単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

次の実験の全体的な目的は、細菌に接着性を与えて、液体媒体からの分離を容易にすることです。これは、まず、複雑な遺伝的調節を回避し、粘着性ポリマーを簡単かつ大量に生産できるように合成カーリーを設計することで達成されます。第2のステップとして、付着性細菌をポリスチレン上で可視化および定量化することで、合成デバイスの効率を迅速に推定することができます。

次に、付着性細菌を共焦点顕微鏡でガラス上に可視化します。バイオフィルムを直接観察し、その構造に関する情報を得るために、接着率、パーセンテージ測定、顕微鏡観察の両方に基づいて、合成デバイスを保有する菌株の接着が有意に増加したことを示す結果が得られます。合成生物学のアプローチが従来のクローニングのような既存の方法よりも優れている点は、適切なシグナルを持つ絶対的に明確な必要な遺伝子のみを含むコンストラクトを非常に迅速に取得できることです。

この方法は、放射性廃棄物から金属を充填した細菌を除去するという課題に対処するなど、バイオレメディエーション分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな人は、遺伝的制御シグナルやデータベースの取り扱いに関する基本的な知識が必要なため、苦労します。ビジュアルデモンストレーションでは、バイオフレームの脆弱性のためにこれら2つのステップを学ぶのが非常に難しいため、バイオフィルムの定量化と視覚化に焦点を当てます。

合成キャロンを設計するための最初のステップは、カーリー遺伝子の遺伝的組織を決定し、それらの内因性、転写、および翻訳シグナルを局在化することです。これは、REON DBやeco geneなどの専用データベースを使用して実現されます。次のステップは、カーリー合成、CSGBおよびCSGAに絶対に必要な5つの遺伝子を選択し、ファイバーモノマーをコード化し、C-S-G-E-C-S-G-FおよびCSGGはカール分泌複合体をコード化し、データベースから選択した配列をより高速な形式で抽出しますデータ管理と、C-S-G-G-F-Eクラスターが大腸菌ゲノムのアンチセンスであるため、クローンマネージャーソフトウェアを使用してインシリコ事前分析が実行されます。

このシーケンスは、逆補数に対応するものに変換する必要があります。クローンマネージャーツールの操作プロセス分子反転分子を使用し、関数ライゲートを使用してC-S-G-B-Aの後ろにC-S-G-E-F-G配列を貼り付けます。次に、C-S-G-B-A-E-F-G iCal 配列の前に適切なプロモーター PRCN を追加します。

RCN遺伝子座は、ニッケルとコバルトの解毒を担当するFLXポンプRCNAと、その同族メタロレギュレーターRCNRをコードしています。コバルトまたはニッケルが存在しないと、リプレッサーRCNRはDNA上のRCNRボックスに結合し、下流遺伝子の完全な転写活性化を防ぎます。コバルトまたはニッケルの細胞内濃度が上昇すると、コバルトまたはニッケルのRCNRタンパク質への結合により、リプレッサーのプロモーターへの固定が妨げられ、選択された5つのカーリー遺伝子をプロモーターの制御下に置くことにより、P-R-C-N-Aの転写活性が増加します。

PRCNカーリーは、コバルトとニッケルの存在下で過剰に生成されると予測されています。その後、CS gba、DNA配列の最初のA TGの前に完全なリボソーム結合部位またはRBSを追加し、C-S-G-E-F-G配列の前に2番目の完全なRBSを追加することで、転写シグナルを最適化します。I GMの基準に適合させるには、ECO R oneとX-bar oneの制限サイトを含む標準のバイオブロックプレフィックスと、SPE oneとPST oneの制限サイトを含むサフィックスをデバイスに隣接させて、さらなる組み立てを容易にする必要があります。

バイオブリック部品自体には、ECO R 1つ、PST 1つ、SPE 1つ、X-bar R 1 認識サイトが含まれていてはなりません。したがって、これらの部位は、デバイスのシリコ制限解析におけるサイレント突然変異変化によって排除され、1つのPST、1つのCSGA配列の1つのサイト、1つのPSTがRCNR配列の1つのサイト、および1つのECOR遺伝子がCSGE遺伝子に明らかになりました。これらの部位はサイレント突然変異によって修飾されました。

合成oporのデザインが完了したら、クローンマネージャーソフトウェアを使用してトランスレーションシミュレーションを実行します。M 63の2ミリリットル、0.2%グルコースの最小培地を持つ24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルでこの手順を開始するために、野生型のカーリータンパク質と合成によってコードされたタンパク質との間の完全な相同性を確認するために、シーケンスアライメントプログラムブラストを使用して、一晩の細菌培養の6つの細胞に10を各ウェルに接種します。24ウェルプレートの各列を振ることなく、摂氏30度で18〜48時間細菌を増殖させるモダリティを表します。

必要に応じて、適切な量のコバルトと抗生物質が追加されます。最初の3行は、3回の繰り返しを平均化することにより、A付着菌を定量するために使用されます。左端の列は、18〜48時間後にクリスタルバイオレット染色によってバイオフィルムを視覚化し、24ウェルプレートの最初の3列から各ウェルからプランクトン細胞を含む仰过を回収し、仰臥位を溶血チューブに移すために使用されます。

各ウェルを1ミリリットルのM 63培地で慎重にすすぎ、最初のsupinateで溶血チューブ内の洗浄液を引っ張ります。このプールはSという名前の遊泳細胞と呼ばれ、マイクロプレート内のウェルの底は付着細胞で覆われています。バイオフィルムを回復するには、それぞれに1ミリリットルのM63を追加します。

