外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ
2012年10月13日
このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。
この手順の全体的な目標は、直流電界の存在下での成体由来神経前駆細胞の移動を視覚化することです。これは、まず成体マウスから上衣下神経前駆細胞を単離し、培養することによって達成されます。次のステップは、Galvan Axxisチャンバーを準備し、神経前駆細胞をチャンバーに移すことです。
最後のステップは、Galvan Axxisチャンバー全体に直流電界を印加し、タイムラプスイメージングを実行して神経前駆体の移動を観察することです。最終的に、タイムラプスイメージング顕微鏡は、神経前駆体の分化状態と未分化状態のガルバン戦術特性を捉えます。この方法は、神経前駆細胞ガルバンオアシスに関する洞察を得ることができますが、神経修復を強化するために神経前駆体を病変部位に動員するためのマウス脳卒中モデルなど、他のシステムにも適用できます。
その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるRob Pilley Postです。この手順を開始するとき、NPCは7日間培養されている必要があり、そのために自由に浮遊する一次ニューロスフェアを収穫する準備ができています。必要に応じて、3つの正方形のガラスを配置して、3つのGalvan Axxisチャンバーの準備を開始します。
その1は、6つの正常塩酸のボトルに一晩カバーします。翌日の早い時間に、マトラゲルを氷上でゆっくりと解凍するように設定します。4時間後、チャンバーの構築に使用できるようになります。
まず、ダイヤモンドチップガラスカッターを使用して、新しい正方形から6つの長方形のガラス片を切り取ります。その1、カバースリップ。酸洗浄された正方形のスリップと長方形のスリップを層流フードに移します。
ガラスストリップを70%エタノールで洗浄し、続いて組織培養グレードのオートクレーブ水で洗浄します。風乾させるか、糸くずの出ない紙で乾燥させます。次に、各正方形のスライドガラスの片面の周囲に真空グリースを塗布し、60ミリメートルのプラスチックのベースに密封します。
ペトリ皿。長方形のガラスストリップの片側に真空グリースを塗布し、正方形の反対側の端に密封します。スライドガラスは、各皿の中央に中央のトラフを持つ正方形を作成します。
これらの改質ガラスの正方形またはチャンバーをフード内で少なくとも15分間UV滅菌します。次に、250〜300マイクロリットルのポリオールリジンをチャンバーの中央トラフにピペットで固定します。その後、インキュベーションが終了する約15分前に、チャンバーを室温で2時間インキュベートします。
2時間後にマトリゲル溶液を調製し、ポリオールリジンを吸引し、中央のトラフを1ミリリットルのオートクレーブ水で洗浄します。次に、250〜300マイクロリットルのMatriゲル溶液を中央のトラフにピペットで移し、チャンバーを摂氏37度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、マトリゲル溶液を吸引します。
次に、中央のトラフを1〜2ミリリットルのSFMでやさしく洗います。次に、100マイクロリットルのE-F-H-S-F-MまたはF-B-S-S-F-Mを中央のトラフにピペットで移し、培養細胞の準備をします。次に、培養物を含む神経球の4〜5ミリリットルを新しい60ミリメートルのペトリ皿にピペットで入れます。
次に、ペトリ皿を計数顕微鏡のステージの5x表示対物レンズの下に置きます。P 10ピペットを使用して、5〜8個のニューロスフェア全体を各チャンバーの中央トラフに優しく移します。最大4つまで。
ニューロスフェアは一度に転送される可能性がありますが、中央のトラフのニューロスフェアと解離することはありません。マトリゲル基質を乱さずに慎重に広げます。次に、中央のトラフに150マイクロリットルのE-F-H-S-F-MまたはF-B-S-S-F-Mを追加します。
次に、加湿インキュベーターで細胞を培養します。培養で17〜20時間後、未分化のNPCは69〜72時間後に利用可能になります。文化では、差別化されたNPCが利用可能になります。
会計顕微鏡で、ライブセルイメージングの移動解析に最適な細胞を持つチャンバーを選択します。細胞は、神経球からほぼ完全に解離した丸みを帯びているはずで、まだ形成されていないか、フード内でプロセスを形成し始めたばかりです。チャンバーカバーを準備します。
正方形のガラスカバースリップを70%エタノールで洗い、次にオートクレーブ水で洗い、2つの平行な端に真空グリースのストリップを塗布します。次に、チャンバーを覆います。まず、中央のトラフから培地を吸引し、次にカバーをすばやく密封し、屋根のように長方形の壁に滑り込
ませます。次に、毛細管現象を使用して、100マイクロリットルの新鮮な培地を中央のトラフに装填します。次に、真空グリースを使用して、培養培地のプールの境界を作成します。ライブセルイメージングシステムの中央トラフの両端には、アグロスゲルチューブ、銀、塩化銀電極、および使用する2つの60ミリメートルシャーレを用意しました。
培地のリザーバーとして、チャンバーを摂氏37度の5%二酸化炭素環境内で20〜30分間休ませます。この間、2つの空のペトリ皿の蓋とGalvan Axxisチャンバーの蓋を準備します ペトリ皿 ドレメルまたはツールピペットで穴を開けて、中央のトラフの両側に1.5〜2ミリリットルのメディアを送り、各空のペトリ皿に7〜8ミリリットルのSFMを追加します。チャンバーの中央トラフの両側に1つのシャーレを置き、各ディッシュに1つの電極を配置します。
チャンバーとペトリ皿の間のギャップを埋めて、電気的導通を確立します。Agrosゲルブリッジを使用して、電極をMメーターを直列に使用して外部電源に接続し、電流を測定して電源をオンにします。電圧計を使用して、中央のトラフを直接横切る電界の強度を測定します。
必要に応じて電源の出力を調整します。次に、イメージングシステムでタイムラプスモジュールを開始します。Axio ビジョンソフトウェアで [多次元取り込み] を選択し、[見る] をクリックします。
チャンネルの場合は、チャンネル6を選択し、Tをクリックしてタイムラプスをクリックします。タイムラプス間隔の設定を1分に設定し、設定の前後のタイムポイントフィールドで期間を8時間に設定し、前後のタイムポイントを選択します。次に、[開始]をクリックし、アッセイの完了後、実験を希望の時間だけ実行し、IHC分析を進めます。
運動学的分析により、DCEFの未分化NPCが250ミリボルト/ミリメートルの存在下で、この磁場強度で陰極に向かって高度に向けられた急速なガルバンアキシスを示すことが明らかになりました。未分化のNPCの98%以上が、それらが画像化された6〜8時間全体にわたって移動しました。A-D-C-E-Fがない場合。細胞のランダムな動きが観察されました。
死んだ細胞は移動しないため、この期間は生存し続けることが示唆されます。A-D-C-E-Fの不在または存在下では、分化した表現型は、分化した細胞のA-D-C-E-Fサブセットの存在下と非存在下の両方で、無視できるほどの移動を経験しました。DCEFの方向に垂直に整列する傾向のある拡張されたプロセスでしたが、顕著な細胞体の転座は観察されませんでした。
免疫染色により、NPCがDC EF曝露の6時間後に神経前駆マーカー巣の陽性発現を維持することが確認されました。成熟表現型への分化を誘導したNPCを含むアッセイでは、大多数の細胞がDCEF曝露の6時間後に成熟星状細胞マーカーであるグリア線維性酸性タンパク質またはGFAPを発現します。この手順に従うと、遺伝的ノックアウトモデルを使用して、直流電場を細胞の運動性に変換することに関与する細胞メカニズムについての洞察を得ることができます。
または、サー、たとえばa。
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概要
このプロトコルは、ガルバノタキシー中に成体脳由来の神経前駆細胞の転座を視覚化するために直流電場を適用するためのカスタムチャンバーの構築を実証します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 電気生理学
背景
- 成体マウスからの下室膜下神経前駆細胞の分離と培養。
- 細胞移動を研究するための電場の適用。
- 神経修復における神経前駆細胞の重要性。
- 細胞挙動を観察するためのタイムラプスイメージングの使用。
研究目的
- 電場下での神経前駆細胞の移動を視覚化する。
- これらの細胞のガルバノタキシー特性を理解する。
- 神経修復メカニズムにおける潜在的な応用を探求する。
