Name: 病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: 学ぶ 分子ビーコンを用いた塩基除去修復活性のリアルタイム定量法。DNAグリコシラーゼとAPエンドヌクレアーゼ活性を細胞核抽出物で測定し、DNA損傷応答の動態解析やがん研究への応用が可能です。

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この作品は、ピッツバーグ財団と米国立衛生研究所（NIH）からの補助金によって支えられて[GM087798。CA148629。ES019498] RWSに。 UPCIレンチウイルス機能のサポートは、国立衛生研究所からがんセンター·サポート·グラント[P30 CA047904]でRWSに提供されました。サポートは、ピッツバーグ大学の薬理学教室＆DSのケミカルバイオロジーによって提供されました。サポートもCVにエストロゲンによって提供されました。

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
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<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
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<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWSはTrevigen社、著者の他の利害の衝突が存在しないことを宣言する科学コンサルタントです。

ヘリカーゼ活性6を含む多数の分子や酵素活性を検出および定量のための用語&quot;分子ビーコン&#39;を使用して600の引用は、DNAポリメラーゼ活性7,8、DNAリガーゼ活性9、テロメラーゼ活性10、DNA光回復酵素活性を11とDNA /超えています他の多くの間RNAハイブリッド12。上記のDNA修復活性の測定のための分子ビーコンの使用に加えて、我々と他のBER活動1,2,13-15の分析のためにこれらのプローブの有用性を実証した。 我々はここに記述リアルタイムBER活性アッセイは、単一の修飾塩基を搭載し、病変と反対ベースのさまざまな病変や変化のBER率の定量的評価が可能になります。アプリケーションは、分子機構の研究から阻害画面に及ぶことができます。我々はリサを比較することにより、BER特異性を実証MPGからTESは、非発現細胞とコントロールビーコンの活動の欠如を持つ細胞を発現している。アッセイは、BERタンパク質MPG <s...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>フィッシャー</td><td> P217-500 </td><td>分子のグレード</td></tr><tr><td> EDTA </td><td>フィッシャー</td><td>とも結合-500 </td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td> BP229-1 </td><td>分子のグレード</td></tr><tr><td> DTT </td><td>フィッシャー</td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-ソリューション</td><td>インビトロジェン</td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-塩</td><td>シグマ</td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム</td><td>シグマ</td><td> 17から8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μMフィルター</tD&gt; <td>ナルゲン</td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td>スライド-A-Lyzer透析製品</td><td>ピアース</td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td>注射器</td><td>フィッシャー</td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td>針</td><td>フィッシャー</td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 mlのマイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 05-408-129 </td><td>ブラック</td></tr><tr><td> 15mlファルコンチューブ</td><td>フィッシャー</td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBus​​terタンパク質抽出キット</td><td>カルビオケム</td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td>分子ビーコン</td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRadタンパク質アッセイ染料の再エージェントに集中</td><td> BioRad社</td><td>カタログ番号500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

我々は塩基除去修復（BER）分子ビーコンを用いたDNAグリコシラーゼと細胞核溶解物中のAPエンドヌクレアーゼ活性の定量的、リアルタイム測定のための方法を説明します。基板（ビーコン）が6 - カルボキシフルオレセイン（6-FAM）5 &#39;末端およびオリゴヌクレオチドの3&#39;末端に結合しDABCYL部分に結合した部分を有する単一の基本病変を含むデオキシオリゴヌクレオチドで構成されています。 BER分子ビーコンは、長さ43塩基であるとシーケンスは、幹1,2のループで13個のヌクレオチド、15塩基対のステム-ループ構造の形成を促進するために設計されています。この構成では、折り畳まれたときに6-FAM部分はフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）3,4を介した非蛍光性の方法でDABCYLによってクエンチされています。病変は6-FAMの部分を含む残りの5つのベースオリゴヌクレオチドは、幹から放出されるように、次の基本病変の除去と鎖切断に配置されている。解放するDNA修復のレベルに比例する蛍光の増加にクエンチャー（DABCYL）の結果から数量剥離。蛍光値の読み込み複数集めることによって、BERの活動のリアルタイム評価が可能です。標準的な定量的リアルタイムPCR装置の使用は、多数のサンプルの同時分析を行うことができます。単一の基本病変、これらのBERの分子ビーコンのデザインは、運動解析、BERの定量化と阻害剤の検証に従順であり、組織や腫瘍細胞溶解物や精製されたタンパク質とDNA修復活性の定量化のための適応可能である。これらの分子ビーコンを使用して、腫瘍ライセートや組織の吸引のBER活動の分析は、機能的なバイオマーカーの測定にも適用可能である。また、この定量的なアッセイを用いて精製したタンパク質とBERの活動の分析は、BER阻害剤の発見と検証のための迅速、ハイスループットな方法を提供します。

