Name: 水性環境で炭化水素の変換を有効にするツールキット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 28 s
Description: 学ぼう、BioBricksを用いた合成生物学的手法で大腸菌を改造し、毒性環境でのアルカン分解を実現する環境修復システムの構築方法。この技術は、油汚染の持続可能なバイオ修復に応用可能です。

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このビデオの記事で行った実験国際遺伝子改変マシン競争9のために開発されました。著者はIGEMのチームメンバーにルークBergwerff、ピーテルTMバンBoheemen、Jelmerクノッセン、ヒューゴ·F Cuetoロハスとするためラモンファンデルファルクに感謝したいと思います研究の援助。我々は有用な議論ハン·デ·Winde、ステファンデコックとEsengülYILDIRIMに感謝し、この研究をホスティング。この作品は、バイオテクノロジーのデルフト工科大学部、デルフトインフォマティクス研究室、Bionanoscienceのデルフト工科大学学科、オイルサンドリーダーシップイニシアティブ（OSLI）、スタッドstudentenuitzendbureau、オランダゲノミクスイニシアティブ、Kluyverセンター、Nederlandse Vereniging Biotechnologische（開発元：Stichtingバイオオランダ）によってサポートされていました、DSM、GENEART、グライナーバイオ1とジェネンコア。

1。 BioBrickアセンブリ<ol><li>標準生物学的部分のレジストリからBioBricksはIGEM本部によって提供されています。既存BioBricksから新しいBioBrickを構築するために、アクセプター部分のドナー部分の下流に位置決めするための酵素EcoRIとSpeIでドナーBioBrick（最大1.0μg）を消化。アクセプター部の上流ドナー部分を位置決めするためのXbaIとPstIでダイジェスト。ドナーのバックボーンにカット第三適切な制限酵素を追加します。サプライヤー（最終濃度1X）によると、適切な緩衝液20〜25 mlの総体積で消化を行う。制限酵素のた​​めの5単位/μgのDNAを使用しています。 </li><li> EcoRIおよびXbaIまたはSpeIとPstIでどちらかとアクセプタBioBrickを消化。 </li><li> 37℃で1時間（少なくとも）のために消化をインキュベート℃に制限エンドヌクレアーゼは、熱によって不活性化、80℃インキュベーションまもなく10分間遠心℃で。 </li><li>消化BioBrickを連結一緒にパーツ（ドナーとアクセプター）。 XbaIとSpeIでは、互換性のDNA末端を生成するので、混合型のサイトは、4つの標準的な制限部位に隣接、新しい &quot;複合&quot; BioBrickに起因するいかなる制限酵素で切断することはできませんが作成されます。ライゲーション混合物で最終DNA濃度は、好ましくは約100 ng /μlに。 T4のライゲーションバッファー（最終濃度1x）とT4リガーゼ（1単位/μgのDNA）を10〜15 mLの全量ライゲーション反応を行う。 </li><li>少なくとも3時間16℃でライゲーション混合物をインキュベートする。 </li><li>ライゲーションミックスの年頃の半分を使った変換反応を行う。 </li><li>シーケンスと正しいことがBioBrickを確認します。 </li><li>合成されたDNAから新しいBioBrickを構築するために、Eの最適な発現のために合成するための遺伝子を変更JCatウェブツール（による大腸菌 <a href="http://www.jcat.de/" target="_blank">http://www.jcat.de/</a> ）。 Bの要件に合わせてさらに変更を加え<html> ioBrick標準。この標準化は、すべてのBioBrickがプレフィックスが先行し、接尾辞が続く目的のDNA配列で構成されていることを意味します。接頭辞と接尾辞は、残りのプラスミド配列には存在しない事前定義された制限部位を含む配列である。これらの標準的な制限部位は、インターチェンジと9柔軟BioBrickインサートを延長することが可能になる。接頭辞と接尾辞は、以下の配列を持っている： </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> シーケンス </td><td> コメント </td></tr><tr><td>接頭辞</td><td> 5 &#39;GAATTCGCGGCCGCTTCTAG3&#39; </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 &#39;GAATTCGCGGCCGCTTCTAGAG 3&#39; </td><td>次の部分は、コード配列または &quot;ATG&quot;で始まる任意の一部である場合</td></tr><tr><td>サフィックス</td><td> 5 &#39;TACTAGTAGCGGCCGCTGCAG 3&#39; </td><td></td></tr></tbody></table>Vivoで ove_title &quot;&gt; 2。