで、ピペッティングエラーや検出器の違いに固有の変動性を説明できます。この技術により、個々の切除修復部品が全体的な修復活動と能力に与える影響を解明することができました。

従来の方法では検出できなかった小さな変化を覆い隠すのに十分な感度を備えています。