組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

本手順の目的は、滅菌可能であり、臨床的な組織工学に適した厚さと機械的強度を持つ、電界紡糸による生分解性スキャフォールドを作製することです。まず、生分解性ポリマーを電界紡糸し、ランダムな構造、あるいは配向した構造、または順次積層した構造の一次構造体を形成します。次に、複数の層を重ね合わせて積層させ、滅菌を行うことで、スキャフォールドに紡糸後の修飾を施します。

次に、細胞をスキャホールドに導入し、培養中および培養後の性能を評価します。最終ステップとして、移植に向けた準備のため、生体内で細胞が直面する生理学的ストレスを模倣したエクササイズレジメンを細胞に課します。最終的に、動的張力に応じて細胞が産生する細胞外マトリックスを測定することで、エクササイズに対する細胞の反応を評価できます。

この手法は汎用性と柔軟性に優れており、必要とされる用途に合わせて特性を特異的に修飾した多種多様なスキャフォールドを作製することが可能です。例えば、重症熱傷患者における広範囲な皮膚欠損の置換や、癌または外傷後の損傷した口腔粘膜の修復など、組織修復を要する困難な病態の治療に向けたスキャフォールドを設計できます。本ビデオでは、動的ストレスのマーカーとして細胞の持続的な産生を示していますが、運動負荷をかけた細胞および非負荷細胞を用いて、さまざまな細胞外マトリックスタンパク質を検討したり、細胞生物学の多くの他の側面を評価したりすることも可能です。

一般的に、この手法に慣れていない方は、電界紡糸プロセスが多くの変数に影響されるため、再現性のあるスキャフォールドを得ることに苦労します。紡糸後の電界紡糸スキャフォールドの処理工程を視覚的に示すことは重要ですが、ほとんど議論されていません。

この手法を臨床でうまく適用するためには、そのプロセスの知識が不可欠です。まず、回転マンドレルコレクターを、光沢のある面を外側にしてアルミホイルでコーティングします。次に、目的のポリマーを5 mL充填した5 mLシリンジを4本用意します。

ここでは、ポリ乳酸をシリンジポンプに使用します。流量をシリンジあたり40 µL/minに、針先からマンドレルまでの作業距離を17 cmに設定します。次に、シリンジ針に+17,000 Vを印加し、適切な距離からアルミ箔でコーティングしたマンドレル上に電界紡糸を行い、配向繊維を作製します。

ランダムな繊維を得るために、マニエルを 1000 RPM で回転させます。次に、マニエルを 200 RPM で回転させます。電界紡糸された PHBV Lotus 第二ポリマーのスカフォールドは、乾燥剤と共に密閉容器に入れ、アルミ箔の上に載せて 4 °C で少なくとも 4 ヶ月間保存可能です。

ここでも同様です。PHBVの上にPLAを積層させており、そのポリマー紡糸におけるパラメータおよび通常条件を使用しています。繰り返しになりますが、この添加プロセスによってスキャフォールドの二重層が構築され、ヒーターを用いて多層スキャフォールドを形成するためのバイレイヤーが作成されます。

4枚のPLGAシートを重ね合わせ、60 °Cで3時間加熱し、蒸気アニーリングによって多層スキャフォールドを作製します。適切なサイズの容器に10 mLのジクロロメタン（DCM）を注ぎます。次に、4枚のPLGAシートを重ねて、DCMから2 cm上の位置に吊り下げます。

最後に、電界紡糸による無菌的なスキャフォールド作製を行うため、コンテナを室温で1時間密封します。DCM中でインキュベーションにより滅菌した医療用ポリマーを溶解させ、電界紡糸を行います。滅菌したマンドレルに巻き付けられた滅菌フォイル上にポリマー溶液を紡糸します。その後、滅菌済みの層流クリーンベンチ内で、エタノール消毒による実験的なサンプルの無菌性を確認するため、抗生物質を含まない増殖培地中で適切な期間、スキャフォールドをインキュベートします。

スキャフォールドをエタノールと蒸留水の混合液に15分間浸します。過酢酸滅菌を行うため、スキャフォールドを過酢酸とPBSの溶液に3時間浸漬します。

ガンマ線滅菌のため、まずセシウム線源を用いて3 kGyの線量でスキャフォールドを照射し、その後、スキャフォールドを5 mm × 20 mmの長方形に切断します。次に、マイクロメーターを使用してスキャフォールドの厚さを測定します。その後、長方形の試料をBose ElectroForce 3100装置に設置します。

