Name: 単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 学ぶ、合成カーリーオペロンを用いた大腸菌の付着性向上とバイオフィルム形成の可視化手法。共焦点顕微鏡とポリスチレン表面での定量化により、合成生物学的手法の効率性を評価できます。

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我々はリヨン仁のENS IGEMチーム（ヴィヴィアンChansavang、マチルドデュモン、アレクサンドルデュプレイ、メラニージェフロア、クレメンスGonthier、マルゴージョラン、Aurélieハーグ、ゴキのLy、トーマスポアンソ、ベリルロイヤー·ベルトラン、ジュリーSoulaの、マイケルVonzyの他のメンバーに感謝、ピエール·イヴ·ズンデル、Soufiane Bouhmadi、オリビエBrette、ガエルChambonnier、ラウライザド、Aurianne Kroiss、フィリップジューヌ、アニエスRodrigue、アルノーロンドレ、シルヴィーReverchonとヴァレリーDesjardin）、彼らの財政支援（ビオメリュー、Assystem、EDFは、財団のために我々のスポンサークリティカルこの原稿の読み取りとひずみのギフトのための博士のCCセー用INSA、ENS-Lyonとバイオサイエンス仁リヨン学科）、F. Wisniewskiは染料。ドローグBには博士号を受け取る地方ローヌ=アルプからフェローシップ。

