Name: 外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶ 神経前駆細胞の走電性アッセイ法。マウス脳由来の細胞を直流電界下で培養し、タイムラプス顕微鏡で移行動態を可視化する手法です。神経再生メカニズムの解明に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この作品は、自然科学とカナダ工学研究会議（助成＃249669および＃482986）とカナダの心臓と脳卒中財団（助成金＃485508）によって賄われています。著者は実験的なプロトコルを開発中で彼らの支援のためのユーセフ·エル·ハイエク博士とチーワンに感謝します。

動物の取り扱いに関係するすべての手順は、制度ガイドライン（プロトコルはありません。20009387）に従い、トロント動物ケア委員会の大学によって承認された。次のメソッドは、該当する場合、層流フードで、無菌のツールやテクニックを使用して実行されるべきである。 以下のプロトコルのテキストでは、フレーズ &quot;EFH-SFMは&quot;上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子とヘパリンを補充無血清培地を指します。これらのマイトジェンは、未分化状態の4のNPCを維持するため、未分化NPCの走電性を調査するときEFH-SFMは使用されています。成熟細胞型に分化するように誘導NPCの走電性を調べるときは、 &quot;FBS-SFMは、&quot; 1％ウシ胎児血清を添加した無血清培地を指します。 FBSは、成熟した神経表現型5にNPCの分化を促進する。 1。神経前駆細胞の単離および培養（ない）映像に示すように<ol><li>頸椎脱臼経由イソフルランと犠牲とCD1マウス（6-8週齢）Anaesthetize。 </li><li> 70％エタノールでヘッドを消すと鋭い解剖ハサミで動物を斬る。 </li><li>外科手術用鉗子で頭を押さえながら、頭蓋骨を露出するために背側表面に皮膚を削除します。 </li><li>メスとNOを使用。 11ブレードは、中外軸に沿って、またrostrocaudal方向に矢状縫合に沿って前頭洞で頭蓋骨を獲得。 </li><li>離れていないと頭から頭頂骨をはがします。 7曲がった鉗子ではなく、ピアス脳組織に世話をして。 </li><li>小脳の下から開始し、嗅球に向かって進ん脳の下の薄いへらを挿入します。鉗子で適所に頭蓋骨を押さえながら、そっと頭蓋骨から脳を引くとすぐに氷のように冷たい人工脳脊髄液（以下のレシピを参照してください）​​に入れてください。 </li><li>解剖顕微鏡下では、無菌の使用解剖用はさみや鉗子は正中線に沿って半分に脳を切った。内側（カット）面が上方を向くようにそれぞれの半球を回転させます。 </li><li>半球を選択して、内側面を上に向けて、脳梁（脳梁の後部領域）の膨大部を見つけます。 </li><li>皮質の表面からの背腹軸に沿って脳梁膨大部への切り込みを入れる。 </li><li>側脳室の内側と外側の壁を露出させるために嗅球に向かって切開皮質ピール。 </li><li>背面が上方を向くように半球を回転させたり、切り取ってNPCが6に存在する脳室周囲白質領域が含まれている露出した内側と外側の壁を収集するために湾曲したmicroscissorsを使用しています。 </li><li>他の半球の手順1.8から1.11までを繰り返します。 </li><li> 15ccのチューブ内のトリプシン溶液（下記レシピを参照してください）​​の7ミリリットルに単離された組織をピペットで、37°C​​でロッカー上にチューブを配置25分間インキュベーター。 </li><li> 5分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、上清を吸引し、（下のレシピを参照してください）​​トリプシンインヒビター溶液2mlに組織を再懸濁する。 </li><li>ゆっくり気泡を避けるために慎重に小さなボーリング孔パスツールピペット30から50回で組織をひいて粉にする。 </li><li> 、5分間1,500 rpmでチューブを遠心し上清を吸引し、ペレットを3-5回摩砕することにより、SFM中1-2ミリリットル（下のレシピを参照してください）​​に再懸濁します。 </li><li> 3分間1,500 rpmでチューブを遠心分離し、SFMの1ミリリットル+ EFHで清と再懸濁を吸引除去する。 </li><li> SFM + EFHでμlあたり10細胞の密度でT25培養フラスコ内の血球とプレート細胞と生細胞密度をカウントします。 </li><li>文化はNPCに成る自由浮動プライマリーニューロスフィアを得るのに邪魔されずに7日間成長することができます。 </li></ol> 2。走電性商工会議所の準備<ol><li> NO 3正方形のガラスを置きます。 1カバースリップ（22×22×0.17ミリメートル）は、i一晩の6N塩酸Naのボトル。 </li><li>翌日には、正方形の無からのガラスの6短冊（22×5×0.17ミリメートル）をカットするダイヤモンドチップガラスカッターを使用しています。 1カバースリップ。 </li><li>層流フード内に酸洗浄した正方形と長方形のスリップスリップを転送します。組織培養グレードの水でオートクレーブした後、70％エタノールを持つ最初の長方形と正方形のストリップを洗い、拭いてキムに乾燥することができます（追加された不妊のため、ガラスは空気乾燥させることができる）。 </li><li>正方形のガラススライドの一方の面の周囲に真空グリースを塗布し、60ミリメートルプラスチックペトリ皿の底にそれらを封印。 </li><li>長方形のガラス片の一方の面の長軸に沿って、真空グリースを塗布し、中央の谷を作成するために正方形のガラススライドの反対側のエッジ（彼らが互いに平行となるように）にそれらを封印。 </li><li>層流フード内に少なくとも15分間のチャンバを紫外線殺菌。 </li><li>ポリ-L-lysiの250から300μlのピペット2時間室温でインキュベート室及び中央トラフの上にね。 </li><li>潜伏期間の終了前の約15分間は、（下のレシピを参照してください）​​マトリゲル溶液を調製します。 </li><li>ポリ-L-リジンを吸引除去し、オートクレーブ滅菌水1ml、中央谷の上にマトリゲル溶液をピペット250から300μlで中央の谷を洗います。 </li><li> 1時間37℃でチャンバーをインキュベートする。 </li><li>マトリゲルの液を除き、穏やかに、SFM中1-2 mlの中央谷を洗う。 </li><li>中央の谷へEFH-SFMまたはFBS-SFMの各々100μL添加し、カウントを顕微鏡のステージ上に走電性チャンバーを転送します。 </li><li>ピペット3月4日60ミリメートルペトリ皿に神経球含有培養mlのはカウント顕微鏡のステージにシャーレを転送します。 </li><li> 5倍の視聴目的で、それぞれの走電性の中心トラフに5月8日全神経球（最大4時）に転送するためにP10のピペットを使用それらを解離させずにチャンバー、慎重マトリゲル基板を中断せずに、中央の谷の周りの神経球を広げた。 </li><li>中央の谷にEFH-SFMまたはFBS-SFMの追加の150から200μlを添加する。 </li><li> 37℃、5％CO 2、17から20時間後には100％の加湿インキュベーターに走電性チャンバを転送（もし未分化のNPCを分析）を図1に示すように、ニューロスフィアは、マトリゲル基板に付着し、単一細胞に解離できるようにする。差別化されたNPCを分析する場合、潜伏期間は、細胞の分化を可能にするために69から72時間に延長すべきである。 </li></ol> 3。細胞タイムラプスイメージングを生きる<ol><li>ライブセルイメージングシステムは、37℃で平衡化させ℃、5％前タイムラプス撮影開始までの30分の最小のCO 2。 </li><li>一方の端部から直径1mmのシルバーワイヤー、コイルふたり12cmの部分をカットし、クロロックスbにそれらを配置する銀/塩化銀電極を形成するために、20分間浸出する。 </li><li>計数顕微鏡のステージ上に走電性室を移し、次の基準に基づいてライブセルイメージングの移行解析のために使用される室を選択します：i）ニューロスフィアは、単一細胞にほぼ完全に解離しなければならないと、ii）細胞が持っている必要があり少しツーないプロセスと丸い形態は、細胞体から伸びる。 </li><li>別の方形な​​いとともに、層流フードに選択された走電性チャンバーを転送します。 1ガラスカバースリップと真空グリース。 </li><li>オートクレーブした水で、次に70％エタノールを用いて第一滑り、カバースリップの2つの平行な辺に真空グリースのストリップを適用するカバーを洗う。 </li><li> 、室の中央トラフから培地を吸引除去した後すぐに2つの平行な矩形状のガラス片にグリスストリップの残りの部分は、効果的に屋根を作成するようなチャンバー上にカバースリップ（グリース側を下に向け）を配置室へ。 </li><li>毛細管現象を介して中央の谷に新鮮EFH-SFMまたはFBS-SFMの各々100μL添加します。 </li><li> 図2に示すように、中央の溝の両端に培地のプールの境界線を作成するために真空グリースを使用しています。 </li><li> PVCチューブの2 15cmの部分をカットし、丁寧に泡がチューブ内に形成されないの確保、チューブにアガロース溶液を注入する18ゲージの針で10ccのシリンジを使用し、ゲルを5分間凝固させる。 </li><li>アガロースゲルチューブ、銀/塩化銀電極、および培養培地リザーバーとして使用される空の60ミリメートルペトリ皿のペアと一緒に、ライブセルイメージングシステムへの走電性チャンバーを転送したAg / AgCl電極を含んでいます。走電性チャンバーは37内に物を置か℃、20〜30分間、5％CO 2環境。 </li><li>この時間の間に、ドリルで穴を開けることによって2つの空のペトリ皿のふたと走電性室のペトリ皿の蓋を準備それらの中に、図3に示すように、ドレメルまたは同様のツールを持つ。 </li><li>ピペット中央谷の両側の上EFH-SFMまたはFBS-SFMは1〜1.5 mlを加え、それぞれの空のシャーレにSFM 7-8 mlであった。各皿に走電性チャンバーの中央トラフと場所1 Ag / AgCl電極の両側に1つ配置シャーレ。 図4に示すように、アガロースゲルブリッジとの電気的導通を確立するために、走電性チャンバー、ペトリ皿とのギャップを埋める。 </li><li>電流を測定するために直列に電流計で、外部電源に銀/塩化銀電極を接続し、電源をオンにします。所望の電界強度が達成されるまで、直接中央谷を横切って電界強度を測定し、電源の出力を調整するために電圧計を使用します（このラボで行わアッセイはで250 mVの/ mmのdCEFの強みを活かし1と1.5ミリアンペア）の間に電流。 </li><li>イニシアTEは、タイムラプスライブセルイメージングシステム上のモジュール、および実験は、目的の時間のために実行することができます。検定終了後、標準の免疫染色解析のため、4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 </li></ol>