アルカン変換一休み細胞アッセイ、 このアッセイは、藤井ら （2004）によって記載された方法に基づいて行われた。 <ol><li>文化、E.アルカン水酸化酵素系（発現している大腸菌細胞<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014" target="_blank">BBa_K398014</a>空ベクター（簿価）と細胞<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002を</a>一晩適切な抗生物質を5 mlのLB培地中で）を。 </li><li>新鮮なLBの50ml（抗生物質を含む）に一晩培養液500μlを移すと、細胞濁度が600nmで0.3のOD（光学密度）に達するまでインキュベートする。 </li><li> 4,000 rpmで10分間遠心し、5mlの0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）でペレットを再懸濁します。 </li><li> 4,000 rpmで10分間遠心分離し、再び今のE2の塩および0.66パーセントv / vグリセロール（窒素deficienを含む5mlの0.1Mリン酸緩衝液中でペレットを再懸濁トン培地）。 </li><li>細胞濁度（OD 600）を測定します 。 </li><li> 25ミリリットルクローズドキャップガラスフラスコおよび無細胞コントロールで6ミリリットル（E2塩+ 0.66％（v / v）のグリセロール）の細胞混合物のアリコートを準備します。 </li><li>各フラスコにアルカンの100ナノモルを追加します。 </li><li> 24時間（より高いレートが得られたときに短縮）37℃で混合物をインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、OD 600を測定します 。 </li><li>酢酸エチルで培地中の炭化水素を抽出し、ガスクロマトグラフィー（プロトコル3を参照）により、細胞培養における炭化水素濃度を測定します。 </li><li>各フラスコ内の全バイオマス存在する（乾燥重量のOD 600に変換）によって変換されたアルカンの合計額で除してバイオマスの単位あたりの劣化を計算します。実験期間で結果を分割する単位時間当たり、単位当たりのバイオマス分解活性が得られます。平均は3個々の実行から取得されます。 </li></ol> 3。アルカン変換酵素アッセイでは 、ビトロこのアッセイは、Li ら （2008）により記載された方法に本質的に従って行った。 <ol><li>文化、E. LADA遺伝子（発現している大腸菌細胞<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a> ）と空ベクター（担持する細胞<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002を</a>一晩適切な抗生物質を50mlのLB培地中で）を。 </li><li>新鮮なLBの50ml（抗生物質を含む）に一晩培養液500μlを移すと、細胞濁度が600nmで0.6の光学密度に達するまで培養する。 </li><li> 4000 RPM（4℃）で10分間遠心分離し、50mMトリス緩衝液5mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> 4の出力制御を40％のデューティサイクルで超音波洗浄します（細胞破砕、LA Biosystems社）細胞は、全期間にわたって氷の上で解決策を保つ。 </li><li> 4＆dで4,000 rpmで5分間遠心し、得られた混合物を例えば、C細胞破片を除去する。新鮮なバイアルに上清を移してください。 </li><li>ブラッドフォードアッセイにより細胞抽出物の総タンパク質濃度を決定します。注：バックグラウンドの増加および/またはタンパク質の損失を防ぐために、ガラスバイアルを使用します。 </li><li> 0.1パーセントv / vのアルカンおよび50mM Tris-HCl緩衝液を含む100mlの混合物を準備します。 </li><li> 5分間100℃で混合物を加熱する。注：のみ沸点の高い中型の長鎖アルカンに対してこの手順を実行します。 （ 例えば、C 16：287℃）。 </li><li>均質、粘性の混合物が得られるまでアルカンの最適な溶解性を達成するためには、まだ温かいうちに1分間超音波洗浄します。 </li><li> NADHの1mm、1mMのFMN、1mMのMgSO 4および0.01 V / VのTriton X-100を追加します。 </li><li> 25ミリリットルクローズドキャップフラスコに6 mlのアリコートを準備します。 </li><li>細胞抽出物（ブラッドフォードアッセイ、5 mgタンパク質/ lの最終濃度に依存します）の適切な量を追加します。無タンパク質制御を準備します。 </li><li> 60℃でインキュベート（最適なeについて24時間nzymatic活動）。 </li><li>酢酸エチルで培地中の炭化水素を抽出し、ガスクロマトグラフィー（プロトコル3を参照）により、細胞培養における炭化水素濃度を測定します。 </li><li>各フラスコ（ブラッドフォード検量線による）に加え全タンパク質によって変換されたアルカンの合計額で除してバイオマスの単位あたりの劣化を計算します。さらに実験期間で割ると、単位時間あたりの細胞タンパク質の単位当たりの分解活性が得られます。平均は3個々の実行から取得されます。 </li></ol> 4。酢酸エチルの炭化水素抽出と濃度測定<ol><li>アルカンは6ミリリットル実験溶液中に2.5ミリリットルの酢酸エチル（無極性solvant）を加えることによって、水溶液から抽出されます。内部標準は、0.1％（v / v）の濃度で溶媒に添加される。標準（ 例えばシクロデカン）興味のあるピークの予想範囲に応じて変化した。 </li><li>オプション：追加トリトン水性混合物のX-100および適切な二相系を得るために4,000 rpmで10分間サンプルを遠心分離する。 </li><li>ボルテックス5秒（1,500 rpm）と別々の二つの相になるまで室温でインキュベートするための混合物。 </li><li>有機層（上部）の最大量を削除し、無水硫酸マグネシウムを用いて溶媒を乾燥させてください。 </li><li>ろ過によりMgSO 4を取り外します（0.2μm）と測定のためのガスクロマトグラフバイアルにろ液を転送、または-20℃で保存する</li><li> CP-SIL 5CB列（長さ= 5メートル）を使用してガスクロマトグラフィーを用いて濃度を測定します。 （1:10、230℃）、スプリットモードではサンプルの10μlを注入します。 1ml /分（ヘリウム）にカラムガス流量を設定します。以下のオーブン温度プログラムは使用されています： <table border="1"><tbody><tr><td> 率 </td><td> 温度[°C] </td><td> 時間[分] </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 50 </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 90 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 110 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 130 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 145 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 160 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 170 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 185 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 210 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 250 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> 50 </td><td> 320 </td><td> 2.0 </td></tr></tbody></table></li><li>ピークを積分し、内部標準に対する濃度を修正します。 </li></ol> 5。アルコール/アルデヒド脱水素酵素活性アッセイこのアッセイは、加藤らの方法によれば、基本的に行った。（2010）。 <ol><li>文化、E. ADH（発現している大腸菌細胞<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018" target="_blank">BBa_K398018</a> ）またはALDH（ <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030" target="_blank">BBa_K398030</a> ）遺伝子と空ベクター（担持する細胞<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J13002" target="_blank">BBa_J13002を</a>一晩適切な抗生物質を50mlのLB培地中で）を。 </li><li>新鮮なLBの50ml（抗生物質を含む）に一晩培養液500μlを移すと、細胞濁度が600nmで0.6の光学密度に達するまで培養する。 </li><li> 4℃、4,000 rpmで10分間遠心分離し、50mMトリス緩衝液5mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> 4の出力制御（超音波処理中に氷の上で解決策を保つ）と40％のデューティ·サイクルで細胞溶液を超音波洗浄します。 </li><li> °Cは、細胞破片を除去するために4℃、4,000 rpmで5分間、得られた混合物を遠心分離します。 </li><li>に決定Bradfordアッセイ（：結合タンパク質を防止するために、ガラスバイアルを使用注）により細胞抽出物のタンパク質濃度TAL。 </li><li>各ウェル中のNAD（最終濃度1mM、pH 9.5）で含む180μlの57 mMグリシン緩衝液を用いて、96ウェルプレートをセットします。 </li><li>ウェルにテストされるアルコール（アルデヒド）の5μlを添加する。注：ヒート長鎖アルコールアッセイの開始前の液体を持っている。各アルコール（アルデヒド）のための基質を含まない対照（陰性コントロール）を追加する必要があります。加えて、細胞抽出せずにバッファと基板との混合物を含有するブランクを準備します。 </li><li>予熱37℃で15分間プレートリーダー（TecanマゼランV7.0）のプレート°C系の平衡化を可能にする。 </li><li>細胞抽出物（ブラッドフォードアッセイ、5 mgタンパク質/ lの最終濃度に依存します）の適切な量を追加します。無タンパク質制御を準備します。 </li><li> 340 nmの波長で37℃で1時間2〜3分ごと℃&lt;を分光光度計を用いてNADH産生を測定/ LI&gt; <li> OD（340 nm）の斜面からのNADHの​​生産率を計算します。アカウントへの光路長と6220 M -1 cm -1のNADHの吸光係数を取る。細胞抽出物（U / mgの全細胞タンパク質）における脱水素酵素反応の活性を発現するために追加されたタンパク質の総量によってNADH生産速度を割ります。平均値と3は独立して動作しますから標準偏差を計算します。 </li></ol> 6。 pCaiFキャラクタリゼーション<ol><li>文化、E. pCaiF-GFPコンストラクト（発現している大腸菌細胞<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331" target="_blank">BBa_K398331</a> ）と単独のプロモーター（担持する細胞<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326" target="_blank">BBa_K398326を</a>適切な抗生物質を一晩5mlのLB培地で一晩）。 </li><li>一晩培養した培養液50μlと、10g / lのグルコースおよび抗生物質を含む5mlのM9を接種し、一晩増殖。 </li&gt; <li>新鮮なM9 with10 g / lでインキュベートし、5mlの中に一晩伸長のサブカルチャー50μlの細胞濁度は、600nmで0.2の光学密度に達するまで。 </li><li>各ウェルにテストするための炭素源の所望の量を含有する新鮮なM9培地100μlの96ウェルプレートをセットします。統計的評価のために3回の実験を行い、それぞれのネガティブコントロール（野生型大腸菌 K12）を追加します。 </li><li>井戸を含む培地に一晩培養液5μlを添加する。 </li><li>成長曲線（OD 600）とプレートリーダーを用いてGFP蛍光（485 nm励起と520発光）37℃で18時間毎に10分°Cの定数と振とうして測定します。 </li><li>成長率は、それぞれの測定値から特定のGFP量を計算し、コントロールと比較します。平均値と少なくとも3つの独立した実験の標準偏差を計算します。 </li></ol> 7。許容アッセイ<ol><li>文化PhPFDαおよびβ遺伝子（発現する大腸菌 <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406" target="_blank">BBa_K398406</a> 5 mlのLB培地と適切な抗生物質で一晩）、E. LADA遺伝子（発現している大腸菌は <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398017" target="_blank">BBa_K398017</a> ）ネガティブコントロールとして使用されます。 </li><li>新鮮なLBの5ミリリットル（抗生物質）とインキュベート中に一晩伸長のサブカルチャー10μlの細胞濁度は、600nmで0.3から0.4の光学密度に達するまで。 </li><li> 0.1のOD 600に到達するまで、新鮮な培地で培養液を希釈します。 </li><li>適切な抗生物質と三重で毒性化合物（ 例えば、0、4、8、n-ヘキサンの10％）の適切な最終濃度を含む180μlのM9培地で96ウェルプレートをセットします。アルカン-水混合物は、二相系につながる可能性があるので、それはプレート上の適切なコントロール（ 例えば dを持つことが不可欠であるifferent株とそれぞれのブランク実験）。 </li><li>ウェルに培養液20μl（コントロール）を追加します。 </li><li>一定振盪しながらプレートリーダーを37℃で24時間毎に10分°Cを使ってバイオマス濃度（OD 600）を測定します 。 </li><li>異なる薬剤濃度については、それぞれの測定値からの成長率を計算し、陰性対照と比較します。平均値と、少なくとも3つの独立した実行の標準偏差を計算します。 </li></ol> 8。同族体の相互作用のマッピング<ol><li>アプリケーションHIMは、STRINGデータベース（学術的な使用のため無料）20を稼動しているPostgreSQLサーバ上のタンパク質のクエリを実行するために開発されました。