1。 CurliオペロンのBiobrickのデザインと合成<ol><li>遺伝子構成を決定し、curli遺伝子の内因性の転写および翻訳シグナルをローカライズします。これらの情報は、RegulonDB aまたはbとEcoGene専門データベースに収集され、適切な出版物を注意深く読むことによって完了します。データ管理とインシリコ preanalysis ではクローンマネージャーソフトウェアCで行われた。 </li><li>適切なコーディング配列を選択します。 curli合成（csgBとcsgAエンコード繊維モノマー）とエクスポート（csgE csgFとcsgG、curlin分泌複合体をコードする）のための5つの絶対に必要な遺伝子のセットが合成オペロンを構築するために選択した。 FASTAフォーマットでデータ·ベースから選ばれた配列を抽出。 csgGFEクラスタは、 大腸菌におけるアンチセンスであるとして大腸菌のゲノムは、その逆相補のcounterpにこのシーケンスを変換するクローンManagerツール操作を使用してアート&gt;プロセスの分子&gt;分子を反転します。関数&quot;ライゲート&quot;（クローン&gt;結紮）を使用してcsgBA背後csgEFGシーケンスを貼り付けます。 </li><li>適当なプロモーターを追加します。プロモーターP RCN、curliの制御下にある5つの選択curli遺伝子を配置することにより、コバルトとニッケルの存在下で過剰生産されると予測されています。 RCN軌跡は、NiおよびCo解毒（rcnA）及びその同族メタロレギュレータ（rcnR）を担当する排出ポンプをコードしている。 RcnRは、NiおよびCo 19に対応してrcnA、独自の遺伝子の発現を制御します。 rcnR CDS を含むRCNシーケンスは 、全体RCN遺伝子間領域プラスrcnAの41第一ヌクレオチドはcsgBAEFGキメラシーケンスのplacedinフロント（ 図1、構造全体の配列は、補足データとして提供される）であった。 </li><li>転写を最適化信号。完璧なリボソーム結合部位（または完璧RBS = AAGGAGGTATATA）がcsgBA DNA配列の最初のATGの前に追加されました。第二完璧RBSはcsgEFG配列の前に追加されました。 csgBとcsgFとcsgG遺伝子に対する内因RBSは保存されていた。 </li><li> IGEM基準に適合するように、デバイスを EcoRIの制限部位、PstIで （接頭辞） および Spe I および Xba I（接尾辞）を含む、標準BioBrick接頭辞と接尾辞により隣接されなければならない。装置Dのそれぞれの端に対応する配列を貼り付けます。 </li><li>任意のEcoRI、PstIで、SPE Iおよびデバイス内のXBA I認識部位を排除する。さらに組立工程を容易にするために、BioBrickパーツ自体はこれらの制限部位のいずれかを含めることはできません。デバイスのin silico制限分析でcsgA配列において、1 PstIでサイト、rcnR配列において、1 PstI部位を明らかにしたcsgE遺伝子と1 EcoRI部位。これらのサイトは、それぞれの位置80（MUT1）、1340（Mut2）とデバイス·シーケンスの1830（Mut3）（補足データ）に置かれ、サイレント突然変異によって次のように変更されました。 CGTCTGで変更CTGCAG MUT1 PstI部位 CAGCAGで変更Mut2 PstI部位CTGCAG GAATTで変更Mut3 EcoRI部位のGAATTC </li><li>クローンManagerソフトウェア（動作&gt;プロセスの分子&gt;翻訳分子）を使用して翻訳シミュレーションを通して実行されます。野生型curliタンパク質や合成オペロンにコードされるタンパク質の間の完全な相同性を確認するために配列アラインメントプログラムBLASTを使用しています。 </li><li>合成オペロンを命ずることができる。商用遺伝子合成サービスは世界中で数多くのメーカーから提供されています、私たちのパートナーはGenecust（ルクセンブルク）であった。人工オペロン（3165 bp）の4μgの数週間後に受信したpUC57（pIG2）に挿入した。 </li></ol>2。ポリスチレンに付着細菌を可視化し、定量化<ol><li> M63最少培地（グルコース0.2％）2mlを24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルを記入し、一晩培養した培養液の106細胞を用いて各ウェルに接種。振とうせずに18から48時間30℃でバクテリアを育てています。各列（4ウェル）はモダリティを表す。必要なときに適切なコバルトの量（25〜100 mM）および抗生物質（アンピシリン100μg.L-1）を追加します 。 24ウェルプレートの3最初の行は3回の繰り返しを平均化することにより、付着細菌を定量化するために使用され、残された最後の行は、バイオフィルムを可視化するために使用されています。 </li><li> 24ウェルプレートの3最初の行の場合 ：各ウェルについて、浮遊細胞を含む上清を回収する。 </li><li>慎重に1 M63 mlのプール2.2で得られた初期上清で1mlの洗浄）で各ウェルを洗浄してください。このプールは、水泳細胞（= S）と呼ばれています。 </li><li> 1ミリリットルoのバイオフィルムを回復こすると上下にピペッティングによるF M63（A = B）。ボルテックス15秒。各モダリティに対応順守率を与えるために600nm以下（OD 600）での光学密度から表面接続およ​​び水泳の細菌の数を見積もります。 </li><li>アドヒアランスの割合は、以下の式を用いて算出しています：BX100 /（3xS A + B）。 </li><li> 唯一 、24ウェルプレートの最後の行の ：浮遊細胞を破棄します。 </li><li> M63プレートの底に開発したバイオフィルムの1ミリリットルで洗浄すること。 </li><li> 80℃で1時間のオープンプレートを乾燥℃に</li><li>よく表面付着細菌を可視化するために、水との広範な洗浄に続いて、それぞれの中で2分間20％クリスタルバイオレットの100μlを添加する。 三つの独立したアッセイ（プレート）は、再現性を確保するために実行する必要があります。 </li></ol> 3。顕微鏡によるガラス上の付着細菌を可視化<ol><li>蛍光シャーシを入手してください。 E. constitutivel 大腸菌 SCC1 電子株yは親株MG1655 20から観察可能な違いは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するプラスミドベアリング合成curliオペロンに適したホストです。 </li><li> S23の株を取得したプラスミドpIG2（=合成curliオペロンはプラスミドpUC57 の EcoRI / PST I部位に挿入）でSCC1を変換します。対照菌株のS24 21を取得するコントロールプラスミド（pUC18に）でSCC1を変換します。 </li><li> S23のと制御の一晩前培養（S24）、30日時点での株°M63グルコースを添加した培地（0.2％）とアンピシリン（100μg.L-1）のCを栽培しています。 </li><li>前培養液100μlを持つペトリ皿内の同じ培地15mlに植菌する。コバルト（ すなわち 25μM）の適切な濃度を追加し、コバルトなしのネガティブコントロールを忘れてはいけません。各ペトリ皿の3角型のガラスカバースリップをご紹介します。振盪せずに30℃で一晩インキュベートする。 </li><li>あちこちにカバースリップを削除シャーレと慎重にドレインメートル。すべての細菌の残留物を拭き取ることにより70℃のエタノールを含浸させた小さな綿のもので、下面を丁寧に清掃してください。共焦点顕微鏡観察のために、カバースリップのさらなる定着を可能にするために数ミリ上で両方の上端部を清掃してください。 </li><li>付着細菌を蛍光顕微鏡下で直接可視化したが、すぐに、しかし慎重にサンプルの乾燥を避けることができます。 </li><li>共焦点顕微鏡観察のために、表向きに配置バイオフィルムで覆われて上面にスライドガラス上にカバースリップを預ける。バイオフィルムは、その後、ワニスをガラススライドに固定されている大規模なカバーガラスで覆われている。バイオフィルムは今下面にすることができるようになるという設定を反転します。 </li><li>共焦点レーザー顕微鏡下でセットアップを置きます。右Axioplan2 LSM510（Zeiss）を共焦点レーザー顕微鏡はPlatimプラットフォームf で使用されていました。 </li><li>設定。エキサイト488nmでGFPおよび範囲内細菌の蛍光を収集する500から600 nmの<html> 。共焦点レーザー走査型モードで画像を取得するために40倍油浸対物レンズを使用しています。 1μm以下のステップを使用して、増殖培地で固体表面からインターフェイスにバイオフィルムの全体的な三次元構造をスキャンします。 </li><li> IMARISソフトウェア（ビットプレン、チューリッヒ、スイス）と3次元投影を行う。統計的縦断面に沿って平均z値の分析によりバイオフィルムの厚さを決定します。別の場所で説明されているように22バイオフィルムbiovolumesの定量化は、共焦点のzスタックから抽出することができる。 </li></ol> RegulonDBは、転写ユニット、プロモーターとそのシグマ型、遺伝子およびそれらのリボソーム結合部位、ターミネーター、特定の転写調節因子の結合部位、ならびに規制フレーズを自分たちの組織にオペロンの組織とその分解についてのメカニズムに関する情報を提供しています。ら= &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp B EcoGeneデータベースは、 大腸菌についての最新情報が含まれて大腸菌 K-12ゲノムおよび広範な遺伝子を含む書誌プロテオーム配列。主要EcoGeneフォーカスが翻訳開始部位の再評価されています。 <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> C <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> dの <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> チュンチャウセー、ナンヤン工科大学、シンガポールの電子ギフト 。 F Platim顕微鏡プラットフォームUMS3444バイオサイエンスジェルラン-リヨンシュッ。