我々は、細胞核溶解物中のDNAグリコシラーゼとAPエンドヌクレアーゼ活性の定量的、リアルタイム測定のための方法を説明します。アッセイは、動態解析に従順DNA修復活性の速度を得られる組織および腫瘍溶解液または精製したタンパク質とDNA修復活性の定量化のための適応可能である。

塩基...を用いて、細胞核ライセート中のDNAグリコシラーゼおよびAPエンドヌクレアーゼ活性を定量的にリアルタイムで測定する方法について記述する。

本実験の全体的な目的は、修復されると蛍光を発する分子ビーコンを用いて、DNA修復速度および細胞核抽出液をリアルタイムで測定することです。塩基切除修復用分子ビーコンは、単一の塩基病変を含むステムループ構造のデオキシオリゴヌクレオチドで構成されており、折りたたまれた際に5'末端に6-FAM（フルオレセイン）部位が、3'末端にDabcyl部位が結合しています。6-FAM部位は、フェルスター共鳴エネルギー転移（FRET）によりDabcylで消光され、非蛍光状態となります。DNA修復活性を評価するため、修復酵素を含む細胞核抽出液とビーコンをインキュベートします。DNAグリコシラーゼがビーコン内のDNA病変を認識して除去します。これにより生じたABA部位は、APエンドヌクレアーゼ1（APE1）の基質となります。APE1が認識すると、ABA部位でDNA主鎖を切断し、6-FAMを含むDNAがヘアピンから自由に解離できるようになります。クエンチャーからの分離によって蛍光が増加し、それはDNA修復レベルに比例するため、定量リアルタイムPCR装置を用いてリアルタイムで評価することが可能です。DNA損傷を修復する能力は、あらゆる細胞および生物にとって極めて重要です。数ある細胞内DNA修復経路の中で、塩基除去修復は、酸化ストレスや化学的な侵害によって生じた損傷塩基を標的としています。塩基除去修復に影響を及ぼし得る個々の細胞構成要素の役割を明らかにすることが、当研究室における研究の主な目的の一つです。そのため、DNA修復活性を正確かつ感度良く測定することが、当研究室の関心事となっています。本アッセイによって、そのようなデータの取得が可能です。³²P標識およびゲル電気泳動による解析などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、放射性標識基質を使用せず、DNA修復速度をリアルタイムで測定でき、かつダイナミックレンジが非常に広いことです。さらに、この手法では、さまざまな異なる蛍光色素や塩基損傷を利用して基質特異性を決定させることができます。我々は、このアッセイがさまざまな条件下で非常に定量的かつ高感度であることを示しました。この塩基除去修復分子ビーコンアッセイは、速度論的解析に適しています。本アッセイの高い感度と特異性により、塩基除去修復の正確な定量が可能であり、したがって修復阻害剤のスクリーニングやバリデーションに有用です。さらに、DNA修復活性の測定や、機能的バイオマーカー測定のための組織および腫瘍細胞溶解液への適用も可能です。本アッセイに使用する分子ビーコンを設計する際は、ここに示す43塩基長の以下のDNAオリゴヌクレオチドを検討してください。適切に機能させます。DNA配列は一意的である必要はありませんが、ヘアピン構造を形成できる必要があります。ここに示すように折りたたまれた際、ウラシル

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ここでは、ヌクレオチド除去修復システムを例に、単一分子AFMイメージングによるさまざまなDNA病変認識アプローチの研究が実証されています。DNAおよびタンパク質サンプル調製の手順と、AFM実験の実験的および分析的詳細について説明します。...

ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査

ここでは、 in situ Proximity Ligation Assay（PLA）を使用して、遺伝毒性ストレスに曝された懸濁細胞培養におけるATMとp53との間の直接タンパク質 - タンパク質相互作用の検出および可視化を実証する。...

近接ライゲーションアッセイを用いた懸濁細胞培養におけるDNA損傷誘発タンパク質複合体の検出と可視化

DNA 損傷修復機構研究で定義されたサブ核領域の病変を誘導するシステムが必要です。405 nm レーザー装備レーザー走査共焦点の顕微鏡を使用してローカライズされた二本鎖切断を作成し、これらの病変の修復因子のダイナ...

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

このプロトコルの目的は、プラスミド DNA を定義された dna-タンパク質クロスリンクの修理を定量化します。破壊のプラスミドは受信者哺乳類セルラインと複数時間ポイント後トランスフェクションで収穫される低分子の重量に導入しました。DNA 修復速度は qPCR...

シンプル、迅速、かつ定量的アッセイのプラスミド dna-タンパク質クロスリンクのメジャー修理に哺乳類細胞にトランスフェクション

非標識、ラジオ-同位体 DNA ポリメラーゼの校正と DNA 修復アッセイ法は高分解能 MALDI-TOF 質量分析法および単一のヌクレオチドの拡張戦略を使用して開発されました。アッセイは、非常に特定、簡単、迅速かつ簡単に校正を実行し、修復するパッチ...

校正と単一のヌクレオチドの拡張子と MALDI-TOF 質量分析を用いた DNA 修復アッセイ

この記事では免疫染色とクロマチン免疫沈降の重要なステップを紹介します。これらのプロトコルは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し、定量化するために一般的に使用されます。...

エンドヌクレアーゼベースの部位特異的DNA損傷の可視化と定量化

ここでは、CD4プロモーター近傍の二本鎖切断修復に関連する変異を同定するために使用できるsgRNA/CAS9エンドヌクレアーゼおよび次世代シーケンシングプロトコルを紹介します。...

次世代シーケンシングを使用して、CD4プロモーター近傍のCAS9誘導二本鎖切断の修復に関連する変異を同定

D-ループキャプチャー(DLC)およびD-ループ伸長(DLE)アッセイは、近接ライゲーションの原理と定量的PCRを利用して、...

出芽酵母における近接ライゲーションと定量PCRによる相同組換え中間体の検出

ここでは、核酸代謝酵素をアッセイするためのプロトコールを、リガーゼ、ヌクレアーゼ、およびポリメラーゼ酵素の例を用いて提示する。このアッセイでは、蛍光標識および非標識オリゴヌクレオチドを組み合わせて、RNAおよび/またはDNAの損傷または経路中間体を模倣した二本鎖を形成することができ、酵素の挙動の特性評価を可能にします。...

修飾合成オリゴヌクレオチドを用いた核酸代謝酵素のアッセイ

私たちは、一連の発光ベースの染色体外レポーター基質を使用して、細胞内の二本鎖切断修復経路の習熟度を評価するためのプロトコルを提示します。...

ハイスループットで定量的な発光ベースのレポーターアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復活性の評価

学ぶ 分子ビーコンを用いた塩基除去修復活性のリアルタイム定量法。DNAグリコシラーゼとAPエンドヌクレアーゼ活性を細胞核抽出物で測定し、DNA損傷応答の動態解析やがん研究への応用が可能です。

病変の特異的分子ビーコンを活用した細胞ライセート中の塩基除去修復活性の定量、リアルタイム分析

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