同族体の相互作用マッピングアプリケーションはSTRINGデータベースを使用して、元の宿主生物において作用するタンパク質を識別します。それぞれの相互作用遺伝子の配列は、標的生物の相同遺伝子を見つけるために、BLAST検索で使用されています。 Cytoscape 4 </sまで&gt;は、マッピングの結果を可視化するために使用されています。 ：HIMソフトウェアツールは次の場所にダウンロードすることができます<a href="https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping" target="_blank">https://github.com/jcnossen/InteractionHomologMapping。</a> </li><li>マッピングを実行するには、（1）BioBrick IDを入力すると、アプリケーションは自動的に標準生物パーツ9、または（2）を入力（ペースト）、アプリケーション内の配列データのレジストリから一部のシーケンスデータをダウンロードします。 </li><li>入力したアミノ酸配列のSTRINGプロテインIDを見つけるために、文字列データベースのWebサイトを使用しています。 </li><li>高い相同性を持つタンパク質は、BLASTを用いて決定される。その後、アプリケーションは、宿主生物におけるホモログ（ 例えば大腸菌 ）のソース生物と検索で既知の各相互作用タンパク質を示しています。 </li><li>テキストまたはCytoscapeに結果の推定上の相互作用リストをエクスポートします。 </li></ol>

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 <a target="_blank" href="http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl">http://string-db.org/newstring_cgi/show_download_page.pl</a> (2012).</li>
<li>Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Franchini, A. G., Rothlisberger, M., Witholt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Pseudomonas+putida+alkane-degradation+gene+clusters+and+flanking+insertion+sequences%3A+evolution+and+regulation+of+the+alk+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Analysis of Pseudomonas putida alkane-degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and regulation of the alk genes.</a> Microbiology. 147, 1621-1630 (2001).</li>
<li>Wang, L., Tang, Y., Wang, S., Liu, R. L., Liu, M. Z., Zhang, Y., Liang, F. L., Feng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+a+novel+thermophilic+Bacillus+strain+degrading+long-chain+n-alkanes%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of a novel thermophilic Bacillus strain degrading long-chain n-alkanes.</a> Extremophiles. 10 (4), 347-356 (2006).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

BioBrick原理は、アルカンの分解のために、シャーシを構築するために使われ、このツールキットの単一コンポーネントの原理の証明を得た。いくつかのアッセイは、in vivoおよびアルカン分解する経路酵素のin vitro活性を測定するために提案されている。提示された仕事は、正常宿主生物大腸菌の酵素活性と発現を決定するために使用できるメソッドの数を示しています適当BioBricksの実施後大腸菌 。さらに、それはBioBrick原理はアルカンの分解に必要なタンパク質を発現する生物を設計するために使用できることが示されている、唯一の必要なこれらの酵素を生産し、炭化水素の存在下で宿主生物の耐性を増強する規制システムを提供しています。一度さらに発展、このシャーシは、残油、水を尾行オイルサンドにおける例 、または治療のための生物学的分解を使用することができる石油産業からの排水。 アルカン劣化に関しては、アッセイは、アルカン分解（AH-システムとLADA）の最初のステップに関与する酵素のキャラクタリゼー...