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特別な利害関係は宣言されません。

重要なステップこの合成生物学のアプローチの中で最も重要なステップは、遺伝子の設計です。合成遺伝子の設計は、効率的なシステムの生産を確保するために細心でなければならない。核廃液のバイオ除菌：その分泌系に関与するタンパク質をコードファイバモノマー及び3つの遺伝子をコードする2つの遺伝子は、新規アプリケーションのための新しい機能的なユニットを作成するための強力かつ金属誘導性プロモーターで組み立てられている。計画·予測したように、この装置は、培地中のコバルトの量を増やすことによって補強されて強化された高curli生産につながる。選択されたプロモーター（P rcnA）内の適切な転写シグナル、およびcurli遺伝子の各セット（csgBAとcsgEFG）（ 図3を参照）の前に追加された効率的な翻訳シグナルの両方が存在するから、このような成功の結果。加えて、マルチコピープラスミドと協力して、注目<html>プロモーターの制御に関与してレギュレータのコピー数（s）に支払わなければならない。ここでは、使用されるプロモータ...

非生物的サポートに細菌付着はバイオレメディエーション、生体触媒または微生物燃料電池に大きな役割を果たしている。バイオレメディエーションプロセスは、有機物を分解する微生物の能力を使用したり、金属分布（固定、揮発）、または分化を修正することができます。これらの有益な活動は、水生·陸生生態系ではなく、産業や家庭排水の汚染水を処理するために開発された人工システムで観察されています。微生物の活動の強度や品質はもちろんのこと、微生物のライフスタイル（フリーフローティングまたはバイオフィルム中に埋め込まれている）で、物理化学的要因に依存する。バイオフィルム形成は、多様なメカニズムによって殺生物剤に抵抗性を促進する代謝に関連付けられています。この現象は、したがって、ほとんどのバイオレメディエーションプロセスに奨励される。また、バイオフィルム形成を制御するためのエンジニアリング大腸菌細胞が正常に適用されているバイオチップ2-3全細胞センサーを固定。 金属の高濃度の微生物の適応は、そのような細胞外マトリックス成分への吸着、細胞内に金属を集中することができる排出ポンプまたは特定のキャリアの活性化などの多様なメカニズムを介して行われます。ラグーらによって説明されているように遺伝子工学を介してこれらの細菌の活動を後押しすることは、特に弱い量で毒性の高い金属の場合には、実験室規模での金属汚染を効率的かつ安価な治療を可能にします2008年4。細菌の修復は、このケースでは、イオン交換樹脂を用いた古典的な化学プロセスに比べて競争力のあるコスト削減方法を表しています。著者らは、Eを説明大腸菌シャーシは遺伝のマルチコピープラスミド許可過剰生産と排出ポンプをコードする遺伝子rcnAをノックアウトすることで、次に変換によってコバルト取り込みおよび保持第一のために設計コバルトの選択的取り込みとトランスポーターはこのような歪みは、放射性廃液を治療するために、イオン交換樹脂への効率的な代替として表示されますが、重要な未解決の問題は、プロセス4の終わりに汚染された菌の回復です。私たちの仕事の目的は、ガラスやプラスチックなどの非生物的支持に固執することができるカスタム設計された菌株を設計することであった。 アドヘシンおよびグラム細菌で同定付着線毛の全体のセットの中で、我々はcurli生産を可能にするシステムを設計することを選んだ。 Curliは大腸菌から突出薄い（2-5 nmの直径）と高凝集アミロイド繊維である非結晶性と不溶性マトリックス5月7日として大腸菌やサルモネラ表面。 Curliも無生物表面とバイオフィルム8の開発の植民地化に関与している。 Curliは最近水銀イオン9を結合することが示された。アミロイドは確かに高い有することが知られている例えば、Cu 2 +、Zn 2 +及びFe 3 +の10のような金属イオンに対する親和性。このプロパティには、さらに金属汚染排水の除染が向上する場合があります。 CSGクラスタはcurli繊維の製造を担当し、2発散転写オペロン（ 図1）で構成されている。 csgB、csgAとcsgC遺伝子は 2 curliサブユニット、CsgAとCsgBをコード化して、センスオペロンを構成している。 CsgCはcurli生合成システム内レドックス活性に関与しているように見えるとCsgG孔11動作に影響を与える。しかし、curli生産菌の大部分におけるcsgCの不在は、対応するタンパク質がcurli生合成を制御するための唯一のsecundaryレベルを提供することを示しています。システムを簡素化するために、私たちは、遺伝子の最小数で動作するように選択されています。 csgDEFGは規制と輸送に不可欠なタンパク質をoperonencodesCsgAとCsgBの細胞表面へ。 CsgDはcsgBACオペロンの転写活性化因子であるとcurli線毛、セルロース12など他のバイオ成分の産生を制御することによって阻害すると鞭毛生産13によるバイオフィルム形成の制御において重要な役割を果たしています。 CsgE、CsgFとCsgGは主要curliサブユニット蛋白質CsgAが可溶性タンパク質として分泌され、それを通して外膜におけるcurli固有分泌装置を構成する。 CsgAの重合が膜結合核タンパク質CsgB（14件中）のin vivoで依存しています。いくつかの2成分系を含む複雑な調節経路がcurli遺伝子発現15から16を制御することが示されている。これらの複雑な規制は、細菌が環境手がかりに応答curliの産生を介して厚いバイオフィルムを形成することができますが、産業用アプリケーション向けに、制御するのは困難です。 Metの回復を容易にするために工業プロセス中のアル·ぬいぐるみ細菌、固体支持体への細菌の固定は確かに明確に定義されたパラメータ（s）によって制御される必要がある。 curliの付着特性は、それらのアミロイド性質17にリンクされており、バイオレメディエーションプロセスを改善するために使用することができますが、単純かつ容易に制御されたデバイスを作成する必要があります。 これらの7つの遺伝子18の中でも、curli合成（csgBとcsgAは繊維モノマーをコードする）と輸出（csgE csgFとcsgG、curli分泌複合体をコードする）のための5絶対に必要な遺伝子のセットが合成オペロンを構築するために選択した。 curliの&quot;自然な&quot;規制を逃れるために、強力かつコバルトoverinducibleプロモーターの制御（ 図2）の下で、これらの5 CSG ​​遺伝子を含む合成オペロンを設計し、合成した。 curliコード領域のステップ·バイ·ステップの分析と機能合成するための設計手順断定的なオペロンが記載されている。ポリスチレンやガラスへの細菌付着を可視化し、定量化するための二つの方法が説明されています。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td>合成P RCNを含む3165 bpのEcoRI / PstIフラグメントを持つpUC57（pMB1 ORI、2710 bp）の- csgBAEFGオペロン;アンプR </td></tr><tr><td> pUC18を</td><td></td><td></td><td>アンプR、（pMB1 ORI、2686 bp）を多コピープラスミド</td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1（= GFPタグMG1655は、CCセーの贈り物）/ pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td>のCoCl 2 </td><td>シグマ</td><td></td><td> 0,1 Mのストック溶液は、室温で維持</td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </TD&gt; </tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>ヌンク</td><td> 55429 </td><td>ポリスチレン24ウェルプレート</td></tr></tbody></table>