装置によってプロットされた荷重対変位の応力-ひずみ曲線から、ヤング率と弾性を算出します。まず、細胞を播種する前に、蛍光染料で細胞をラベルしてください。その後、コンフルエントなヒト皮膚線維芽細胞を、トリプシンおよびEDTAを用いて37 °Cで5分間インクベートします。

その後、剥離した細胞を室温で150 ×gで10分間遠心分離し、ペレットを5 mLのDMEMで再懸濁します。細胞数をカウントした後、播種用に細胞濃度を調整し、細胞をスキャフォールドに播種します。次に、蛍光顕微鏡を用いてラベル化したスキャフォールドの表面を撮影し、細胞の浸透具合を調べます。スキャフォールドのより深部を調べるには、マルチフォトン共焦点顕微鏡を使用できます。

これにより、細胞の有無にかかわらず、ほとんどのスキャフォールドに対して約200 micronの浸透を達成できます。次に、播種したスキャフォールドを培養した後、サンプルをPBSで調製した1 milliliterのホルムアルデヒド中で37 °Cで20分間固定します。固定後、サンプルを1 milliliterのPBSで3回洗浄し、各サンプルを200 µLのエラスチン一次抗体中で37 °Cで30分間インキュベートします。

サンプルを1 mLのPBSでさらに3回洗浄し、DPIを含むPBSベースの二次抗体溶液中で30分間インキュベートします。最後に、サンプルをPBSで一度洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて、DPIには365 nmの励起光と460 nmの放出光を、二次抗体には480 nmの励起光と533 nmの放出光を用いて画像を撮影します。まず、流量調節装置とバルーンをオートクレーブで滅菌し、次にクリーンルーム内のラミナーフローフード内で、電界紡糸に適した位置に装置を設置します。

次に、PBSを満たした50 milliliterのシリンジを三方コックの分岐管に接続し、バルーンが膨らむまでPBSを注入します。ここで、目的のポリマーをバルーン上に電界紡糸します。通常の紡糸条件および10 centimetersの作動距離を用いることで、湿潤繊維が十分な粘着性を持ち、その後剥離することなくバルーンの表面に付着します。

スキャフォールドが乾燥したら、バルーンを滅菌容器に入れ、細胞培養に適したラミナーフローフードへ運搬します。生体機械的コンディショニングを細胞に課すために、拡張させたバルーン上のスキャフォールドで細胞を培養することは、本手順の中で最も困難な部分です。できるだけ多くの細胞をスキャフォールドに付着させるため、細胞懸濁液でバルーンを繰り返し浸すことが不可欠です。

この操作には約20分かかります。クリーンベンチ内で、容器からバルーンを取り出し、ここに使用しているペトリ皿のような滅菌済みの表面に置きます。そして、細胞をバルーン表面に均一に分散させるため、20秒ごとに細胞懸濁液をコーティングされたバルーンにピペッティングし、これを20分間繰り返します。その後、バルーンを培養容器に戻し、細胞種に適した予熱済みの培地を添加します。

最後に、膨張装置をシリンジポンプに接続し、必要に応じてバルーンを膨張および収縮させて二軸延伸を行います。より複雑な延伸レジメンを実現するには、コンピュータ制御のシリンジポンプを使用できます。また、エレクトロスピンニングを利用して、ランダムまたは整列した構造を持つスキャフォールドを作製することが可能です。

この手法は再現性があり、得られる繊維は均一です。例えば、アルミ箔を90度回転させて一組の配向繊維をエレクトロスピニングし、直ちにその上に二組目の配向繊維をエレクトロスピニングすることで、垂直方向に交差する繊維を作成できます。多くの種類のポリマーをエレクトロスピニングでき、特性はここで示したP-L-A-P-H-B-V-P-C-LおよびPLGAのように大きく異なります。なお、P-L-A-P-C-LおよびPLGAはいずれも微細繊維状の均一なスキャフォールドとなります。

PHBVは、5〜20 µmサイズのビーズをナノファイバーで繋いだパールネックレス状に紡糸されます。ここでは、まずPHBVを用いてスキャフォールドを紡糸し、その後シリンジにPLAを満たしてPHBVスキャフォールドの上に紡糸しました。これらの画像は、代表的なPHBV単層およびPLA単層を示しています。