石油汚染は環境汚染の最も深刻な原因の一つであり、生態系、企業、および地域社会に多大な影響を及ぼしています 3。例えば、カナダのアルバータ州にあるオイルサンドの尾鉱水から発生し続ける石油汚染に対処するための解決策が求められています。オイルサンドから石油を抽出する過程では、石油の半固体酸化形態であるビチューメンが熱回収技術を用いて除去されますが、この際、石油1バレルあたり約3.1バレルの水が消費されます 1。主に地元の河川から供給される、石油で汚染されたプロセス水は、ビチューメン抽出後に尾鉱池に蓄えられます。淡水利用の必要性を減らすため、プロセス水のより効果的なリサイクルが必要です。ビチューメン抽出を促進し、下流地点において水生生態系保護のための水質ガイドラインを満たすことを確実にするため、プロセス水処理技術が急速に進化しています 3。
有機化合物の汚染を処理するために、微生物を利用したバイオレメディエーション技術が現在推奨されています1。アルカンは原油の中で最も豊富な炭化水素群であり、1分子あたり5から40個の炭素原子を含んでいます7, 21。多くの細菌が、末端のメチル基を順次酸化して、まずアルコール、次にアルデヒド、最終的に脂肪酸を形成することで、様々な長さのアルカンを分解することが知られています8。このiGEMプロジェクトでは、異なる生物由来のいくつかの酵素を発現および特性解析し、BioBrick標準および標準生物学的パーツレジストリ（Registry of Standard Biological Parts）を通じて提供しました。
Gordonia sp. TF6の十分に研究されているアルカンヒドロキラーゼ系は、少なくとも4つの構成成分であるalkB2（アルカン-1-モノオキシゲナーゼ）、rubA3、rubA4（2種類のルブレドキシン）、およびRubB（ルブレドキシンレダクターゼ）を用いて、C5-C13アルカンおよびC5-C8シクロアルカンの初期酸化ステップを促進します 8, 21。長鎖アルカン（C15からC36まで）の酸化は、Geobacillus thermodinitrificans NG-80-2由来のフラボプロテイン・アルカンモノオキシゲナーゼであるladAによって行われることが報告されています 7, 15, 18, 22。LadAはフラビンモノヌクレオチド（FMN）と触媒複合体を形成し、原子状酸素を利用して酸化を行います。これにより、アルカンが対応する一次アルカノールに変換されます。これらのアルコールは、アルコール脱水素酵素およびアルデヒド脱水素酵素によってさらに酸化されて脂肪酸となり、容易にβ-酸化経路へと導入されます 7, 21。好熱性細菌Geobacillus thermoleovorans B23由来の亜鉛非依存性アルコール脱水素酵素は、NAD+をコファクターとして用い、中鎖アルカノールをそれぞれのアルカナルへと酸化します 10。同細菌由来のアルデヒド脱水素酵素は、中鎖酸化におけるNAD+依存的な最終ステップを触媒することができます 11
誘導コストを削減し、細菌系の最適な増殖を維持するために、E.coli由来のプロモーターpCaiFの特性評価が行われました。このプロモーターは炭化水素分解経路構成要素の発現を制御することができ、cAMP-Crpレベルによって調節されます。このレベルは、さらにグルコース濃度に依存します6。環境中の細胞外グルコース濃度が高い場合、PTSを介したグルコース輸送の副作用としてアデニリルシクラーゼが抑制されるため、細胞内のcAMP（環状アデノシン一リン酸）レベルは低くなります。対照的に、グルコース制限下（低濃度時）ではcAMPレベルが上昇し、CrpがcAMPと結合してcAMP-Crp複合体を形成します。これがpCaiFに結合し、下流構成要素の転写を活性化します6, 14。
野生型のE. coliは、中程度の濃度の炭化水素しか耐えられません。ツールキットを完成させるには、炭化水素への耐性を解決する必要がありました。いくつかの有機溶媒耐性菌は、水-溶媒二相系で生存することが知られています12。耐性を向上させることが知られている分子成分は、タンパク質の正しい折りたたみを促進するシャペロンです。Pyrococcus horikoshii OT3由来のphPFDαおよびphPFDβタンパク質からなるプレフォルディンシステムが、炭化水素耐性を向上させることが示されています17。
アルカン変換ツールキットは、Standard Biological Parts Registry 9に記載されているBioBrickの原理に従って構築されました。BioBrickとは、4つの事前定義された制限酵素部位に挟まれた特定の機能的インサートを含むプラスミドのことです。BioBrickインサートは柔軟に拡張可能であり、これにより新しい機能を持つ生物学的システムの構築が可能になります。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; K12</td><td>New England Biolabs</td><td>C2523H</td><td></td></tr><tr><td>オクタン</td><td>Fluka</td><td>74822</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサデカン</td><td>Fluka</td><td>52209</td><td></td></tr><tr><td>1-オクタノール</td><td>Fluka</td><td>95446</td><td></td></tr><tr><td>ドデカノール-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>126799</td><td></td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>FMN</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2253</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>J.T. Baker カスノ</td><td>7487 889</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>T4リガーゼ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>ガスクロマトグラフ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞破砕機</td><td>LA Biosystems</td><td>CD-019</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>spec 2000</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>Tecan Group Ltd.