蛍光活性化細胞選別（FACS）胎児マウスの内臓からの自律神経前駆細胞の分離用に最適化された手順

この手順の全体的な目標は、末梢神経系神経節から精製されたニューロン前駆細胞の集団を導き出すことです。これは、まず胎児マウスから目的の臓器または特定の神経節を解剖することによって達成されます。次に、組織は部分的に解離して、個々の細胞を周囲の培地に放出します。

次に、細胞懸濁液をろ過して、残留組織の凝集体や大きな凝集体を除去します。最後に、細胞懸濁液をフローソーティングして、その細胞集団における蛍光レポーターの発現に基づいて目的の集団を単離します。最終的には、遺伝子発現パターンは、発生の異なる段階で単離された前駆細胞間、または異なるニューロン細胞タイプの精製された集団間で比較できます。

抗体標識に基づく細胞集団の単離に対するこの手法の主な利点は、多くの場合、免疫試薬が利用できないことです。特定の遺伝子を発現する細胞を標識し、個別のニューロンサブセットで蛍光タンパク質を産生する遺伝子操作されたマウス系統により、これらの細胞集団の単離が可能になります。この方法は、腸からの神経前駆細胞の単離と口の神経原性追跡を示していますが、蛍光レポーターを発現する他のモデルシステムにも適用できます。

一般に、この方法に不慣れな個人は、ソース組織を過剰に消化する傾向があり、細胞の生存能力が失われるため、苦労します。解剖を開始する前に、明視野照明で胚を観察し、関連する構造に焦点が合っていることを確認します。次に、蛍光実体顕微鏡を使用して蛍光レポーターの発現をスクリーニングすることにより、導入遺伝子陽性胚を同定します。

安楽死後、胚は解剖皿に最小限の量のPBSを追加することから始めますので、組織が解剖されている間、胚は浮かびません。胚の皮膚を体の側面に沿って、そして肝臓のレベルで腹部を横切って開きます。胚を背中に転がし、細い鉗子を使用して所定の位置に固定します。

前肢レベルでは、横隔膜のレベルで別の鉗子のペアを挿入し、次に勢いよく挿入します。内臓を尾に向かって引き下げ、背側の体壁から離して、肝臓から生殖器結節までの内臓を取り除きます。心臓や肺など、胸腔内の臓器が内臓に付着して出てきた場合は、それらを取り除いてから先に進みます。

腹部の内臓が死体から分離したら、肝臓の下、胃の近くに一対の鉗子を挿入し、肝臓を腸からそっと離します。次に、後腸を背側尿道から慎重に解剖し、泌尿生殖器から腸を取り出します。最後に、腸を裏返して、脾臓が胃の下に見えるようにします。

脾臓と膵臓を取り除きます。腸のループを引っ張って、メセンタリーをつかんで引き離します。次に、間膜をそっと引っ張って、腸から間膜と付随する血管系を剥がします。

鉗子で直接腸を保持しないでください。腸が壊れた場合は、解離段階で別々のピースをプールするだけです。各組織タイプを、組織タイプと胚表現型タイプに応じて、氷冷HBSSを含む15ミリリットルの円錐管にプールします。

ペレット化後、解剖した組織は可能な限りHBSSを吸引します。次に、組織ペレットを最大1〜数ミリリットルのACUに再懸濁します。各サンプル間でピペットチップを交換します。

組織タイプの相互汚染を避けるために、チューブを摂氏37度の水浴に20〜45分間入れます。単離される組織の段階にもよりますが、組織の解離とろ過は、組織の明白な解離を防ぐための手順の最も難しい部分です。その結果、細胞生存率が低下します。

解離時間を制限し、途中ですべての組織片を完全に解離しようとしないでください。そして、解離時間の終わりに、チューブをウォーターバスの側面に激しくたたき、手首をスナップモーションでチューブを下に投げつけて、組織を手動で分割します。次に、解離したサンプルを氷上に移し、すぐに新しいピペットチップを使用して各チューブに新たに準備したクエンチを1ミリリットル加え、組織がほぼ完全に解離するまでサンプルを上下にトライします。

