Name: ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ幼生を用いたハイコンテンツ炎症アッセイで、銅イオン誘導損傷後の白血球遊走を自動顕微鏡で定量し、免疫調節化合物をスクリーニングする方法。この技術は創薬研究に応用可能です。

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<p class="jove_content"&gt;私たちは、優れた畜産用Nadeshdaウルフ、ナディーンEschenとスザンヌデロングに感謝します。 CWは、ヘルムホルツのプログラム &quot;から博士号フェローシップによってサポートされていました<em&gt; BioInterfaces</em&gt;国際大学院 &quot;（BIFIGS）。さらにサポートがCGにKIT-RISCの助成金によってと7欧州共同体フレームワークプログラム内のマリー·キュリー国際社会復帰グラント（PIRG07-GA-2010から267552）によって提供されていました。マリーキュリー初期研修ネットワーク（238821） - AHSは（肝臓と膵臓の開発と疾病の生物学）BOLDによってサポートされていました。 ULはDopaminet FP7（第7次フレームワークプログラム）（223744）によってサポートされていました。</p&gt;

1。動物の取り扱いチンアッセイのためにホモ接合性の二重トランスジェニックcldnB間のグループ交配から生じる3 DPFの幼虫を使います:: GFP / lysC :: DsRed2のとAB（野生型）魚を。自然産卵による受精卵を収集し、29で、それらを上げる°ペトリ皿のE3培地中のC（5 mMの塩化ナトリウム、0.17 mMの塩化カリウム、0.33 mMのCaCl 2を 、0.33 mMのMgSO 4を 、青の0.1％メチレンブルー液、pH7.0に平衡化した）。これは、プレート当たり50から70を超えない胚の密度を維持するために不可欠である。 2。ソート幼虫蛍光レポーターの発現、自発的な炎症と適切な年齢に関連する開発のための蛍光立体の下にあるすべての幼虫を確認してください。 3。スクリーニング培地の調製（常に新鮮な準備） DMSO（最終1％）、MS222（0.05 g / l）を補充したメチレンブルーせずにE3培地を準備します。 4。硫酸銅準備（常に新鮮な準備） 最初のCuSO 4を量る（M R = 159.6グラム/モル）とのdH 2 Oでの20mMストック溶液を調製120μMのCuSO 4の作業E3/DMSOの溶液（20 mMストック溶液から）（1％）/ MS-222を準備します。光からのCuSO 4ソリューションを保護します。 5。 384ウェルプレートの準備（グライナー384ウェルマイクロプレート） リバースピペッ​​トで各ウェルにE3/DMSO（1％）/ MS-222の20μlを事前に追加します。増加したピペットチップの穴は、任意の負傷を負わせずに慎重に胚を処理するために必要とされる、これは内径2 mmの先端を切断することによって行われます。各ウェル（未処理コントロールの84μl）に培地74μlを単一の幼虫を転送します。必要な場合は、ウェル内の横位置で向きの幼虫は、柔軟なエッペンドルフMicroloaderピペットチップ（; 5242 956.003エッペンドルフ）を使用します。 ロボットの液体で、以下のすべての液体処理の手順を行うすべての幼虫の同時処理を確実にするためにワークステーションを処理します。 6。薬物治療上下にピペッティングして、薬物ストックプレートの化合物を5回混ぜる。各ウェルに7.5Xの薬物ストックプレートの16μlを加え、5回混ぜる。幼虫の損傷を防止し、10μL/ sの速度で培地を分注するためのウェル内の先端の位置を調整します。ウェル内の薬剤の均一な分布を確保するため、ウェル内の培地を4回混ぜる。 7。インキュベーション 29で1時間インキュベートするスクリーニングプレート°C、光から同様のCuSO 4などの化合物を保護するために、アルミ箔で覆われている。 8。化学傷害ネガティブコントロール、ミックスの4倍を除き、各ウェルに120μMのCuSO 4ワーキング溶液10μlを加え、29℃で1時間のために再度インキュベート℃に 9。洗濯私の80μlを削除し、交換<html>化合物及びCuSO 4を削除する各ウェルに二回（20μlのステップ）からdium。 10。画像収集 90分後の初期の銅処理：倒立自動化された顕微鏡（Olympusスキャン^ R IE）で画像取得を開始します。右と左後部側線からneuromastsが表示されるように初期のzレベルを設定します。 4倍対​​物レンズ（NA = 0.13）を使用して、4フォーカルプレーンのチャネル明、Cy3およびGFP（50μmの距離）が毎時各ウェルに一度画像。 画像やデータ処理に関する追加情報のリクエストも承ります。 11。画像処理 1。データのソート RAW画像は、私たちのカスタムLabVIEWソフトウェアのスクリプトで処理されます。画像処理パイプライン内の最初の操作は、チャネル、よく、時間の点情報を用いて顕微鏡に生成されたデータのフォルダからRAW画像の選別されています。 ove_step &quot;&gt; 2。拡張焦点その後、ソフトウェアは、チャネルごとに4フォーカルプレーンから拡張されたフォーカスのイメージを作成します。 3。 