単一の合成curliオペロンを作成して付着細菌を工学

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

ここで説明する方法は、 大腸菌を再設計することで構成されています強いと金属overinducibleプロモーターの制御下にcurli遺伝子の最小数を組み立てることにより、細菌の付着の結果として生じるゲインを可視化し、定量化における大腸菌の付着特性。この方法では、適切な工学的合成生物学の抽象化と標準化の原則、BBa_K540000 Biobrick（ベスト新Biobrick機器、エンジニアリング、IGEM 2011）の結果を適用します。 最初のステップは、金属に反応して、したがって、野生型株の付着力を高めることにcurli過剰生産に専念して合成オペロンのデザインで構成されています。オリジナルcurliオペロン転写および翻訳シグナルを最適化し、curliの&quot;自然な&quot;規制を逃れるためにin silicoで変更されました。このアプローチでは、成功を収めてcurli生産の私達の現在の理解度をテストすることができました。 Moreoverは、単純な金属調節プロモーターに内因性の複雑なプロモーター（10以上の転写調節因子が同定される）スイッチングによりcurli規制を簡素化すると制御への付着が非常に容易になります。 第二段階は、単純なメソッドの実装によって付着力の定性的および定量的評価が含まれています。これらの方法にかかわらず、バイオフィルム形成に関与する生物学的構造の付着細菌の広い範囲に適用されます。 24ウェルポリスチレンプレートで付着試験は、クリスタルバイオレット染色後の細菌バイオフィルムの迅速な予備可視化を提供します。この定性検査は、アドヒアランスの割合の定量化によって先鋭化することができます。このような方法は非常にシンプルでありながら優れた再現性と再現性の両方で以前に1に記載のように唯一のクリスタルバイオレット染色よりも正確です。蛍光またはレーザーのconfによりスライドガラス上のGFPタグ細菌の可視化OCAL顕微鏡は、現象を直接観察することにより、24ウェルプレート試験で得られた結果を強化することができます。