<ol><li>Borgens, R. B., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+histogenesis+from+morphogenesis+in+the+vertebrate+embryo+by+collapse+of+the+transneural+tube+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential.</a> Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).</li>
<li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cues+regulate+the+orientation+and+frequency+of+cell+division+and+the+rate+of+wound+healing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).</li>
<li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+regeneration+and+wound+healing+are+stimulated+and+directed+by+an+endogenous+electrical+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo.</a> Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li>
<li>Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mammalian+forebrain+ependymal+and+subependymal+cells+demonstrate+proliferative+potential%2C+but+only+subependymal+cells+have+neural+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).</li>
<li>Erickson, C. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+fibroblast+motility+and+orientation+can+be+influenced+by+physiological+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields.</a> J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).</li>
<li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+and+directed+migration+of+cultured+corneal+epithelial+cells+in+small+electric+fields+are+serum+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent.</a> J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).</li>
<li>Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-Current+Electrical+Field+Guides+Neuronal+Stem%2FProgenitor+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).</li>
<li>Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li>
<li>Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li>
<li>SATO, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-output+relationship+in+galvanotactic+response+of+Dictyostelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells.</a> Biosystems. 88, 261-272 (2007).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).</li>
<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li>
<li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li>
<li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Cell+Behavior+Electrically%3A+Current+Views+and+Future+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Subependymal+Neural+Precursors%2C+but+Not+Differentiated+Cells%2C+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808(2011).</li>
<li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li>
<li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルは、先行研究7-9のよく確立された方法の中から適応されています。 Galvanotactic室は、細胞播種の閉じ込めのためのよく独立したガラス張りの建設を含むさまざまなテクニック、のさまざまな方法を使って、または中央トラフ10,11の微細加工にCO 2レーザーアブレーション法を用いて構築することができる。いくつかのテクニックは他よりも面倒でコストのかかるかもしれません。我々は一般的にほとんどの細胞生物学研究室で見つかった材料を使用してNPCの走電性チャンバーを構築するための簡単​​かつ費用対効果の高いアッセイを記載している。我々のプロトコルは、継続的な長期的イメージングのために最適な条件で細胞を維持するために、ライブセルイメージングシステムを囲む、加湿、加熱されたCO 2インキュベーターレギュが含まれています。このような装置の欠如は、いくつかの以前に発行された技術は9,12の制限です。 別のグループによる最近の研究では同様のガルバを実証異なるプロトコルや、その...