RGBオーバーレイ最後のステップでは3つのチャネルから拡張された焦点画像は、最終的なRGB-オーバーレイイメージにつながることがマージされます。 4。自動化された感丘の検出パターン認識ツール（LabViewのラピッドプロトタイピングIAツール）は、RGBオーバーレイ画像内neuromastsを識別し、neuromasts周りに興味のある経験的に定義された領域を作成します。 5。定量化負傷したneuromastsを取り巻く興味のある経験的に定義された領域内に赤色蛍光白血球（赤ピクセルとして反映されています）lの eukocytes（Paol）によってccupied P ercent REA Oの主な読み出し、その結果獲得しています。平均95.27±2.11パーセント（FDA1）および95.12±でウェル（幼虫）の1.56パーセント（FDA2）が正しく検出された、その後、さらにデータ処理が施されています。生データ出力（検出された各感丘のためにPaol）txtファイルに格納され、さらに生データを処理するMATLABスクリプトのデータ入力として機能します。 12。データ処理 1。IMAPS カラーコードの生データの出力Paolのグラフィカルな可視化によって、個々の実験の成功を評価する、いわゆる炎症マップ（IMAPS）（ 図2）を実現することができます。明るい緑色は、高い初期の炎症指数を反映して、黒は炎症がないことを示します。この簡単な概要については、さらにデータ解析から除外することができます失敗した実験の迅速な同定が可能になります。 2。コントロールのアベレージングそれぞれの実験板は、反射320の化合物が含まれています化合物と時間がポイントごとに単一のデータポイントと同様に32ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、それぞれ。 32コントロールが複製の平均と標準偏差が計算されています。コントロール用の2標準偏差内でのみのデータポイントが含まれています。 3。正規化正規化は、スプレッドシートの分析によって行われます。ネガティブコントロールであるDMSOの平均値は、0に設定され、銅の制御のための最高平均Paolは、正と負の制御の間の最大差は1に設定されているので、1に設定されます。各化合物のPaolは、線形補間または実験的なプレート上の各コントロールに外挿されます。 4。最終的な読み出し：炎症性インデックス十分な複製実験（すなわち15）が行われてきた後に、反復実験から正規化された生データを読み出し、最終的な結果として、平均化され - 炎症インデックス。銅コントロールの初期の炎症指数は、時間点ゼロの100％から始まり、画像取得の開始時間（初期の銅処理後90分）に相関しています。 5。単調な指数回帰の当てはめ我々が使用して初期の炎症に向かって単調な指数関数的非線形回帰の当てはめを行う時間の経過とともに炎症の解決のために<img src="/files/ftp_upload/4203/4203eq1.jpg" alt="式（1）" /> - 0は t = 0で初期応答の尺度である、1時間以上の大きさのスロープに関連しています。 6。 2-D特徴空間プロット（ 図4） 特徴空間を生成するために、非線形回帰が適用され、クラスター分析は、このように異なる免疫調節カテゴリから興味深い候補の自動識別（抗inflammatを可能にする、特徴的な領域に特徴空間を分割するORY、抗解像度、炎症性、プロの解像度）。すべての化合物は、パラメータを0と1に基づいて2次元プロットに表示されます。 13。データの取り扱いと保管ユーザ10によって要求されたときに我々のデータ処理ルーチンは、画像やデータ処理の手順&quot;結果の概要だけでなく、詳細なビューを提供するような薬剤の画面を視覚化し表現するためにWebページを作成します。他の関連異種の生物·化学データベースへのソフトリンクは、比較と新規研究11の貴重なリソースを提供するだけでなく、統合されています。これらのルーチンによって、適切なデータ標準とメタ情報がこのデータの長期保存のために設定されています。 14。代表的な結果パイロットの画面では、640から成るライブラリを分析したFDAはgranulの開始、進行や解像度への影響について知られている生理活性物質を承認ocytic炎症反応。抗炎症薬（1）、抗分解能（2）、（3）炎症誘発性およびプロ解像度（4）：観察された効果に基づいて、我々は、アクションの異なるモードを示すことができる免疫調節表現型の4種類に分類、その単調な非線形回帰フィッティング（E AO + ALX - ）から発生するパラメータの0と1で記述することができます初期の炎症に向かって。 0 1一方、炎症反応の大きさを表す曲線の傾きを特徴づけるため、炎症の解像度を説明しています。 2-D特徴空間プロット（0対1）ですべての化合物を表示すると、別の免疫調節のカテゴリからヒット候補（ 図3）の自動識別が可能になります。 640化合物のうち、45は50％以下に初期の炎症性インデックスを減らすことによって、有意な抗炎症効果を発揮。 THI内でのカテゴリは、我々は、6の化合物は我々のアプローチの妥当性を確認した非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）の薬理学的クラスに属するが見つかりました。しかし、NSAIDは最も強力な抗炎症薬の中ではないランクインしています。別に我々はこのような例では、アンジオテンシン受容体拮抗薬（ARB）、抗生物質とプロトンポンプ阻害剤のようないくつかの追加の薬理学的薬剤クラスを発見した非ステロイド性抗炎症薬から。 