この画像は、高密度のナノ繊維状パーネックレス、PHBV層、およびよりオープンなマイクロ繊維状PLA層からなるA-P-H-B-V-P-L-A二層構造の断面図を示しています。これら3つのスキャフォールドタイプはすべて、細胞の接着と増殖を促進します。より厚いスキャフォールドが必要な場合は、次に続くいくつかの画像で示すように、蒸気およびヒーターによるニーリングを用いてスキャフォールドの層を融合させることができます。ニーリング処理されたスキャフォールド層は剥離せず、層間の接合点を見つけることは非常に困難になります。

この画像は、約150 µmの初期繊維状スキャフォールドを重ね合わせ、その後DCM蒸気を用いて最大500 µmまでのより厚いスキャフォールドを作成した、蒸気およびニール処理済みPLAスキャフォールドの断面を示しています。この画像は、同じ蒸気ニール二層構造の断面を、前の画像の約2倍の倍率で示したものです。この画像から、スキャフォールドが非常に厚い繊維の層と、加熱処理によって作成されたより細い繊維の層が分散して構成されていることが分かります。このように細い繊維と厚い繊維の層を重ね合わせることで、複雑な機械的特性を持つスキャフォールドが作製されます。

ここでも、同一のヒーターニールド・スキャフォールドを4つの倍率で示しています。層状膜による前述の拡大は、異なる細胞型を用いて行うことができ、これらの2種類の異なる蛍光細胞トラッカー染料で染色されたヒト真皮線維芽細胞の画像で示されているように、各細胞を混在させることなく個別の膜上で培養することが可能です。最初の画像は、エレクトロスブンPLA上の線維芽細胞です。

細胞を固定し、染色しました。ここでは、染色した線維芽細胞を電紡PHBV上に播種しました。この実験では、線維芽細胞をあらかじめ生細胞用染料のCellTracker Greenで染色しています。細胞は二層膜のPLA側に存在していることに注意してください。

この画像は、下層のPHBV表面に赤色で染色された線維芽細胞が、上層のPLA表面に緑色で染色された線維芽細胞が配置された、二層構造の代表的な断面図です。この画像では、A-P-H-B-V表面で増殖している間に、線維芽細胞をCell Tracker Redで事前染色しています。したがって、生細胞用蛍光色素を用いることで、細胞がまだ増殖している段階で、スキャフォールド上の細胞分布を確認できる便利な手法が提供されます。

滅菌方法は、スキャフォールドおよびその後の細胞培養に影響を与えます。この折れ線グラフは、過酢酸、ガンマ線照射、およびエタノールが、PLGスキャフォールドの最大引張強度およびヤング率に及ぼす影響を示しています。

各滅菌方法は、スキャフォールドの最大引張強度および弾性に影響を与えます。これらのスキャフォールド上での細胞培養は、最大引張応力をさらに低下させますが、弾性は向上させます。この棒グラフは、個々のスキャフォールドの繊維径に滅菌方法が及ぼす影響を示しています。

ガンマ線照射は繊維径に有意な影響を与えませんが、過酢酸とエタノールは繊維径を約50%減少させます。したがって、無菌的なスキャフォールドを得るための最善の方法は、無菌条件下で製造することです。最後の画像シリーズでは、動的伸展中も細胞が生着しており、エラスチンの産生量も増加していることが示されています。代謝指標であるMTTで検出された、増殖細胞によって生じた濃い青色の発色に注目してください。

ここでは、バルーン上で培養され、二軸延伸にさらされた青色の細胞において、緑色の染色で示されるエラスチン線維が形成されたことがわかります。これは、同一のバルーン足場上で静止条件下で維持された場合の、エラスチンの欠如とは著しい対照をなしています。この手順に続き、静止培養や足場内細胞への流体フローなどの他の手法を実施することで、細胞が異なる培養条件にどのように反応するかを調査することができます。

膨張可能なバルーン上のスキャフォールドで細胞を培養する手法の開発は、組織工学分野の研究者が、組織工学構築物における細胞の動的コンディショニングの効果を探索することを可能にしたため、非常に有用であることが証明されています。高電圧電源、溶媒、レーザー、およびヒト細胞の取り扱いは危険を伴う可能性があるため、本手順を実施する際は、常に適切なトレーニングを受け、十分な予防措置を講じてください。