組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

エレクトロ足場は、組織工学アプリケーションのためのポストプロダクションを処理することができます。ここでは、複雑な足場を回転するためのメソッドを（連続した回転で）記述し、厚い足場（マルチレイヤーによる熱を使用するか、水蒸気アニール）を行うために、無菌性（無菌製造又は殺菌のポストプロダクション）を達成するために、適切な生体力学的特性を達成するために。

この手順の目的は、滅菌して十分に厚くし、臨床組織工学に適した機械的強度を持つ電気紡糸生分解性足場を製造することです。これは、生分解性ポリマーを最初に電気紡糸して、ランダムまたは依存型で配向性または順次層状の一次構造にすることで達成されます。2番目のステップは、いくつかの層を一緒にして滅菌することにより、足場に紡糸後の修正を適用することです。

次に、細胞をスキャフォールドに導入し、培養中および培養後の細胞の性能を評価します。最後のステップは、細胞を移植の準備をするために、細胞が体内で遭遇する生理学的ストレスを模倣する運動レジームに細胞をさらすことです。最終的には、運動に対する細胞の反応を、細胞が動的張力に応答して細胞外マトリックスを生成することで評価することができます。

この技術は汎用性と柔軟性があり、必要な用途に合わせて特別に変更された特性を持つ多種多様な足場を作ることができます。例えば、足場は、重度の火傷を負った患者の広範な皮膚喪失の置換や、がんや外傷後の損傷した口腔粘膜の修復など、組織の修復が必要な困難な状態を治療するように設計することができます。このビデオでは、動的ストレスのマーカーとして細胞の持続的な産生を示していますが、運動細胞または非運動細胞を使用して細胞生物学の他の多くの側面を評価するだけでなく、さまざまな細胞外マトリックスタンパク質を検討することもできます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、エレクトロスピニングプロセスが多くの変数の影響を受けるため、再現性のある足場を得るのに苦労します。エレクトロスピニング足場の加工を視覚的に実演することは、重要です。それはめったに議論されません。

この技術を臨床で成功裏に適用するためには、プロセスの知識が必要です。まず、回転するマンドレルコレクターをアルミホイルでコーティングし、光沢のある面を外側に向けてコーティングします。次に、目的のポリマーを5ミリリットル充填した5ミリリットルの注射器を4つ置きます。

ここでは、ポリ乳酸がシリンジポンプに使用されます。シリンジあたりの流量を毎分40マイクロリットルに設定し、針先からマンドレルまでの作動距離を17センチメートルに設定します。次に、シリンジの針をプラス17、000ボルトに充電し、適切な距離からアルミホイルコーティングされたマンドレルにエレクトロスピンして、整列した繊維を接着します。

ランダムファイバーのmanlを1000RPMで回転させます。マンルを200RPMで回転させます。エレクトロバンの足場は、PHBVロータスの2番目のポリマーをエレクトロスピニングした後、少なくとも4ヶ月間乾燥剤の存在下で摂氏4度のシール容器内のアルミホイルに保管できます。

再びここで。PLAは、PHBVの上に層状化を示し、そのポリマースピンのパラメータと通常の条件を使用しています。ここでも、この添加剤プロセスにより、二重層の足場が構築され、ヒーターによって多層の足場が生成される二重層が生成されます。

ひざまずく PLGAを4枚重ねて置き、ひざまずいて60°Cで3時間加熱すると、蒸気ひざまずくことで多層の足場ができます。適切なサイズの容器に10ミリリットルのDILUメタンまたはDCMを注ぎます。次に、4枚のPLGAを重ねて置き、DCMの2センチメートル上に吊り下げます。

最後に、容器を室温で1時間密封して、エレクトロスピニングによる無菌足場製造を実現し、DCMでのインキュベーションによって滅菌された医療グレードのポリマーを溶解し、次にエレクトロで溶解します。ポリマー溶液を滅菌したマンドレルに巻き付けた滅菌ホイル上に回転させます。次に、滅菌されたラナーフローフードで、足場を抗生物質を含まない増殖培地で適切な期間インキュベートし、実験的なエタノール消毒ごとにサンプルの無菌性を確認します。