7の化合物は潜在的なプロの高解像度薬の経験的に定義されているしきい値基準を満たしていた。 18薬は、陽性対照に比べて負傷したneuromastsに誇張された白血球動員の結果、炎症性効果を発揮する。 唯一の2化合物は、炎症反応のタイムリーな解決を妨げた。 パイロット画面coulからいくつかのヒット候補の抗炎症作用（上記の薬理学的薬剤クラスからの典型的な候補者）dは、後続の二次チンアッセイ（データは示さず）で用量依存的に確認することができます。主画面に加わるように4潜在的なプロ解像度薬の再テストは、アクションの指定されたモードを確認していませんでした。薬の2が高濃度（20μM）で若干の抗炎症の可能性を持っていた。 20μM - 第三薬剤は5に至るまでの薬物濃度限界以外の用量依存性の抗炎症効果を示した。第四の薬剤は、試験した濃度で炎症反応に影響を及ぼさなかった。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig1.jpg" /> 図1。チンアッセイのワークフロー。個々の化合物トランスジェニックcldnB :: GFP / lysC :: DsRed2の幼虫（3 DPF）は、手動で384ウェルマイクロタイタープレートで配布されています。薬はよくゼファー小型液体ハンドリングワークステーションを使用して、それぞれに同時に追加されます。アッセイプレートを29℃で1時間インキュベート℃でのCuSO 4を用いた治療</sub&gt; - 負傷を与え、1時間溶液（1​​0μM最終濃度）と急性炎症反応を開始します。最後に、銅溶液や薬剤が洗い流され、自動化された画像の取得は（初期の銅処理後90分）に開始されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig2.jpg" /> 図2。 Raw画像の概要画像図4の焦点面（Z = 0から3）のRAW画像が表示されます。それぞれ、チャネルCy3標識（左）とGFP（右）で50μmの距離であります。矢印は、（Z = 1,2）の例示的なneuromasts、neuromasts周りにクラスタ化された白血球の矢印（Z = 1,2）の点を示しています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig3.jpg" /> 図3。炎症マップ（IMAPS）個々の実験の成功はカラーコードで炎症反応（生データ）を反映しIMAPSで評価することができる。明るい緑は高い初期インフレを反映している<html> mmatory応答;。黒はなく、炎症がないことを示しタイムポイント0でIMAPS（左）とタイム·ポイント5（右）がはっきりと実験は、さらにデータ処理に含まれるべきであるかどうかを示します。 DMSO対照ウェル（1行目と12）は暗い緑または黒で表示され、一方銅コントロール（行13および24）は、緑の色合いを変化させるに表示されます。時間点5で、炎症はほとんどが緑色または黒の暗い色合いに示すように、銅コントロールで解決されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4203/4203fig4.jpg" /> 図4。 FDAの320化合物の2次元特徴空間のプロットは、ライブラリとそれぞれのコントロールを承認したすべての化合物の井戸が非直線に起因するパラメータは0と1に基づいて2次元特徴空間プロットで表示することができます回帰継手（d/4203/4203eq1.jpgの &quot;alt =&quot;初期の炎症に向かって/式（1） &quot;&gt;）が、この特徴空間のプロットは、薬物を示すことができる次の4つの免疫調節のいずれかのカテゴリに属する​​興味深い候補の自動識別することができますアクションの&quot;モード：抗炎症作用（1）、抗分解能（2）、（3）炎症誘発性およびプロ解像度（4） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4203/4203fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

<ol><li>Peterson, R. T., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+and+use+of+small+molecules+for+probing+biological+processes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Discovery and use of small molecules for probing biological processes in zebrafish.</a> Methods Cell Biol. 76, (2004).</li>
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<li>Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+lysozyme+C+promoter+drives+myeloid-specific+expression+in+transgenic+fish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish.</a> BMC Dev. Biol. 7, 42(2007).</li>