使用された方法
- 神経前駆細胞の分離と培養。
- Galvan Axxisチャンバーの準備。
- 直流電場の適用。
- 細胞移動を捉えるためのタイムラプスイメージング。
主要な結果
- 神経前駆細胞の移動の成功的な視覚化。
- 分化状態と未分化状態でのガルバノタキシー挙動の証明。
- 脳卒中モデルにおける神経修復の強化への潜在的な影響。
結論
- この方法は神経前駆細胞の挙動に関する洞察を提供します。
- 神経修復を研究するための様々な実験モデルに適用できます。
- さらなる研究により神経科学における応用が拡大される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Directed migration of neural precursor cells (NPCs) is a critical bottleneck in neuroregenerative strategy development, impacting the predictive confidence of cell-based therapies. The galvanotaxis assay enables high-resolution, quantitative analysis of NPC migration kinetics in response to direct current electric fields, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. This capability informs portfolio decisions by clarifying the biological feasibility of NPC mobilization for CNS repair.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of NPC migratory response to defined electric field cues for pathway clarification.
- Supports functional target validation by quantifying migration in undifferentiated versus differentiated states.
- Facilitates mechanistic de-risking of candidate pathways or interventions affecting NPC motility.
- Provides a platform for genetic or pharmacological perturbation studies to assess migration mechanisms.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for NPC migration under controlled electric field conditions.
- Supports standardization of migration metrics for cross-study and cross-team comparability.
- Enables screening of compounds, genetic modifications, or receptor modulators for effects on NPC motility.
- Delivers high-content, time-lapse imaging outputs suitable for downstream analytics.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro migration phenotypes with disease-relevant models, such as stroke-induced neurorepair.
- Supports translational continuity by modeling NPC recruitment to lesion sites under physiologically relevant cues.
- Informs risk-adjusted advancement of neuroregenerative strategies based on quantitative migration data.
- Provides mechanistic insight into endogenous and exogenous NPC mobilization for CNS repair.
Pipeline & Workflow Integration
This galvanotaxis assay positions within the early discovery to preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational modeling of NPC migration.
- Discovery Biology: Quantifies NPC response to electric fields, clarifying migratory mechanisms and biological feasibility.
- Screening: Provides standardized, reproducible migration metrics for compound or genetic perturbation evaluation.
- Analytics: Generates quantitative, time-lapse migration data for statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Models disease-relevant NPC recruitment, supporting preclinical neurorepair studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform adaptable to various genetic, pharmacological, or disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in NPC-based neuroregeneration by resolving migration mechanisms.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible migration assays for cross-functional teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for neuroregenerative programs by providing quantitative migration endpoints.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidate interventions targeting NPC mobilization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural cell isolation, culture, and live-cell imaging.
- Demands access to custom galvanotaxis chambers, time-lapse microscopy, and electrophysiological instrumentation.
- Necessitates cross-team standardization of migration metrics and assay conditions.
- Adaptable to various genetic backgrounds, differentiation states, and pharmacological interventions.
- Limited to in vitro modeling; translational extrapolation requires disease-relevant validation.
