蛍光活性化細胞選別（FACS）胎児マウスの内臓からの自律神経前駆細胞の分離用に最適化された手順

この手順の全体的な目的は、末梢神経系の神経節から精製された神経前駆細胞集団を誘導することです。まず、胎児マウスから目的の器官または特定の神経節を摘出し、次に組織を部分的に解離させることで、個々の細胞を周囲の培地に遊離させます。

次に、細胞懸濁液をろ過し、残留している組織の塊や大きな凝集体を除去します。最後に、細胞集団における蛍光レポーターの発現に基づいて、目的の集団を単離するために細胞懸濁液をフローソートします。最終的に、異なる発生段階で単離した前駆細胞間、あるいは精製した異なる神経細胞種の集団間で、遺伝子発現パターンを比較することができます。

抗体ラベルに基づく細胞集団の単離と比較して、本手法の主な利点は、特定の遺伝子を発現する細胞をラベルする免疫試薬が利用できない場合が多い点にあります。離散的なニューロンサブセットで蛍光タンパク質を産生するように遺伝子操作されたマウスラインを用いることで、これらの細胞集団を単離することが可能になります。本稿では、腸および口の神経発生経路からの神経前駆細胞の単離にこの方法を実証しますが、蛍光レポーターを発現する他のモデルシステムにも適用可能です。

一般的に、この手法に不慣れな方は、ソース組織を消化しすぎて細胞生存率が低下してしまう傾向にあるため、苦労することがあります。解剖を開始する前に、明視野照明で胚を観察し、目的の構造がピント内に収まっていることを確認してください。次に、蛍光立体顕微鏡を用いて蛍光レポーターの発現をスクリーニングし、トランスジェニック陽性胚を特定します。

安楽死させた後、組織を解剖している間に胚が浮き上がらないよう、解剖皿に少量のPBSを加えます。胚の体の側面と、肝臓の高さの腹部にかけて皮膚を切開します。胚を背中側に向け、微細ピンセットを用いて固定します。

前肢の高さで、横隔膜のレベルに別の鉗子を挿入し、素早く内臓を尾側に向かって、また背側体壁から離れるように引き出し、肝臓から生殖結節に至るまでの内臓を除去します。心臓や肺などの胸腔内臓器が内臓に付着して一緒に取り出された場合は、次の手順に進む前にそれらを取り除いてください。

腹部内臓を胴体から分離した後、胃の近くの肝臓の下にピンセットを挿入し、肝臓を腸から静かに剥離させます。次に、後腸を背側尿道から慎重に剥離し、泌尿生殖器系から腸を取り除きます。最後に、腸を反転させて、胃の下に脾臓が見えるようにします。

脾臓と膵臓を除去します。腸間膜を持って腸管のループを広げます。次に、腸間膜をそっと引っ張ることで、腸から腸間膜とそれに随伴する血管系を剥離します。

ピンセットで腸管を直接掴まないようにしてください。もし腸管が切断された場合は、解離ステップで分離した断片をまとめてください。組織の種類および胚の表現型に従って、氷冷HBSSを入れた15 milliliter コニカルチューブに、各組織タイプをまとめて回収します。

ペレット化した後、細切組織からHBSSを可能な限り吸引します。次に、組織ペレットを1〜数mLのACU maxで再懸濁します。サンプルごとにピペットチップを交換してください。

組織型のクロスコンタミネーションを避けるため、チューブを37 °Cのウォーターバスに20〜45分間置きます。分離する組織の段階によって異なりますが、組織の過剰な解離を防ぎ、その結果として細胞生存率が低下することを避けるためには、組織の解離とろ過がこの手順の中で最も困難な工程となります。

解離時間を制限し、途中で組織片を完全に解離させようとしないでください。解離時間の終了時に、チューブをウォーターバスの側面に激しく叩きつけ、手首をスナップさせるようにしてチューブを振り下ろすことで、手動で組織を分断します。次に、解離させたサンプルを氷上に移動させ、新しいピペットチップを使用して、各チューブに freshly prepared quench を 1 mL すぐに添加し、組織がほぼ完全に解離するまでサンプルをピペッティングして混ぜ合わせます。