今エタノール滅菌された鉗子のペアを使用して、新しい15ミリリットルの円錐管の口の上に3センチメートル四方の38ミクロンのナイロンメッシュ膜を置きます。次に、細いボアチップを使用して、メンブレンの中央にピペッティングすることにより、メッシュを介して個々の再懸濁細胞溶液をろ過します。細胞懸濁液をろ過したら、サンプルチューブを1ミリリットルのクエンチ1〜5ですすぎ、残りの細胞をろ過します。

次に、ろ過されていない組織サンプルがチューブに入るのを防ぐために注意しながら、メンブレンを取り外してください。ペレット化後、細胞懸濁液は上清を吸引し、ペレットを1〜5ミリリットルのクエンチに再懸濁します。次に、図のように、各細胞懸濁液をナイロンメッシュでろ過して5ミリリットルのポリスチレンチューブにします。

まず、EGFPのみの補償制御のために蛍光サンプルの少量のアリコートを予約します。次に、野生型の組織サンプルを2つの部分に分割し、1つの野生型のみをラベル付けし、他の7つのAをd.Onlyとラベル付けします。次に、すべてのサンプルチューブにクエンチ1〜5を充填し、サンプルをペレット化した後、各チューブ内の最後の200マイクロリットルの上清を除くすべてのものを吸引します。

最後に、選別するサンプルに 7 a d を追加し、7 a d のみのコントロールを行います。次に、0.75ミリリットルのトリアゾールLSを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機に加えます。サンプル収集チューブは、まずコントロールサンプルを使用して、7つのAまたはD陽性の死細胞を回避し、高強度のGFP蛍光を示す細胞を収集するための補償パラメータとゲートを設定します。

補正パラメータを設定した後、大口径ノズルと低流量で可能な限り低い圧力で選別を開始します。トリオールLSが過度に希釈されないように、各マイクロ遠心チューブに最大25, 000個の細胞を収集します。渦を選別した直後、細胞の各チューブはトリオールlsに捕捉されました。

この最初の図では、明視野照明下で腹側から見た性交後15.5日目のマウントユーロ生殖管全体を示しています。同じサンプルを蛍光照明下で観察し、TH EGFP導入遺伝子発現によって同定された副腎および内側に位置する腹腔神経節におけるEGFP陽性細胞の分布を実証します。この側面図は、椎弓TH EGFP下解剖膀胱の15.5日後であり、骨盤神経節、膀胱壁、および尿道における導入遺伝子発現による蛍光を示しています。

同じEGFP陽性細胞のこの背側の図では、前背側尿道組織で明らかであり、フローソーティングのための細胞懸濁液を生成するための解離は、適切な酵素消化と低細胞変動をもたらす可能性のある過剰消化の回避との間の微妙なバランスです。これらの顕微鏡写真は、解離時間の途中の下部泌尿生殖管と腸組織を示しています。マニュアル前後の適切に消化された組織のこれらの写真に見られるように、酵素処理が長すぎる組織や酵素濃度が高すぎる組織では、解剖された臓器の三片が依然としてはっきりと明らかです。

しかし、結果として生じる懸濁液は、適切な解離および手動フィルタリングにより、通常90%を超える生存細胞およびこの生存集団においてレポーターを発現する細胞を示すフローサイトメトリープロファイルを欠き、細胞は高強度のEGFP発現を保持する。黒人集団は、死死し、7つのa-d蛍光ダイの取り込みによって標識された単一細胞で構成されています。灰色集団は、前方散乱および側方散乱に基づく一重項細胞で構成され、7 a a dを除外したため、生存可能です。

緑色の集団は、ゲート化されたGFP陽性領域に由来し、7つのA a dを除外し、EGFP蛍光を示す単一の生存細胞で構成されています。この手順では、交感神経鎖、後根、神経節、肺などの他の末梢組織からニューロン前駆細胞を単離して、集団間の遺伝子発現プロファイルの違いや異なる系統の発達に関する質問に答えることができます。