外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

この手順の全体的な目標は、直流電界の存在下での成体由来神経前駆細胞の移動を視覚化することです。これは、まず成体マウスから上衣下神経前駆細胞を単離し、培養することによって達成されます。次のステップは、Galvan Axxisチャンバーを準備し、神経前駆細胞をチャンバーに移すことです。

最後のステップは、Galvan Axxisチャンバー全体に直流電界を印加し、タイムラプスイメージングを実行して神経前駆体の移動を観察することです。最終的に、タイムラプスイメージング顕微鏡は、神経前駆体の分化状態と未分化状態のガルバン戦術特性を捉えます。この方法は、神経前駆細胞ガルバンオアシスに関する洞察を得ることができますが、神経修復を強化するために神経前駆体を病変部位に動員するためのマウス脳卒中モデルなど、他のシステムにも適用できます。

その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるRob Pilley Postです。この手順を開始するとき、NPCは7日間培養されている必要があり、そのために自由に浮遊する一次ニューロスフェアを収穫する準備ができています。必要に応じて、3つの正方形のガラスを配置して、3つのGalvan Axxisチャンバーの準備を開始します。

その1は、6つの正常塩酸のボトルに一晩カバーします。翌日の早い時間に、マトラゲルを氷上でゆっくりと解凍するように設定します。4時間後、チャンバーの構築に使用できるようになります。

まず、ダイヤモンドチップガラスカッターを使用して、新しい正方形から6つの長方形のガラス片を切り取ります。その1、カバースリップ。酸洗浄された正方形のスリップと長方形のスリップを層流フードに移します。

ガラスストリップを70%エタノールで洗浄し、続いて組織培養グレードのオートクレーブ水で洗浄します。風乾させるか、糸くずの出ない紙で乾燥させます。次に、各正方形のスライドガラスの片面の周囲に真空グリースを塗布し、60ミリメートルのプラスチックのベースに密封します。

ペトリ皿。長方形のガラスストリップの片側に真空グリースを塗布し、正方形の反対側の端に密封します。スライドガラスは、各皿の中央に中央のトラフを持つ正方形を作成します。

これらの改質ガラスの正方形またはチャンバーをフード内で少なくとも15分間UV滅菌します。次に、250〜300マイクロリットルのポリオールリジンをチャンバーの中央トラフにピペットで固定します。その後、インキュベーションが終了する約15分前に、チャンバーを室温で2時間インキュベートします。

2時間後にマトリゲル溶液を調製し、ポリオールリジンを吸引し、中央のトラフを1ミリリットルのオートクレーブ水で洗浄します。次に、250〜300マイクロリットルのMatriゲル溶液を中央のトラフにピペットで移し、チャンバーを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、マトリゲル溶液を吸引します。

次に、中央のトラフを1〜2ミリリットルのSFMでやさしく洗います。次に、100マイクロリットルのE-F-H-S-F-MまたはF-B-S-S-F-Mを中央のトラフにピペットで移し、培養細胞の準備をします。次に、培養物を含む神経球の4〜5ミリリットルを新しい60ミリメートルのペトリ皿にピペットで入れます。

次に、ペトリ皿を計数顕微鏡のステージの5x表示対物レンズの下に置きます。P 10ピペットを使用して、5〜8個のニューロスフェア全体を各チャンバーの中央トラフに優しく移します。最大4つまで。

ニューロスフェアは一度に転送される可能性がありますが、中央のトラフのニューロスフェアと解離することはありません。マトリゲル基質を乱さずに慎重に広げます。次に、中央のトラフに150マイクロリットルのE-F-H-S-F-MまたはF-B-S-S-F-Mを追加します。

次に、加湿インキュベーターで細胞を培養します。培養で17〜20時間後、未分化のNPCは69〜72時間後に利用可能になります。文化では、差別化されたNPCが利用可能になります。

会計顕微鏡で、ライブセルイメージングの移動解析に最適な細胞を持つチャンバーを選択します。細胞は、神経球からほぼ完全に解離した丸みを帯びているはずで、まだ形成されていないか、フード内でプロセスを形成し始めたばかりです。チャンバーカバーを準備します。

正方形のガラスカバースリップを70%エタノールで洗い、次にオートクレーブ水で洗い、2つの平行な端に真空グリースのストリップを塗布します。次に、チャンバーを覆います。まず、中央のトラフから培地を吸引し、次にカバーをすばやく密封し、屋根のように長方形の壁に滑り込

次に、毛細管現象を使用して、100マイクロリットルの新鮮な培地を中央のトラフに装填します。次に、真空グリースを使用して、培養培地のプールの境界を作成します。ライブセルイメージングシステムの中央トラフの両端には、アグロスゲルチューブ、銀、塩化銀電極、および使用する2つの60ミリメートルシャーレを用意しました。

培地のリザーバーとして、チャンバーを摂氏37度の5%二酸化炭素環境内で20〜30分間休ませます。この間、2つの空のペトリ皿の蓋とGalvan Axxisチャンバーの蓋を準備します ペトリ皿 ドレメルまたはツールピペットで穴を開けて、中央のトラフの両側に1.5〜2ミリリットルのメディアを送り、各空のペトリ皿に7〜8ミリリットルのSFMを追加します。チャンバーの中央トラフの両側に1つのシャーレを置き、各ディッシュに1つの電極を配置します。

チャンバーとペトリ皿の間のギャップを埋めて、電気的導通を確立します。Agrosゲルブリッジを使用して、電極をMメーターを直列に使用して外部電源に接続し、電流を測定して電源をオンにします。電圧計を使用して、中央のトラフを直接横切る電界の強度を測定します。

必要に応じて電源の出力を調整します。次に、イメージングシステムでタイムラプスモジュールを開始します。Axio ビジョンソフトウェアで [多次元取り込み] を選択し、[見る] をクリックします。

チャンネルの場合は、チャンネル6を選択し、Tをクリックしてタイムラプスをクリックします。タイムラプス間隔の設定を1分に設定し、設定の前後のタイムポイントフィールドで期間を8時間に設定し、前後のタイムポイントを選択します。次に、[開始]をクリックし、アッセイの完了後、実験を希望の時間だけ実行し、IHC分析を進めます。

運動学的分析により、DCEFの未分化NPCが250ミリボルト/ミリメートルの存在下で、この磁場強度で陰極に向かって高度に向けられた急速なガルバンアキシスを示すことが明らかになりました。未分化のNPCの98%以上が、それらが画像化された6〜8時間全体にわたって移動しました。A-D-C-E-Fがない場合。細胞のランダムな動きが観察されました。

死んだ細胞は移動しないため、この期間は生存し続けることが示唆されます。A-D-C-E-Fの不在または存在下では、分化した表現型は、分化した細胞のA-D-C-E-Fサブセットの存在下と非存在下の両方で、無視できるほどの移動を経験しました。DCEFの方向に垂直に整列する傾向のある拡張されたプロセスでしたが、顕著な細胞体の転座は観察されませんでした。

免疫染色により、NPCがDC EF曝露の6時間後に神経前駆マーカー巣の陽性発現を維持することが確認されました。成熟表現型への分化を誘導したNPCを含むアッセイでは、大多数の細胞がDCEF曝露の6時間後に成熟星状細胞マーカーであるグリア線維性酸性タンパク質またはGFAPを発現します。この手順に従うと、遺伝的ノックアウトモデルを使用して、直流電場を細胞の運動性に変換することに関与する細胞メカニズムについての洞察を得ることができます。

または、サー、たとえばa。