<table border="1"><tbody><tr><td height="44"> アイテムの名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 神経前駆細胞の単離 </td></tr><tr><td> 2MのNaCl </td><td>シグマ</td><td> S5886 </td><td> 100ミリリットルのdH 2 Oに溶解11.688グラム</td></tr><tr><td> 1MのKCl </td><td>シグマ</td><td> P5405 </td><td> 100ミリリットルのdH 2 Oに溶解した7.456グラム</td></tr><tr><td> 1M MgCl 2を </td><td>シグマ</td><td> M2393 </td><td> 100ミリリットルのdH 2 Oに溶解20.33グラム</td></tr><tr><td> 155 MMのNaHCO 3 </td><td>シグマ</td><td> S5761 </td><td> 100ミリリットルのdH 2 Oに溶解した1.302グラム</td></tr><tr><td> 0.5Mグル​​コース</td><td>シグマ</td><td> G6152 </td><td> 100に溶解し9.01グラムミリリットルのdH 2 O </td></tr><tr><td> 108 mMのCaCl 2 </td><td>シグマ</td><td> C7902 </td><td> 100ミリリットルのdH 2 Oに溶解した1.59グラム</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ膵臓トリプシン</td><td>シグマ</td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td>羊は精巣ヒアルロニダーゼ</td><td>シグマ</td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td>キヌレン酸</td><td>シグマ</td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td>オボムコイドトリプシンインヒビター</td><td>ワージントン</td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> [F12] </td><td>インビトロジェン</td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> 30％のグルコース</td><td>シグマ</td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7.5パーセントのNaHCO 3 </td><td>シグマ</td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td>シグマ</td><td> H3375 </td><td> 100ミリリットルのdH 2 Oに溶解23.83グラム</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>ギブコ</td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td>インビトロジェン</td><td> PMG8041 </td><td> 20μlの単位にホルモンミックスとアリコート1mlの溶解。 </td></tr><tr><td> FGF </td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0226 </td><td> 20μlの単位にホルモンミックスとアリコートを0.5mlで再構成する。 </td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td>アポトランスフェリン</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 3188-AT </td><td> 0.1gを4ミリリットルのdH 2 0に溶解</td></tr><tr><td>プトレッシン</td><td>シグマ</td><td> P7505 </td><td>そうアポトランスフェリンに9.61 mgを溶解分離能</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td> I5500 </td><td> 0.1NのHClを0.5mlに25mgを溶解するとdH 2 0の3.5ミリリットルに追加</td></tr><tr><td>セレン</td><td>シグマ</td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>シグマ</td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td>標準解剖ツール</td><td>ファイン科学ツール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 走電性商工会議所の準備 </td></tr><tr><td>正方形のガラスカバースライド</td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> 6N塩酸</td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td>高真空用グリース</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60ミリメートルペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td>ポリエルリジン</td><td>シグマ</td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td> BD Biosciences社</td><td> 354234 </td><td> 150μlの単位に解凍し、アリコート</td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 10082139 </td><td>上記で示したように、NPCの分化を誘導する場合にのみ使用し、それ以外の場合は、SFM + EFH培養培地を使用</td></tr><tr><td>計数顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 細胞タイムラプスイメージングを生きる </td></tr><tr><td>銀線</td><td> Alfa Aesar社</td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td>超高純度アガロース</td><td>インビトロジェン</td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td>熱Inactivated FBS </td><td>シグマ</td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> PVCチューブ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;内径x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>クロロックス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10ccの注射器</td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 