EのシーケンスをCSG野生型の in silico In アノテーション転写および翻訳シグナルの最適化に関連する大腸菌 K12は、 図3（補足データでフルシーケンス）に示すように、単一の合成curliオペロンP RCN-CSGを設計することができました。プロトコル2とプロトコル3 curli生産に伴うアドヒアランスを可視化し、定量化するために使用された。各ウェルの底部にバイオフィルム形成が急速に可視化することができる、それが紫色の色の強さの違いによって示されるように、野生型株は人工的に作り出された菌株未満付着していることが表示された24ウェルポリスチレンプレートにクリスタルバイオレット染色（protocole 2）を使って（ 図4A）。この定性的なアプローチは、遵守の割合は、人工的に作り出された菌株（ 図4B）で1.5倍高いことが明らかになった定量的な測定によって強化される。定量のさらに精度<html> tiveアプローチは、コ...

分泌装置とcurli繊維構造モノマーの両方をコードする合成オペロンの設計について説明する。これらのアミロイドと接着ポリマーの過剰産生の付着の測定可能なゲインを許可<em&gt; E大腸菌の</em&gt;シャーシ<sup&gt; 1</sup&gt;。アドヒアランスを可視化し、定量化するための簡単​​な方法を説明しています。

単一の合成Curliオペロンを作成して付着細菌を工学

ここで述べる手法は、最小限の数のcurli遺伝子を...の制御下で構築することにより、E. coliの付着特性を再設計することからなります。

本実験の全体的な目的は、細菌に付着性を付与し、液体培地からの分離を容易にすることです。まず、複雑な遺伝子調節を回避し、粘着性ポリマーを容易かつ大量に産生できるように、合成curliを設計します。次に、ポリスチレン上での付着細菌を可視化および定量し、これにより合成デバイスの効率を迅速に推定します。次に、共焦点顕微鏡を用いて、ガラス上に付着した細菌を可視化します。バイオフィルムを直接観察し、その構造に関する情報を得るために、付着率の測定と顕微鏡観察の両方に基づき、合成デバイスを保持する株において付着性が有意に向上した結果が得られます。従来のクローニングなどの既存の手法に対する合成生物学的アプローチの主な利点は、適切なシグナルを持つ、絶対的に必要な遺伝子のみを保持する構築物を非常に迅速に得られることです。この手法は、放射性廃棄物から金属負荷細菌を除去するという課題への対応など、バイオレメディエーション分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、遺伝子制御シグナルに関する基礎知識やデータベースの取り扱い能力が求められるため、この手法に不慣れな方は困難を感じる可能性があります。バイオフィルムは非常に脆弱であるため、その定量化と可視化の2つのステップを習得することが非常に困難であることから、視覚的なデモンストレーションではこれらに重点を置きます。合成カロンを設計するための第一歩は、curly遺伝子の遺伝的構成を決定し、それらの内因的な転写および翻訳シグナルを特定することです。これは、REON DBやeco geneなどの専門的なデータベースを用いて行われます。次のステップは、カロン合成に絶対的に必要な5つの遺伝子を選択することです。CSGBとCSGAは繊維モノマーをコードし、C-S-G-E-C-S-G-FおよびCSGGは curling 分泌複合体をコードします。選択した配列をデータベースからFASTA形式で抽出します。C-S-G-G-F-Eクラスターは大腸菌ゲノムにおいてアンチセンスであるため、Clone Managerソフトウェアを用いてデータ管理およびin silicoでの事前解析を行います。この配列を逆相補配列に変換する必要があります。クローンマネージャーツールの「operations」→「process molecule」→「invert molecule」の手順を用いてください。次に、「ligate」機能を使用して、C-S-G-B-Aの後ろにC-S-G-E-F-G配列を貼り付けます。続いて、C-S-G-B-A-E-F-G iCal配列の前方に、適切なプロモーターPRCNを追加します。RCN遺伝子座は、ニッケルおよびコバルトの解毒を担うFLXポンプRCNAと、その同族メタロレギュレーターであるRCNRをコードしています。