電気鉛フリー、シーケンシャル核酸およびタンパク質の分離
2012年5月15日
ツールと化学が順次電気を必要とせずにサンプルからのタンパク質に続いて核酸を分離するために記述されています。このツールは、分離化学を固相抽出の原則に基づいている間に転送ピペット内に保持されて吸着剤から構成されています。隔離された高分子は、免疫系とPCRベースのアッセイにより分析することができます。
この手順の全体的な目的は、電気や研究室の設備を必要とせずに、サンプルからPCR準備完了の核酸および免疫反応性タンパク質を分離することです。核酸およびタンパク質の分離は、サンプルにグアニジンおよびチオシアネートを混ぜてサンプルを溶解し、その混合物を抽出ピペット内の吸着剤に通すことから始まります。吸着剤への5回目の通過、つまり最終的な通過が終わった後、混合物をタンパク質抽出バッファーに入れ、免疫反応性タンパク質を分離するために置いておきます。
次に、吸着剤に95% ethanolを流し、吸着剤および結合した核酸を洗浄します。その後、吸着剤に外気を5分間流す操作を繰り返し、吸着剤と結合した核酸を乾燥させます。PCR準備済み核酸抽出の最終ステップは、250 µLのtrisまたは免疫反応性タンパク質抽出用の同様の水溶液を用いて、吸着剤から核酸を溶出させることです。
サンプルとタンパク質抽出バッファーを混合した後、別の抽出ピペットを使用し、混合液を吸着剤に通す操作を15回繰り返します。次のステップでは、95% ethanolを吸着剤に繰り返し通すことで、タンパク質が結合した吸着剤を洗浄します。その後、吸着剤に外気を5分間通し、吸着剤と結合タンパク質を乾燥させます。
プロトコルの最終ステップは、吸着剤からタンパク質を溶出させることです。最終的に、この手順で使用される抽出ピペットにより、電気を使用せずにPCR準備完了の核酸および免疫反応性タンパク質を単離することが可能になります。こんにちは、デイブ・パウォルスキーです。
私はニューヨーク州バッファローにあるKubrick Incorporatedのシニアリサーチサイエンティストです。本日は、遠心分離機やボルテックスミキサー、その他の付随的な実験器具を必要とせずに、タンパク質と核酸の両方をインラインで単離する手法について学びます。サンプルの溶解を行う前に、サンプルが液体状態であることを確認してください。食品や糞便などの固形サンプルの場合は、水やリン酸緩衝生理食塩水などの液体培地に懸濁させてください。
1.5 mLチューブ内で、サンプル 500 µLと6 Mグアニジンチオシアネート 500 µLを混合します。次に、抽出ピペットのバルブを押し、内部の空気を排出します。バルブをゆっくりと戻して、1 mLのサンプル全体を吸収材を通して抽出ピペット内に吸い上げます。
抽出ツールを反転させ、吸着ビーズとサンプルがバルブ内に流れ込むようにします。バルブ内でサンプルとともに吸着ビーズを研磨します。この際、抽出ピペットからサンプルが排出されないように注意してください。
抽出ピペットを反転させ、サンプルを元の1.5 milliliterチューブに排出します。1 milliliterのサンプル全量を抽出ピペットに吸い込み、適度な速度で吸着剤を通過させます。吸着剤が抽出ピペットのネック部分に留まるように注意しながら、バルブを押し下げてサンプル全量を1.5 milliliterチューブに排出します。
この工程を繰り返し、サンプルを吸着剤にさらに4回通過させ、合計5回通過させます。5回目の通過後、1 mLのサンプル全量を、15 mLコニカルチューブに入れた4 mLのタンパク質抽出バッファー中に排出します。チューブを転倒混和し、蓋を閉めて後で使用するまで保管します。
1 mLの95% ethanolを吸着剤に通し、それを元のチューブに戻す操作を3回繰り返し、単離した核酸を洗浄します。最後のパスの後、別の1 mLの95% ethanol洗浄液を用いて、さらに3回洗浄を繰り返します。手順の次のステップは吸着剤を乾燥させることです。吸着剤が乾燥しているとき、核酸の回収率が最適になります。
この工程は手間がかかりますが、推奨される時間内に完了させることで、より良好な結果を得ることができます。バルブを5分間、押しては離す動作を繰り返してください。
抽出ピペットに周囲の空気を流して核酸と吸着剤ベッドを乾燥させ、抽出ピペットの先端に残ったエタノールを拭き取ります。Kimwipeを使用して、250 µLの10 mM Trisを吸着剤に5回通し、核酸を回収します。Tris緩衝液は、PBSなどの他の適切な水溶性溶液に置き換えることができます。
得られた溶液には抽出された核酸が含まれています。まずタンパク質抽出を行うために、あらかじめ用意しておいたタンパク質抽出バッファー中でチューブを反転させてサンプルを混合します。この5 mLのサンプルのうち、約2～3 mLを新しい抽出ピペットの吸着剤に通します。吸着剤が抽出ピペットのネック部分に留まるように注意しながら、サンプル全量を同じ15 mLコニカルチューブに排出してください。
この工程を繰り返し、サンプルを吸着剤に15回通過させます。吸着剤と結合したタンパク質を洗浄するため、1 mLの95% ethanolを吸着剤ベッドに3回通過させ、エタノールを元のチューブに排出します。さらに、別の1 mLの95% ethanol洗浄液を用いて、あと3回洗浄します。
手順の次のステップは、吸着剤を再度乾燥させることです。核酸と同様に、吸着剤をより長い時間乾燥させたときに、タンパク質の回収率が最適になります。
バルブを5分間押し、離す動作を繰り返し、抽出ピペット内に周囲の空気を通過させます。タンパク質吸着剤層を乾燥させるため、抽出ピペットの先端から残ったエタノールを拭き取ります。キムワイプを用いて、250 µLのPBSを吸着剤に5回通過させ、タンパク質を回収します。