</td><td>Magellan v7.0</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター </td><td>Innova, 44</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioBrickTM K398014: BBa_J23100-BBa_J61100-&lt;em&gt;alkB2&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA3&lt;/em&gt;-BBa_J61100-&lt;em&gt;rubA4&lt;/em&gt;- BBa_J61100-&lt;em&gt;rubB&lt;/em&gt;</td><td>デルフト工科大学バイオテクノロジー学部、または標準生物学的パーツレジストリ（Registry of Standard Biological Parts）</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014&quot; ターゲット=&quot;（翻訳対象のテキストがありません）&quot;&gt;BBa_K398014&lt;/a&gt;</td><td>アルカンヒドロキシラーゼ系&lt;br/&gt; 耐性：クロラムフェニコール </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398027: BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ladA&lt;/em&gt; </td><td>デルフト工科大学バイオテクノロジー部門または標準生物学的パーツレジストリ</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398027&quot; ターゲット=&quot;（ソーステキストが空であるため、翻訳する内容がありません。）&quot;&gt;BBa_K398027&lt;/a&gt;</td><td>ladAタンパク質生成装置&lt;br/&gt; 耐性：クロラムフェニコール </td></tr><tr><td>BioBrick™ K398018: BBa_J23100-BBa_J61101-&lt;em&gt;アルコール脱水素酵素（ADH）&lt;/em&gt; </td><td>デルフト工科大学バイオテクノロジー学部、または標準生物学的パーツレジストリ</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398018&quot; ターゲット=&quot;（ソーステキストが空のため、翻訳する内容がございません。翻訳対象のテキストをご提示ください。）&quot;&gt;BBa_K398018&lt;/a&gt;</td><td>ADH　ジェネレーター&lt;br/&gt; 耐性：クロラムフェニコール </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398030: BBa_R0040-BBa_B0034-&lt;em&gt;ALDH&lt;/em&gt; </td><td>デルフト工科大学バイオテクノロジー部門、または標準生物学的パーツ登録所（Registry of Standard Biological Parts）</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398030&quot; ターゲット=&quot;（翻訳すべきソーステキストが提供されていません。翻訳対象のテキストをご提示ください。）&quot;&gt;BBa_K398030&lt;/a&gt;</td><td>ALDH　発生装置&lt;br/&gt; 耐性：クロラムフェニコール </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398326:&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt; </td><td>デルフト工科大学バイオテクノロジー部門、または標準生物学的パーツレジストリ（Registry of Standard Biological Parts）</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398326&quot; 対象＝&quot;翻訳対象のテキストが提供されていません。翻訳すべきソーステキストをご提示ください。&quot;&gt;BBa_K398326&lt;/a&gt;</td><td>pCaiFプロモーター&lt;br/&gt; 耐性：クロラムフェニコール </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398331:&lt;em&gt; pCaiF&lt;/em&gt;-BBa_B0032-BBa_I13401</td><td>デルフト工科大学バイオテクノロジー学部または標準生物学的パーツレジストリ</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398331&quot; ターゲット=&quot;翻訳すべきソーステキストが提供されていません。