18ゲージの針</td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td>ドレメルドリル</td><td>ドレメル</td><td>モデル750 </td><td></td></tr><tr><td>加湿、インキュベート室を備えた倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td> AXIOVERT-200M </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>レシピ<table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td> 2MのNaCl </td><td> 6.2ミリリットル</td></tr><tr><td>1MのKCl </td><td> 0.5ミリリットル</td></tr><tr><td> 1M MgCl 2を </td><td> 0.32ミリリットル</td></tr><tr><td> 155MMのNaHCO 3 </td><td> 16.9ミリリットル</td></tr><tr><td> 1Mグルコース</td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td> 108 mMのCaCl 2 </td><td> 0.09256ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td>オートクレーブ処理水</td><td> 74ミリリットル</td></tr></tbody></table> 人工脳脊髄液 <table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> 体積または質量 </td></tr><tr><td>人工脳脊髄液</td><td> 30ミリリットル</td></tr><tr><td>ウシ膵臓トリプシン</td><td> 40 mgの</td></tr><tr><td>羊は精巣ヒアルロニダーゼ</td><td> 22.8ミリグラム</td></tr><tr><td>キヌレン酸</td><td> 5mgを</td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt;のトリプシン溶液<table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> 体積または質量 </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15ミリリットル</td></tr><tr><td>オボムコイドトリプシンインヒビター</td><td> 10mgを</td></tr></tbody></table> トリプシン阻害剤溶液 <table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>オートクレーブ処理水</td><td> 37ミリリットル</td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 </td><td> 10ミリリットル</td></tr><tr><td> 30％のグルコース</td><td> 2ミリリットル</td></tr><tr><td> 7.5パーセントのNaHCO 3 </td><td> 1.5ミリリットル</td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 0.5ミリリットル</td></tr><tr><td>トランスフェリン、プトレシンソリューション</td><td> 4ミリリットル</td></tr><tr><td> 25mgのインスリン溶液</td><td> 4ミリリットル</td></tr><tr><td>セレン</td><td> 100＆ムー;リットル</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td> 100μlの</td></tr></tbody></table> ホルモンミックス （-20℃で100mlの合計、店舗） <table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>オートクレーブ処理水</td><td> 37.5ミリリットル</td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12（3:1） </td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> 30％のグルコース</td><td> 1ミリリットル</td></tr><tr><td> 7.5パーセントのNaHCO 3 </td><td> 0.75ミリリットル</td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 0.25ミリリットル</td></tr><tr><td>ホルモンミックス</td><td> 5ミリリットル</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td> 0.5ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td> 0.5ミリリットル</td></tr></tbody></table> 無血清培地EFH-SFM：0.5ミリリットルのFBSを追加したEGFの10μlに、FGFの10μl、およびヘパリンFBS-SFMの3.66μlを加える<taBLE国境= &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> アイテム </td><td> ボリューム </td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td> 150μlの</td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3.6ミリリットル</td></tr></tbody></table> マトリゲルソリューションマトリゲルのアリコートを氷の箱に入れて、SFMと混合する前に、粘性のある液体を形成するために4-5時間かけてゆっくりと解凍させなければならない。これは、マトリゲル基板の平滑な層の形成を確実にするでしょう。ゆっくりと解凍されていない場合は、得られた基板は、おそらく細胞遊走を阻害する、マトリゲルの塊を含んでいます。 <table border="1"><tbody><tr><td> アイテム </td><td> 体積または質量 </td></tr><tr><td>超高純度アガロース</td><td> 10ミリリットルのddH 2 0で300mgの</td></tr><tr><td> SFM 熱不活性化FBS </td><td> 8ミリリットル 2ミリリットル</td></tr></tbody></table> マトリゲル解決策は、15ccのファルコンチューブに2ミリリットル熱不活性化FBSでSFMの8ミリリットルを混ぜる。ミックスの三角フラスコ中で10ミリリットルのddH 2 0のアガロース、および30秒で、10秒間隔のために電子レンジでの加熱は、各10秒間隔の後に電子レンジから溶液を除去し、徹底的に混ぜて確保。最後の10秒電子レンジ期間の後、57℃の湯浴のSFM / FBS溶液とストアとアガロース溶液を混ぜる。 </td></tr></tbody></table>