<li>Redd, M. J., Kelly, G., Dunn, G., Way, M., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+macrophage+chemotaxis+in+vivo%3A+studies+of+microtubule+function+in+zebrafish+wound+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Motil.+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Imaging macrophage chemotaxis in vivo: studies of microtubule function in zebrafish wound inflammation.</a> Cell. Motil. Cytoskeleton. 63, 415-422 (2006).</li>
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<li>Haas, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokine+signaling+mediates+self-organizing+tissue+migration+in+the+zebrafish+lateral+line%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Chemokine signaling mediates self-organizing tissue migration in the zebrafish lateral line.</a> Dev Cell. 10, 673-680 (2006).</li>
<li>Luetjohann, D. S., Shah, A. H., Christen, M. P., Richter, F., Knese, K., Liebel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sciencenet%27+-+towards+a+global+search+and+share+engine+for+all+scientific+knowledge%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sciencenet' - towards a global search and share engine for all scientific knowledge.</a> Bioinformatics. 27, 1734-1735 (2011).</li>
<li>Liebel, U., Kindler, B., Pepperkok, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvester%27%3A+a+fast+meta+search+engine+of+human+protein+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Harvester': a fast meta search engine of human protein resources.</a> Bioinformatics. 20, 1962-1963 (2004).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

<p class="jove_content"&gt;ここでは、全体の動物のコンテキスト内で免疫調節化合物の同定を可能にする完全に自動化されたハイスループットスクリーニング戦略を提示します。したがって、急性炎症反応のモニタリングを可能にする<emin vivoでの&gt;</em&gt;とリアルタイムインチ</p&gt;<p class="jove_content"&gt;我々は、傷への白血球動員に対する薬物の影響が完全に機能する自然免疫系の文脈で比較的容易に学ぶことができるので、創薬や薬物再利用の取り組みのための貴重なモデル生物としてゼブラフィッシュを適用するプロトコルを提供しています。我々のアプローチのユニークな利点は、化学負傷はこのように高スループット形式で自動化し、スクリーニングを可能にして、廃止されたマニュアル幼虫の操作をレンダリングするという事実である。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;さらに、有害または有毒な薬剤の効果と同様に強力なオフターゲット効果を簡単にセットアップ提案と評価することができる。 FDA承認されたライブラリは、しかし、与えられたスクリーニング濃度での毒性化合物を含んでいませんでした。それにもかかわらず、我々は、テストライブラリの同じ薬理物質のクラスに存在するメンバー間で利用可能なデータ（例えば、免疫調節表現型、薬物濃度）を比較することが明らかに毒性の化合物について提案する。あるが必要な場合は、それ以外の有望な免疫調節表現型を発揮する物質ファミリーの毒性メンバーは、より低い濃度で再テストすることができます。