翻訳対象のテキストをご提示ください。&quot;&gt;BBa_K398331&lt;/a&gt;</td><td>pCaiF測定装置&lt;br/&gt; 耐性：クロラムフェニコール </td></tr><tr><td>BioBrickTM K398406: BBa_J23002-BBa_J61107-&lt;em&gt;phPFD&lt;/em&gt;&lt;em&gt;&amp;alpha;&lt;/em&gt;-BBa_J61107- </td><td>デルフト工科大学バイオテクノロジー部門、または標準生物学的パーツ登録所（Registry of Standard Biological Parts）</td><td>&lt;a href=&quot;http://partsregistry.org/Part:BBa_K398406&quot; ターゲット=&quot;（ソーステキストが空欄です。翻訳対象となるテキストをご提示ください。）&quot;&gt;BBa_K398406&lt;/a&gt;</td><td>溶媒耐性クラスター&lt;br/&gt; 耐性：クロラムフェニコール </td></tr></tbody></table>

水性環境で炭化水素の変換を有効にするツールキット

A Toolkit to Enable Hydrocarbon Conversion in Aqueous Environments

この作品は、前方の大腸菌によるアルカンの変換を可能にし、その適用性の原理の証明を提示するツールキットを置きます。このツールキットには、複数の標準交換部品（BioBricks）9アルカンの変換、有毒な炭化水素に富む環境における遺伝子発現と生存の調節をアドレッシングで構成されています。 アルカン分解の3段階経路を大腸菌で実装されました大腸菌それぞれアルカノール、カナール、最終的にアルカン-アミノ酸に、中長期鎖アルカンの変換を有効にする。後者はネイティブのβ-酸化経路を介して代謝された。中鎖アルカン（C5〜C13）とシクロアルカン（C5〜C8）、Gordonia spからアルカンヒドロキシラーゼシステムの4つの遺伝子（alkB2、rubA3、rubA4とrubB）の酸化を促進する。 TF6 8,21を 大腸菌に形質転換した大腸菌 。の変換のための長鎖アルカン（C15-C36）は、Geobacillus thermodenitrificansからLADA遺伝子が実装されました。分解プロセスの必要なさらなる手順については、ADHとALDHは（G. thermodenitrificans由来する）10,11を導入しました。活動は休止細胞アッセイにより測定した。各酸化ステップでは、酵素活性が観察された。 プロセス効率を最適化するために、式は唯一、低グルコース条件下で誘導されました：基板-調節プロモーター、pCaiF、使用されていました。 pCaiFは大腸菌に存在している大腸菌 K12と非グルコース炭素源の分解に関与する遺伝子の発現を調節する。 ツールキットの最後の部分-生存を標的に- PhPFDαとβ溶媒耐性遺伝子、 パイロコッカスホリコシ OT3からの両方を使用して実装されていました。有機溶媒としては、否定的にaffectinによって細胞ストレスを誘導し、生存性を低下させる可能性がGタンパク質の折り畳み。シャペロンとして、PhPFDαβはアルカンの存在下でタンパク質の折りたたみのプロセスなどを改善します 。培地で10％n-ヘキサンのプレゼンスの増加成長率（最大50％）で示される炭化水素の改善·トレランスにつながったこれらの遺伝子の発現が観察された。 要約すると、結果は、ツールキットは大腸菌を可能にすることを示す大腸菌水性環境中の炭化水素に変換して耐える。このように、それは合成生物学のアプローチを用いてオイル浄化のための持続的な解決に向けた第一歩を表しています。

アルカンの変換
アルカンから対応する脂肪酸に至る3段階の酸化ステップの活性を、静止細胞アッセイおよび酵素活性測定を用いて評価した。結果は、経路反応である(1) アルカンヒドロキシラーゼ、(2) アルコール脱水素酵素、(3) アルデヒド脱水素酵素に沿って提示する。 
最初のステップとして、中鎖および長鎖アルカン向けに異なるプラスミドを構築しました。このプラスミドは <a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_K398014" target="_blank">BBa_K398014</a> 中鎖アルカン酸化のためのアルカンヒドロキシラーゼ（AH）系の4つの遺伝子を含有している： alkB2, rubA3, rubA4 および rubB 単一の構成的プロモーターの制御下で（<a href="http://partsregistry.org/Part:BBa_J23100" target="_blank">BBa_J23100</a>）。陰性対照として、 E. col...

油汚染の浄化のための持続可能な自動調整システムは、標準的な細菌DNAの交換部品（BioBricks）を使用して設計されました。エンジニアリング<em&gt; E大腸菌の</em&gt;株が有毒、水性環境中のβ-酸化を介しアルカンを分解するために使用されていました。異なる種からそれぞれの酵素は、アルカン分解活性を示した。また、に耐性の増加<em&gt; N</em&gt;-ヘキサンをアルカントレラント細菌由来の遺伝子を導入することによって達成された。

本研究では、大腸菌（Escherichia coli）によるアルカンの変換を可能にするツールキットを提案し、その適用可能性を実証しています。

a-toolkit-to-enable-hydrocarbon-conversion-in-aqueous-environments

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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水性環境で炭化水素の変換を有効にするツールキット

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