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

哺乳類成体脳における神経幹細胞および前駆細胞の発見（以下総称して呼ばれる神経前駆細胞）（NPCは）神経再生戦略の開発のため、これらの細胞の多能性や増殖特性を利用することを目的とした研究の本体につながっている。そのような戦略の成功のための重要なステップは、外因性の移植後の病変部位に向かってNPCの動員であるかCNSの脳室周囲白質領域で発見された内因性の前駆体の応答を増強する。したがって、それは、推進導き、NPCの移行を強化するメカニズムを理解することが不可欠です。走電性として知られている現象 - 私たちの仕事は、NPCの移行を促進し、指示するために直流電界の利用（dcEFs）に焦点を当てています。内因性の生理的な電界が正常な発達と創傷修復中に細胞遊走のための重要な手がかりとして機能する。の薬理学的混乱アホロートル胚におけるトランス神経管電位は重度の発達奇形1を引き起こします。このDCEF 2-3の薬理強化や中断によって示されるように、創傷治癒のコンテキストでは、傷ついた角膜の修復速度が直接、損傷後生じる上皮創傷電位の大きさと相関している。我々は、外部から印加されたDCEFにさらされたときに成人上衣下NPCが試験管内で迅速かつ監督陰極移行を受けることを明らかにした。このプロトコルでは、高分解能、単一細胞レベルでディレク細胞体転座（マイグレーション）の長期観測のためのシンプルで効果的な走電性アッセイを作成するために私たちの研究室の手法について説明します。このアッセイは、トランスジェニックやノックアウトマウスでは、短鎖干渉RNA、または特定の受容体アゴニスト/アンタゴニストの使用を介して細胞の運動性にdCEFの伝達を制御するメカニズムを調査に適しているであろう。

キネマティック解析は、250 mVの/ミリメートルDCEFの存在下で、未分化なNPCが陰極に向かって非常に導かれ、急速な走電性（ 図5A、映画1）を示すことが明らかになった。 DCEFの非存在下では、細胞のランダムな動きが（ 図5B、ムービー2）が観察された。この電界強度では、未分化のNPCの&gt; 98％が撮像されているために全体の6〜8時間のために移行し、死細胞は移行されませんので、これは彼らがdCEFの非存在下または存在下で、この期間中に生き続けることを示唆している。 差別化された表現型は、両方の存在およびdCEFの不在（ 作品3、4）は無視できるマイグレーションを受ける。分化した細胞のサブセットは、dCEFの方向に対して垂直に整列する傾向があるプロセスを拡張しますが、目立った細胞体の転座は観察されない。 免疫染色では、NPCが正expressioを維持していることを検証N DCEF露光（ 図6A）</...

このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

本手順の目的は、直流電場存在下における成体由来神経前駆細胞の遊走を可視化することです。まず、成体マウスから脳室下帯神経前駆細胞を単離して培養します。次に、Galvan Axxisチャンバーを準備し、神経前駆細胞をチャンバー上に転移させます。最終ステップは、Galvan Axxisチャンバーに直流電界を印加し、タイムラプス撮影を行って神経前駆細胞の遊走を観察することです。最終的に、タイムラプス顕微鏡撮影により、分化および未分化状態における神経前駆細胞のガルバノタクシス特性を捉えます。この手法は神経前駆細胞のガルバノタクシスに関する知見を提供できるだけでなく、神経修復を促進するために病変部位へ神経前駆細胞を動員させるマウス脳卒中モデルなどの他のシステムにも適用可能です。本手順の実演は、私の研究室の大学院生であるRob Pilley Postが行います。この手順を開始する際、遊離した一次ニューロスフィアを回収できる状態にするため、NPCを7日間培養しておく必要があります。必要に応じて、3枚の正方形ガラスを配置し、3つのGalvan Axxisチャンバーの準備を開始してください。1つ目に、カバーガラスを6 Nの塩酸が入ったボトルに入れ、一晩浸漬させます。翌日の早いうちに、Matrigelを氷上でゆっくりと解凍させます。4時間後、チャンバーの構築に使用可能な状態になります。まず、ダイヤモンドチップ付きガラスカッターを使用して、新しい正方形のカバーガラスから6枚の長方形のガラスストリップを切り出します。次に、酸洗浄した正方形および長方形のカバーガラスを、ラミナーフローフード内に移動させます。ガラスストリップを70% ethanolで洗浄し、続いて組織培養グレードのオートクレーブ滅菌水で洗浄します。そのまま自然乾燥させるか、または糸くずの出ないペーパー上で乾燥させます。次に、正方形ガラススライドの片面の周囲に真空グリスを塗布し、60 millimeterのプラスチック製の底部に密封します。シャーレ。長方形のガラスストリップの一面に真空グリースを塗り、正方形の反対側の端に密閉します。各皿の中央に中央溝を持つ正方形を作成するためのガラススライドを使用します。これらの加工済みガラス正方形またはチャンバーを、フード内で少なくとも15分間UV滅菌します。次に、チャンバーの中央の溝に250〜300 µLのポリリシンをピペットで分注します。その後、チャンバーを室温で2時間インキュベートし、インキュベーション終了の約15分前に準備を整えます。2時間後にMatrigel溶液を調製し、ポリリシンを吸引除去して、中央の溝を1 mLのオートクレーブ滅菌水で洗浄します。次に、250〜300 µLのMatrigel溶液を中央の溝にピペッティングし、チャンバーを37 °Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、Matrigel溶液を吸引除去します。次に、中央の溝を1〜2 mLのSFMでそっと洗浄します。続いて、培養細胞の準備として、100 µLのE-F-H-S-F-MまたはF-B-S-S-F-Mを中央の溝にピペッティングします。次に、ニューロスフィアを含む培養液4〜5 mLを、新しい60 mmペトリ皿にピペッティングします。次に、ペトリ皿を計数顕微鏡のステージ上に置き、5倍の対物レンズで観察します。P 10ピペットを使用して、5〜8個のニューロスフェア全体を各チャンバーの中央の溝に慎重に移します。最大4つまで。ニューロスフェアは一度に移植しても構いませんが、中央の溝にあるニューロスフェアと混ざらないようにしてください。Matrigel基質を壊さないように注意しながら、周囲に慎重に分散させます。その後、中央の溝にさらに150 µLのE-F-H-S-F-MまたはF-B-S-S-F-Mを加えます。次に、加湿されたインキュベーター内で細胞を培養します。培養開始から17〜20時間後、未分化のNPCが得られます。また、69〜72時間培養すると、分化したNPCが得られます。計数顕微鏡下で、生細胞イメージングによる遊走解析に最適な細胞が含まれるチャンバーを選択します。細胞はほぼ完全にニューロスフィアから解離して丸くなっており、フード内で突起を形成していないか、あるいは形成し始めたばかりの状態である必要があります。チャンバーカバーを準備します。正方形のガラスカバースリップを70% ethanolで洗浄し、次いでオートクレーブ滅菌水で洗浄した後、2つの平行な端に真空グリースの帯を塗布します。次に、チャンバーを覆います。まず、中央の溝から培地を吸引し、その後、屋根のようにカバースリップを長方形の壁の上に素早く密閉します。次に、毛細管現象を利用して、新鮮な培地 100 µL を中央の溝に充填します。続いて、真空 그리스を用いて、培地を溜めるための境界を作成します。生細胞イメージングシステムの中央溝の両端に、あらかじめ準備しておいたアガロースゲルのチューブ、塩化銀電極、および 60 mm のペトリ皿 2 枚を用意してください。培地のリザーバーとして機能させるため、チャンバーを37 °C、5% carbon dioxide環境下で20〜30分間静置します。この間に、2枚の空のペトリ皿の蓋とGalvan Axxisチャンバー用ペトリ皿の蓋に、ドレメルまたはツールピペットで穴を開けて準備します。中央のトラフの両側に1.5〜2 mLの培地を載せ、各空のペトリ皿に7〜8 mLのSFMを加えます。チャンバーの中央トラフの両側にペトリ皿を1枚ずつ配置し、各皿に電極を1本ずつ挿入します。チャンバーとペトリ皿の間の隙間を埋めて、電気的連続性を確立します。Agaroseゲルのブリッジを用いて、電極を外部電源に接続します。この際、電流を測定するためにM計を直列に接続し、電源を入れます。また、V計を使用して、中央の溝に直接かかる電界強度を測定します。必要に応じて電源装置の出力を調整します。次に、イメージングシステムのタイムラプスモジュールを開始します。Axio visionソフトウェアで「multidimensional acquisition」を選択し、「see」をクリックします。チャンネルについてはチャンネル6を選択し、タイムラプス用のTをクリックします。タイムラプスの間隔設定を1分に、期間を8時間に設定し、「before」および「after」のタイムポイントフィールドにて、それぞれのタイムポイントを選択します。次に「start」をクリックし、必要な時間、実験を進行させます。アッセイ完了後、IHC解析に進みます。運動学的解析の結果、250 mV/mmのDCEF存在下において、未分化NPCは、この電界強度で陰極に向かって非常に指向性の高い急速なガルバノタキシスを示すことが明らかになりました。未分化NPCの98%以上が、イメージングを行った6〜8時間の間、ずっと移動し続けました。A-D-C-E-Fがない場合は、細胞のランダムな移動が観察されました。死細胞は遊走しないため、この結果は、これらの細胞がこの期間中生存していることを示唆しています。A-D-C-E-Fの有無にかかわらず、分化細胞のサブセットが存在する場合としない場合の両方において、分化した表現型はほとんど遊走しませんでした。突起が伸展し、DCEFの方向に対して垂直に並ぶ傾向が見られましたが、細胞体の顕著な転位は観察されませんでした。免疫染色の結果、NPCは6時間のDC EF曝露後も神経前駆細胞マーカーであるnestinの陽性発現を維持していることが確認されました。成熟した表現型への分化を誘導したNPCを用いたアッセイでは、6時間のDCEF曝露後、大半の細胞が成熟アストロサイトマーカーである glial fibrillary acidic protein（GFAP）を発現しました。この手順を用いることで、遺伝的ノックアウトモデルを利用し、直流電場を細胞運動へと変換する細胞メカニズムについての知見を得ることができます。または、例えば次のような例があります。