次に、エタノール滅菌したピンセットを用いて、38 µmのナイロンメッシュメンブレンを3 cm角に切り出し、新しい15 mLコニカルチューブの口に被せます。その後、細口のチップを用いて、再懸濁した個々の細胞溶液をメンブレンの中央にピペッティングし、メッシュでろ過します。細胞懸濁液のろ過が完了したら、サンプルチューブを1 mLのquench 1:5で洗浄し、残っている細胞をすべてろ過してください。

次に、ろ過されていない組織サンプルがチューブに入らないように注意しながら、メンブレンを取り除きます。ペレット形成後、細胞懸濁液の上清を吸引し、ペレットを1 mLのquench one to fiveで再懸濁します。その後、示した通りに、各細胞懸濁液をナイロンメッシュでろ過し、5 mLポリスチレンチューブに入れます。

まず、EGFPのみの補正コントロール用に、蛍光サンプルの少量を分注して確保しておきます。次に、野生型組織サンプルを2つの部分に分け、一方に「野生型のみ」、もう一方に「7 A a d.のみ」とラベルを貼ります。次に、すべてのサンプルチューブにquench 1〜5を充填し、サンプルをペレット化した後、各チューブの上清を最後から200 µL残してすべて吸引します。

最後に、分取予定のサンプルおよび7-AADのみのコントロールに7-AADを添加します。次に、1.5 mLマイクロ遠心チューブにトリアゾールLSを0.75 mL添加し、サンプル回収チューブとします。まずコントロールサンプルを用いて補正パラメータとゲートを設定し、7-AAD陽性の死細胞を除外し、GFP蛍光強度の高い細胞を回収できるようにします。

補正パラメータを設定した後、ワイドボアノズルと低流量を用い、可能な限り低い圧力でソーティングを開始します。triol LSが過剰に希釈されないよう、各マイクロ遠心チューブに最大 25,000 個の細胞を回収してください。triol LS中に回収された細胞の各チューブを、ソーティング直後にボルテックスします。

最初の図では、受精後15.5日目のマウス生殖管のホールマウント標本を、明視野照明下で腹側から観察した様子を示しています。同じサンプルを蛍光照明下で観察し、TH EGFPトランスジェーンの発現によって同定される、副腎および内側に位置する腹腔神経節におけるEGFP陽性細胞の分布を示しています。受精後15.5日目のTH EGFP個体から摘出した膀胱を側面から見た図では、骨盤神経節、膀胱壁、および尿道におけるトランスジェーン発現による蛍光が示されています。

この背面像では、前部背側尿道組織にEGFP陽性細胞が認められます。フローソート用の細胞懸濁液を作成するための組織解離は、十分な酵素消化を行うことと、細胞生存率の低下を招く過剰消化を避けることの繊細なバランスの上に成り立っています。これらの顕微鏡写真には、解離時間の半分まで経過した下部泌尿生殖器および腸管組織が示されています。適切に消化された組織の手動操作前後の写真に見られるように、酵素処理時間が長すぎるか、あるいは酵素濃度が高すぎる組織では、部分的に切り出された器官の断片が依然として明確に残っています。

しかしながら、得られた懸濁液には大きな組織片は残っておらず、適切な解離と手動でのろ過を行うことで、通常90%以上の生存細胞を示すフローサイトメトリープロファイルが得られます。この生存細胞集団の中でレポーターを発現している細胞は、高強度のEGFP発現を維持しています。黒色の集団は、7-AAD蛍光色素を取り込んだ死細胞のシングルセルで構成されています。灰色の集団は、前方散乱光および側方散乱光に基づいたシングルセルのうち、7-AADを排除した生存細胞で構成されています。

緑色の集団は、ゲート設定されたGFP陽性領域から得られたものであり、7-AADを除外した生存単一細胞で構成され、EGFP蛍光を示します。この手法を用いることで、交感神経幹、後根神経節、または肺などの他の末梢組織から神経前駆細胞を単離でき、集団間の遺伝子発現プロファイルの違いや、異なる系統の発達に関する疑問を明らかにすることが可能です。