PBS緩衝液は、10 millimolar tris (pH 6.8) など、他の適切な水溶液で代用可能です。得られた溶液には、サンプルのタンパク質成分が含まれています。抽出ピペットを用いた核酸・タンパク質抽出手順により、腸管出血性大腸菌 O157:H7 株 EDL933に関連する志賀毒素遺伝子を増幅させました。
シガトキシン遺伝子のStx1およびStx2は、PRプロモーターの制御下にある温和なラムダ様バクテリオファージおよび欠損バクテリオファージ上に存在します。E. coliにおけるSOS応答の活性化は、プロファージの誘導および/または毒素の産生を引き起こします。本ケースでは、未処理のコントロールと比較して、ミトマイシンCによってSOS応答が誘導された際に、シガトキシン2遺伝子の増幅が大幅に増加します。
これはプロファージの誘導およびファージゲノムの複製を示唆しています。ビデオで説明した核酸・タンパク質分離実験から回収されたタンパク質は、免疫反応性を示しました。分離されたタンパク質分画を、Rapid Check E. coli O157 ラテラルフローアッセイストリップに適用しました。
コントロールでは、シガトキシン誘導の有無にかかわらず、E. coli O157を保有するすべてのサンプルにおいて、2本の赤色のバンドの出現により陽性と判定されました。また、抽出ピペットを用いて核酸およびタンパク質の処理を行ったE. coli O157保有サンプルにおいても、陽性の結果が示されました。これらのデータは、各サンプルから単離されたタンパク質が免疫活性を有しており、それによって陽性反応が誘導されたことを示しています。
単離したタンパク質は、6 Mのグディナ・イソチオシアネートから単離したBSAを負荷した、クマシ染色済み8%アクリルアミドゲルに示されているように、電気泳動に適しています。この抽出法、ピペット操作および関連プロトコルを用いることで、単離したタンパク質の電気泳動移動度はコントロールサンプルと同一になります。習得すれば、この手法を20分以内に完了させることができます。
このビデオを視聴することで、シンプルなデバイスからタンパク質および核酸を単離する方法について明確に理解していただけるはずです。ご視聴ありがとうございました。
概要
この記事では、電気を使わずにサンプルから核酸とタンパク質を順次分離するための新しいツールと化学物質について説明しています。この方法は、転送ピペット内の吸着剤を用いて、固相抽出の原理を用いた効果的な分離を行います。
主要な研究要素
科学の分野
- 生化学
- 分子生物学
- 分析化学
背景
- 核酸とタンパク質を分離する従来の方法は、電気と専門機器を必要とすることが多い。
- この研究は、サンプル処理のための電気不要の代替案を提示しています。
- この方法は、固体サンプルを含む様々なサンプルタイプに適用可能です。
- サンプルの溶解にグアニジンチオシアン酸塩を使用します。
研究の目的
- PCR対応の核酸と免疫反応性タンパク質を分離する方法を開発すること。
- 分離プロセス中に実験室のインフラを必要としないこと。
- 現場で実行できるユーザーフレンドリーなプロトコルを提供すること。
使用された方法
- グアニジンチオシアン酸塩によるサンプルの溶解。
- 抽出ピペット内の吸着剤を用いたサンプルの順次通過。
- 結合した核酸とタンパク質のエタノール洗浄。
- 水溶液を用いた核酸とタンパク質の溶脱。
主要な結果
- 電気を使わずに核酸とタンパク質の成功的な分離。
- プロトコルはPCR対応の核酸の抽出を可能にします。
- 免疫反応性タンパク質はさらなる分析のために効果的に分離されました。
- 固体サンプルを含む様々なサンプルタイプへの適用可能性が実証されました。
結論
- 開発された方法は核酸とタンパク質の分離のための実用的な解決策を提供します。
- リソースが限られた環境での使用に適しています。
- このアプローチは多様な生物学的分野での研究を促進できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Electricity-free, sequential nucleic acid and protein isolation enables rapid, field-based molecular analysis where laboratory infrastructure is unavailable. This capability supports early pathogen detection, dual biomarker validation, and streamlined sample logistics in resource-limited or decentralized settings. The approach enhances predictive confidence by allowing direct genomic and proteomic corroboration from a single sample, reducing ambiguity at critical discovery and diagnostic inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven interrogation of infectious agents in diverse environments.