a-galvanotaxis-assay-for-analysis-neural-precursor-cell-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、小説アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞（NSC）の運動性を高めることを示している。この技術は、ヒト神経幹細胞などの細胞源が不足している他の哺乳動物細胞系、に容易に適応することができ、時間のターンアラウンドが重要です。...

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

植された細胞（幹神経堤細胞）の移行を解析するアプローチが説明されています。この方法は、安価な優しい、そのような主要なトランク神経堤細胞培養内細胞間相互作用に由来するもののような渡り鳥の極性にケモキネシスと他の影響の両方からの走化性を区別することができる。...

修正Zigmondチャンバーアッセイを使用してトランク神経冠細胞移動の解析

このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています...

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

研究者は、線虫が感知して応答する電場を適用することにより、C.

Electrotaxis Assay:C. elegansの移動を観察する方法

にオンデマンド歩行を誘導する半自動微小電気流体方式...

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; &#39;ロコモーション

私たちは、特注のガルバノタキシスチャンバー内で移動し、不死化された前立腺細胞に生理的な電場を適用する方法を提示します。この方法を使用して、2つの系統の非腫瘍形成性前立腺細胞が、フィールド内で異なる程度の移動方向性を示すことを示します。...

前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用

多くのマイクロ流体デバイスは、エレクトロタキシスの研究で使用するために開発されています。しかし、これらのチップのいずれも、細胞に対する化学的および電界(EF)の影響を同時に効率的に研究することはできません。私たちは、エレクトロタクシス研究で使用するために、より適切に制御された共存するEFおよび化学刺激を提供するポリメチルメタクリレートベースのデバイスを開発しました。...

マルチチャンネルデュアル電界マイクロ流体チップを用いて、肺癌細胞の走電性の研究

機械的な力は、細胞の移動を制御するために重要です。このプロトコルは、ガラスマイクロピペットとマイクロマニピュレータを使用して変形できる弾性ヒドロゲルの使用を示し、細胞構造および移行の変化を引き起こすために局所的な剛性勾配を持つ細胞を刺激する。...

細胞運動と関連するシグナル伝達事象の機械的制御を評価するための単細胞デュロタシスアッセイ

我々は、3つの単純なインビトロアッセイ-長距離移動アッセイ、共培養移行アッセイ、および化学誘引アッセイ-それは、ヒト幹細胞由来の心室内皮細胞とその機能を一括して評価するGABAergic インターニューロンとの相互作用.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

本研究では、マイクロ流体系における直流(DC)パルス刺激によってのみ誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化に関するプロトコルを提示する。...

マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化

学ぶ 神経前駆細胞の走電性アッセイ法。マウス脳由来の細胞を直流電界下で培養し、タイムラプス顕微鏡で移行動態を可視化する手法です。神経再生メカニズムの解明に応用可能です。

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

さらに動画を探す