足場をエタノールと蒸留水溶液に15分間入れます。過酢酸滅菌用。足場をパラセチン酸とPBS溶液に3時間浸します。

ガンマ線滅菌用の室温で、まずセシウム源を用いて3キログレイの線量を足場に照射し、足場を5ミリメートル×20ミリメートルの長方形に切断します。次に、マイクロメーターを使用して足場の厚さを測定します。次に、長方形をBose electro force 3, 100インストゥルメントに配置します。

荷重対変位からヤング率と弾性を、装置によってプロットされた応力ひずみ曲線として計算します。まず、細胞を播種する前に、細胞を蛍光色素で標識します。次に、コンフルエンス、ヒト真皮線維芽細胞をトリプシンとEDTAで摂氏37度で5分間インキュベートします。

次に、分離した細胞を室温でGの150倍で10分間スピンダウンし、ペレットを5ミリリットルのDMEMに再懸濁します。カウント後、播種用の細胞濃度を調整し、細胞を足場に播種します。次に、標識された足場の表面を蛍光顕微鏡で画像化して、細胞の浸透を調査します 足場の奥深くまで、多光子共焦点顕微鏡を使用することができます。

これにより、細胞の有無にかかわらず、ほとんどの足場に約200ミクロンの浸透を達成できます。次に、播種した足場を培養した後、サンプルをPBS中の1ミリリットルのホルムアルデヒドに摂氏37度で20分間固定します。固定後、サンプルを1ミリリットルのPBSで3回洗浄し、次に各サンプルを200マイクロリットルのエラスチン一次抗体で37°Cで30分間インキュベートします。

1ミリリットルのPBSでサンプルをさらに3回洗浄し、DPIを含むPBSの二次抗体溶液でサンプルを30分間インキュベートします。最後に、PBS画像でサンプルを最後にもう一度洗浄した後、DPIには365ナノメートルの励起と460ナノメートルの寛解、二次抗体には480ナノメートルの励起と533ナノメートルの寛解を使用して、蛍光顕微鏡でサンプルを洗浄します。まず、流量調整装置とバルーンをオートクレーブで処理し、次にクリーンルームで、電気紡糸の位置にある層流フードで装置を開梱します。

次に、PBSで満たされた50ミリリットルの注射器を三方タップの分岐パイプに接続し、バルーンをPBSで膨らませます。次に、目的のポリマーをバルーン上でエレクトロスピンします。通常の回転条件と10cmの作動距離を使用すると、濡れた繊維はバルーンの表面に付着するのに十分な粘着性があり、その後剥がれることはありません。

足場が乾燥したら、バルーンを滅菌容器に入れ、次いで容器を細胞培養に適した薄層流フードに輸送する。膨張したバルーンの足場で細胞を培養し、細胞を生体力学的条件付けにさらすことは、この手順の最も難しい部分です。できるだけ多くの細胞を足場に付着させるためには、バルーンを細胞溶液で繰り返し基底させることが不可欠です。

これには約 20 分かかることがわかりました。フード内で、バルーンを容器から取り出し、ここで使用するペトリ皿などの滅菌面に置き、コーティングされたバルーンに細胞懸濁液を20秒ごとに20分間ピペットで取り付けて、バルーン表面に細胞を均一に分布させようとします。次に、バルーンを培養容器に戻し、細胞タイプに適したプレウォーム培地を追加します。

最後に、インフレーション装置をシリンジポンプに接続し、必要に応じてバルーンを膨らませたり収縮させたりして、二軸膨張を与えます。コンピュータ制御のシリンジポンプを使用して、より複雑な拡張レジームを達成することができます。エレクトロスピニングは、ランダムで秩序立ったアーキテクチャを持つ足場を作成するために利用できます。

これは再現性があり、繊維は均一です。たとえば、垂直繊維は、箔を90度回転させて整列した繊維のセットをアルミ箔上にエレクトロスピニングし、すぐにその上に2番目の整列したファイバーのセットをエレクトロスピニングすることで作成できます。多くの種類のポリマーは、ここでP-L-A-P-H-B-V-P-C-LとPLGAのために示されているように、かなり異なる特性で電光紡糸することができます。