- Supports functional target validation by providing both nucleic acid and protein outputs from the same sample.
- Facilitates mechanistic de-risking through multi-modal biomarker analysis.
Screening & Assay Development
- Prepares validated nucleic acid and protein extracts for downstream PCR and immunoassay workflows.
- Improves assay reproducibility by minimizing sample handling and split-sample variability.
- Enables rapid, scalable screening in field or low-resource settings.
Translational & Preclinical Research
- Aligns field-collected samples with translational biomarker strategies by supporting both genomic and proteomic readouts.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and analytical flexibility.
- Reduces risk of false negatives by enabling redundant molecular confirmation.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, field diagnostics, and preclinical validation by enabling robust sample collection and dual-analyte extraction outside traditional labs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking for pathogen and biomarker identification.
- Screening: Delivers assay-ready nucleic acids and proteins for immediate or deferred analysis.
- Analytics: Provides quantitative, corroborative outputs for cross-platform comparison and decision-making.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and sample continuity from field to lab.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, reusable extraction platform adaptable to multiple sample types and workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity by enabling dual molecular analysis.
- Operational Value: Standardizes extraction protocols and eliminates dependency on electricity or specialized equipment.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency in decentralized or resource-limited settings.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, field-compatible sample analysis.
Implementation Considerations
- Requires basic molecular biology expertise for sample handling and extraction steps.
- Minimal instrumentation needed; relies on proprietary extraction pipettes and standard buffers.
- Cross-team standardization is facilitated by unified protocols for nucleic acid and protein isolation.
- Adaptable to a wide range of sample types, including liquids and solids suspended in buffer.
- Throughput is limited by manual processing; best suited for rapid, point-of-care, or low-to-moderate volume applications.