コバルトまたはニッケルが存在しない場合、リプレッサーであるRCNRがDNA上のRCNRボックスに結合し、下流遺伝子の完全な転写活性化を抑制します。細胞内のコバルトまたはニッケル濃度が上昇すると、コバルトまたはニッケルがRCNRタンパク質に結合することでリプレッサーのプロモーターへの固定が妨げられ、選択された5つのcurly遺伝子がプロモーターの制御下に置かれることで、P-R-C-N-Aの転写活性が増加します。コバルトおよびニッケルの存在下でPRCN curlyが過剰産生されると予測されています。続いて、CS gba DNA配列の最初のATGの前に完全なリボソーム結合部位（RBS）を、またC-S-G-E-F-G配列の前に2つ目の完全なRBSを追加することで、転写シグナルを最適化します。iGEMの基準に適合させるため、デバイスの両端には、今後のアセンブリを容易にするため、EcoRIおよびXbaIの制限部位を含む標準的なバイオブロック・プレフィックスと、SpeIおよびPstIの制限部位を含むサフィックスを配置する必要があります。バイオブロックのパーツ自体に、EcoRI、PstI、SspI、XbaIの認識部位が含まれていてはなりません。そのため、in silico制限酵素解析によって、CSGA配列に1箇所のPstI部位、RCNR配列に1箇所のPstI部位、そしてCSGE遺伝子に1箇所のEcoRI部位があることが判明したため、これらの部位をサイレント変異によって除去しました。合成オペロンの設計が完了したら、クローンマネージャーソフトウェアを使用して翻訳シミュレーションを実行します。配列アライメントプログラムであるblastを用いて、野生型curlyタンパク質と合成オペロンによってコードされるタンパク質との間に完全なホモロジーがあることを確認します。この手順を開始するには、24ウェルポリスチレンプレートの各ウェルに、0.2% glucoseを含むM 63最小培地を2 mLずつ分注します。各ウェルに、一晩培養した細菌培養液を10⁶ cells分接種します。細菌を30 °Cで18〜48時間、振盪せずに培養します。24ウェルプレートの各列が1つのモダリティを表します。必要に応じて、適切な量のコバルトと抗生物質を添加します。最初の3行は、3回の繰り返しを平均することで、付着細菌の量を定量するために使用します。最左列の最終行は、18～48時間後にクリスタルバイオレット染色を行い、バイオフィルムを可視化するために使用します。24ウェルプレートの最初の3行の各ウェルから、プランクトン細胞を含む上清を回収し、その上清を溶血管に移します。各ウェルを1 mLのM 63培地で慎重にすすぎ、最初の吸引時に溶血管で洗浄液を回収します。この回収液を遊走細胞（S）と呼びます。マイクロプレートのウェル底面には付着細胞が形成されています。バイオフィルムを回収するために、各ウェルに1 mLのM 63を添加します。ピペットチップで掻き出した後、ピペッティングを行い、バイオフィルム画分を新しい溶血チューブに移します。チューブを15秒間ボルテックスします。バイオフィルム画分を溶血チューブに回収してください。このプールは、Bと名付けられた表面付着細胞を表します。溶血管から上清およびバイオフィルム分画を200 µL取り出し、96ウェルプレートに転移させます。600 nmにおける吸光度から、表面付着細菌および遊泳細菌の数を推定します。各モダリティの付着率は、数式(B × 100) / (3S + B)を用いて算出します。バイオフィルムを可視化するため、24ウェルプレートの最終行のみ、それらのウェルからプランクトン細胞を除去します。プレート底面に形成されたバイオフィルムを洗浄するため、各ウェルにM 63を1 mLずつ加えます。蓋を開けた状態でプレートを80 °Cで1時間乾燥させます。1時間後、各ウェルに20%結晶紫を100 µL加え、その後、水で十分に洗浄します。このプロトコルには蛍光シャシが必要です。合成curliを保持するプラスミドに適した宿主はE. coli SCC1株であり、この株は親株MG 1655と観察上の差がなく、緑色蛍光タンパク質を恒常的に発現します。宿主株に合成curliを保持するpUCK57プラスミドを形質転換し、S23株を得ます。宿主株をコントロールプラスミドpUCK18で形質転換し、コントロール株を得ます。S 23およびS 24株の前培養を30 °Cで一晩行います。