PHBVは、5〜20ミクロンサイズのビーズをナノファイバーでつなげたパールネックレスとして紡がれています。ここでは、最初に足場をPHBVを使用して回転させ、次に注射器にPLAを充填し、PHBV足場の上で回転させました。これらの画像は、代表的な単一のPHBVおよびPLA層を示しています。

この画像は、高密度のナノ繊維性パーネックレス、PHBV層、およびより開放的なマイクロ繊維状PLA層を備えたA-P-H-B-V-P-L-A二重層の断面が、3つの足場タイプすべてが細胞の接着と増殖を促進するように見えることを示しています。より厚い足場が必要な場合は、次のいくつかの画像に示すように、蒸気とヒーターのひざまずきを使用して足場の層を融合できます。ひざまずいた足場の層は層間剥離せず、層間の接合部を見つけるのが非常に難しい場合があります。

この画像は、約150ミクロンの初期繊維質足場が一緒に配置された、蒸気とひざまずいたPLA足場を通るセクションを示しています。そして、DCM蒸気を使用して、最大500ミクロンのはるかに厚い足場を作りました。この画像は、約2倍で蒸気ゼロ二重層の同じセクションを示しています この画像の前の倍率は、足場がヒーターによって作成された薄い繊維の層と分散したはるかに厚い繊維の層で構成されている方法を観察します、細い繊維と厚い繊維の層を一緒にひざまずかせて、複雑な機械的特性の足場を生成します。

繰り返しになりますが、この画像は、同じヒーターがひざまずいた足場を4回示しています。層膜による以前の拡大は、異なる細胞タイプで行うことができ、2つの異なる蛍光細胞トラッカー色素で着色されたヒト真皮線維芽細胞のこれらの画像で示されているように、それぞれが混ざり合うことなく別々の膜で培養されます。最初の画像は、エレクトロバンPLAの線維芽細胞です。

細胞を固定して染色し、ここで汚れた線維芽細胞をエレクトロスバンPHBVに播種しました。この実験では、線維芽細胞をバイタル色素セルトラッカーグリーンで染色しました。セルは二重層のPLA側にあることに注意してください。

この画像は、下部のPHBV表面に赤色に染色された線維芽細胞、上部PLA表面に緑色の染色された線維芽細胞を持つ二重層を通る代表的なセクションです。この画像では、A-P-H-B-V表面で成長しながらセルトラッカーレッドで染色された線維芽細胞。したがって、重要な蛍光色素の使用は、細胞がまだ成長している間に足場上の細胞の分布を調べるための便利な方法論を提供します。

滅菌方法は、足場とその後の細胞培養に影響を与えます。この折れ線グラフは、パラセチン酸、ガンマ線照射、およびエタノールがA PLGの極限引張強度とヤング率に及ぼす影響を示しています。足場。

それぞれの滅菌方法では、足場の極限引張強度と弾性が変わります。これらの足場で細胞を培養すると、極限引張応力がさらに減少しますが、弾力性は増加します。この棒グラフは、滅菌方法が個々の足場の繊維径に及ぼす影響を示しています。

ガンマ線照射は繊維径に大きな影響を与えませんが、パラセチン酸とエタノールは繊維径を約50%減少させますしたがって、無菌足場を達成するための最良の方法は、無菌条件下でそれらを製造することです。この最後の一連の画像は、細胞が動的膨張中も生存可能であり、エラスチンの量も増加していることを示しています。代謝指標で検出されたように、成長する細胞によって生成される濃い青色の発達に注意してください。MTTです。

ここで、バルーン上で培養し、二軸膨張に供した青色の細胞は、緑色染色で示されるようにエラスチン繊維を発達させた。これは、同じ細胞が同一のバルーン足場の静的条件下で維持される場合のエラスチンの欠如とは著しく対照的です。この手順に続いて、静的培養や足場内の細胞の流体の流れなどの他の方法を実行して、細胞が異なる培養条件にどのように応答するかを調べることができます。

膨らませることができるバルーンの足場の上で細胞を培養する開発は、組織工学の分野の研究者が今、組織工学的構築物の細胞の動的コンディショニングの効果を探求するための道を開いたため、非常に有用であることが証明されています。 レーザー、および人間の細胞は危険であり、適切なトレーニングを行う必要があり、この手順を実行するときは常に予防措置を講じる必要があります。