ピペットの先端でよくこすり落とし、次にピペットを上下に動かして、バイオフィルム画分を新しい溶血チューブに移します。チューブを15秒間ボルテックスします。溶血チューブにバイオフィルム画分を採取します。

このプールは、Bと名付けられた表面付着細胞を表しており、溶血チューブから96ウェルプレートに200マイクロリットルの仰臥位およびバイオフィルム画分を転写します。600ナノメートルの光学密度から、付着した細菌と遊泳する細菌の数を推定します。各モダリティのアドヒアランスの割合は、式B×100をSの3倍で割って計算 B.To、24の最後の行のみのバイオフィルムを視覚化し、ウェルプレートはそれらのウェルからプランクトン細胞を廃棄します。

各ウェルに1ミリリットルのM 63を加えて、プレートの底に発生したバイオフィルムをすすぎます。1時間後に蓋をしていないプレートを摂氏80度で1時間乾燥させ、各ウェルに20%クリスタルバイオレットの100マイクロリットルを2つずつ加え、続いて水で広範囲に洗浄します。このプロトコルには蛍光シャーシが必要です。

合成カーリーを装着したプラスミドに適した宿主は、大腸菌SCC one株であり、これは親株MG 1 16 55と観察可能な差なく緑色蛍光タンパク質を構成的に発現する。合成カーリを担持したパック57プラスミドでホスト株を形質転換し、S 23株を得る。コントロールプラスミドパック18を用いて宿主株を形質転換し、コントロール株を得る。

S 24は、S 23およびS 24株のプレカルチャーを摂氏30度で一晩で増殖させます。翌日にグルコースとアンピシリンを補給したM 63培地に、20ミリリットルのM 63培地をペトリ皿に加え、次いでペトリ皿中の15ミリリットルのM 63に100マイクロリットルのプレカルチャーを接種する。適切な濃度のコバルトを追加し、コバルトなしのネガティブコントロールを忘れないでください。

各ペトリ皿に3つの長方形のガラスカバースリップを導入します。皿を振らずに摂氏30度で一晩インキュベートします。細菌は、翌日に蛍光顕微鏡で直接観察することができます。

サンプルの乾燥を避けることが重要であるため、次の手順は慎重かつ迅速に実行する必要があります。各カバースリップをペトリ皿から取り外し、慎重に水気を切ります。70%エタノールを染み込ませた小さな綿棒で下面を丁寧に拭き取り、共焦点観察のためにすべての細菌残留物を拭き取ります。

カバースリップをスライドガラスに置き、上面をバイオフィルムで覆った面を上にして置きます。次に、バイオフィルムを大きなカバースリップで覆い、ガラスに固定します。ニスでスライドさせます。

セットアップを反転させて、バイオフィルムが顔下に表示されるようにします。この実験では、セットアップを共焦点レーザー顕微鏡の下に置きます。CTマイクロプラットフォーム内では、Zeiss LSM five 10メタ共焦点レーザー顕微鏡が使用されています。

40倍油浸対物レンズを選択します。以下の設定を使用して、GFPを4 88ナノメートルで励起し、500〜600ナノメートルの範囲で細菌の蛍光を収集します。40倍油浸対物レンズを使用して画像を取得します。

レーザースキャン共焦点モード。バイオフィルムの固体表面から成長培地との界面までの全体的な三次元構造をスキャンします。1ミクロンのステップを使用。

mausソフトウェアで3次元投影を行い、統計的な縦断面に沿った平均C値を解析することでバイオフィルムの厚さを決定します。バイオフィルムの定量化により、共焦点Zスタックからバイオボリュームを抽出できます。金属に応答して巻き毛を過剰に生成するように設計された大腸菌の接着能力は、簡単な方法で評価できます。

例えば、よく研磨された24枚のアイリーンプレートにクリスタルバイオレット染色を施すと、紫色の濃さの違いが示すように、各ウェルの底部でのバイオフィルム形成を迅速に可視化することができます。野生型株は、改変株よりも接着性が低いようです。定量的な方法は、野生型のポリスチレンと、さまざまな濃度のコバルトを含む改変株の付着率を測定することです。

このグラフに示されている結果は、コバルトの非存在下で、遺伝子組換え株の付着率が野生型株のそれよりも1.5倍高いことを示しています。さらに、コバルト濃度が25マイクロモルまたは50マイクロモルの接着操作細胞がそれぞれ30%および40%に達する培地において、コバルト濃度の増加存在下での接着性の有意な強化が観察された。接着能力は、スライドガラス上で増殖させたGFPタグ付き細菌を用いた顕微鏡法を用いて比較することもでき、黒色の背景に緑色細菌をエピ蛍光顕微鏡で観察すると、遺伝子組換え株はバイオフィルムを形成するのに対し、野生のトリップ菌株は矢印で示されたマイクロコロニーのみを形成することが明らかになります。

共焦点顕微鏡分析は、バイオフィルムの三次元構造の全体像を提供します。上面図の再構成はパネルAに示され、側面図の再構成はパネルBに示されています.その結果、操作された株はより付着性であり、野生型よりも密度が高く厚いバイオフィルムを形成することが確認されています。この手順を試みる際には、例えば、放射性廃水の文脈で改変された大腸菌や占有アリの生物媒介の可能性を調査するために、操作設計を再確認することが重要です。

このビデオを見れば、クローンマネージャーソフトウェアを使用して合成オープンを設計する方法と、細菌株の発話を迅速に定量化する方法について十分に理解できるはずです。合成遺伝子や遺伝子組み換え生物を扱うことは、非常に危険であることを忘れないでください。それらは現在の法律に従っている必要があり、この手順を実行するときは、形質転換細菌のオートクレーブなどの予防措置を常に講じる必要があります。