翌日、グルコースおよびアンピシリンを添加したM 63培地を用い、シャーレに20 mLのM 63培地を加え、さらに100 µLの前培養液を15 mLのM 63培地を含むシャーレに接種します。適切な濃度のコバルトを添加し、コバルトを含まないネガティブコントロールも忘れずに用意してください。各ペトリ皿に3枚の長方形ガラスカバースリップを導入します。皿を30 °Cで振盪せずに一晩インキュベートします。翌日以降、蛍光顕微鏡下で細菌を直接観察することができます。サンプルの乾燥を防ぐことが重要であるため、以下の手順は慎重かつ迅速に行わなければなりません。各カバーガラスをペトリ皿から取り出し、注意深く液を切り落とします。共焦点観察に向けて、70%ethanolを浸した小さな綿棒で下面を丁寧に清掃し、細菌の残渣をすべて拭き取ります。バイオフィルムの上面が上を向くようにして、カバーガラスをガラススライドの上に置きます。次に、バイオフィルムをより大きなカバーガラスで覆い、バーニッシュを用いてガラススライドに固定します。セットアップを反転させ、バイオフィルムが下面に来るようにします。本実験では、このセットアップを共焦点レーザー顕微鏡の下に配置します。CTマイクロプラットフォーム内でZeiss LSM 510 Meta共焦点レーザー顕微鏡を使用します。40倍の油浸対物レンズを選択します。設定は、GFPを488 nmで励起させ、500 nmから600 nmの範囲で細菌の蛍光を収集するようにしてください。画像の取得には40倍の油浸対物レンズを使用します。レーザー走査型共焦点モードにおいて、固体表面から培地との界面まで、バイオフィルムの全体的な三次元構造を1 µmステップでスキャンします。mausソフトウェアを用いて3次元投影を行い、統計的な縦断断面における平均C値の解析によってバイオフィルムの厚さを決定します。共焦点Zスタックから、バイオフィルムの定量化およびバイオボリュームを抽出できます。金属に応答してcurlyを過剰産生するように構築されたe coliの付着能は、簡便な方法で評価可能です。例えば、24ウェル研磨済みIreneプレートを用いたクリスタルバイオレット染色は、紫色の色の濃淡で示されるように、各ウェルの底面におけるバイオフィルム形成の迅速な可視化を可能にします。野生型株は、エンジニアリング株よりも付着性が低いことが分かります。定量的な手法としては、さまざまな濃度のコバルトを用いた条件下で、野生型株とエンジニアリング株のポリスチレンへの付着率を測定する方法があります。このグラフに示された結果から、コバルト不在下において、改変株の付着率は野生型株よりも1.5倍高いことがわかります。さらに、コバルト濃度の増加に伴い付着が顕著に強化されることが観察され、コバルト濃度25 µMおよび50 µMの培地では、改変細胞の付着率はそれぞれ30%および40%に達しました。付着能は、ガラススライド上で培養したGFPタグ付き細菌を用いた顕微鏡観察によっても比較可能です。エピ蛍光顕微鏡を用いて黒色の背景上の緑色細菌を観察したところ、野生型株が矢印で示されるマイクロコロニーのみを形成するのに対し、改変株はバイオフィルムを形成することが明らかになりました。共焦点顕微鏡解析により、バイオフィルムの三次元構造の全体像が得られます。パネルAに上面からの再構成図を、パネルBに側面からの再構成図を示します。その結果、エンジニアリングされた株は野生型よりも付着性が高く、より緻密で厚いバイオフィルムを形成することが確認されました。この手順を行う際は、例えば放射性廃水という条件下での改変E. coliまたはOccus antsのバイオメディエーション能を探索する場合など、操作設計を再確認することが重要です。このビデオを視聴することで、クローンマネージャーソフトを使用して合成オペロンを設計する方法と、細菌株の発現量を迅速に定量化する方法について十分に理解できるはずです。合成遺伝子や遺伝子組み換え生物の取り扱いは極めて危険であることに留意してください。これらの取り扱いは、現行の法律に従い、形質転換した細菌のオートクレーブ滅菌などの予防措置を講じた上で行う必要があります。

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Bioengineering

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