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;私たちは彼らの働く免疫調節効果に応じて自動的に分類する治療薬の可能性を実証した。抗炎症性化合物のカテゴリに属する​​薬剤は、独立した実験では、用量依存的にその効果を発揮する化合物の大部分で検証することができます。潜在的なプロ解像度の薬物として同定され、4つの化合物は、これまでのように確認することができませんでした。それはまた、単に解像度に影響を与えない薬はこれまで文献に記載されていないので、この特定の免疫調節カテゴリは、説明するのは困難であることを示しています。しかし、4再テスト薬の3は、高いモル濃度で抗炎症傾向を示した。経験的に定義したしきい値条件を最適化する偽陽性の数を減らすことに役立つはずです。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;また、紹介したテクニックは、白血球遊走動作に影響を与える遺伝子の突然変異の同定に利用される可能性を提供しています<sup&gt; 8</sup&gt;。</p&gt;<p class="jove_content"&gt;結び、提案手法では薬剤耐性、毒性、用量ならびに潜在的なオフターゲット効果で容易に入手可能な情報を潜在的な新たなリード構造をもたらす努力を転用、創薬や薬剤を容易にし、加速することができます。したがって、医薬品開発の初期段階で、シンプルでコストと時間を節約する戦略として機能します。</p

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td>ジメチル·スルホキシド</td><td>カール·ロート社＆株式会社KG </td><td> A994.2 </td><td></td></tr><tr><td>銅（II）硫酸塩、無水</td><td>カール·ロート社＆株式会社KG </td><td> PO23.1 </td><td></td></tr><tr><td> FDAは薬のライブラリを承認</td><td>エンツォ生命科学</td><td> BML-2841-0100 </td><td></td></tr><tr><td> 384ウェルプレートの非結合、μClear </td><td>グライナー</td><td> 781906 </td><td>黒</td></tr><tr><td>オリンパススキャン^ R </td><td>オリンポス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゼファー小型液体ハンドリングワークステーション</td><td>キャリパー</td><td></td><td></td></tr></tbody>
 </table>

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

に投与したときにゼブラフィッシュの幼虫はその小さなサイズと相対的な操作や観察のしやすさだけでなく、化合物は、単に入浴水に添加することができ、容易に吸収されているという事実に起因する1,2 -全動物の小分子の画面に特に適している&lt;1％DMSO溶液。ゼブラフィッシュの幼虫および白血球の蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック系統の可用性の光学的透明性のために、ゼブラフィッシュでは、in vivoでの急性炎症反応を監視するためのユニークな利点を提供します。その結果、高スループットの免疫調節化合物の同定を目指して、高含有量の小さな分子の画面のゼブラフィッシュを利用することは、炎症誘導のシナリオは、フィン組織のローカライズされたニックをEGの卵黄の表面に向けレーザー損傷を示唆する、3-6提案されている胚7または尾翼の切断3,5,6。これらのメソッドの主な欠点は、しかし、であったマニュアル幼虫操作の要件は、このようにハイスループットスクリーニングを防ぐために、負傷を誘導する。化学的に誘発される炎症（顎）アッセイ8の導入は、これらの障害を排除した。負傷を負わされているので、化学的に同時に扱うことができる胚の数は事実上無制限です。硫酸銅とゼブラフィッシュの幼虫の一時的な治療を選択側線系と負傷者neuromastsへの迅速な顆粒球動員の結果の有毛細胞に細胞死を誘導する。炎症反応は、化合物トランスジェニックcldnB :: GFP / lysC ::感丘細胞と同様に、赤色蛍光タンパク質標識顆粒球における緑色蛍光タンパク質を発現DsRed2の6,9ゼブラフィッシュの幼虫を使用してリアルタイムに追跡することができる。 両方の高いコンテンツと高スループット分析を可能にするであろうスクリーニング戦略を考案するために、我々は、ロボット液体ハンドリングと組み合わせた自動化されたMICRを導入しましたカスタム開発されたソフトウェアスクリプトを使用してoscopy。このスクリプトでは、負傷した緑色蛍光neuromastsを取り巻く経験的に定義されたエリア内の赤色蛍光白血球によって占め％の領域を獲得して炎症反応の自動定量化を可能にします。さらに、自動データ処理、処理、可視化、ストレージのすべてのカスタム開発され、MATLABやPythonスクリプトに基づいています。 要するに、我々は、顆粒球の炎症反応の開始、進行や解像度への影響について化学化合物のテストを許可する自動化されたHC / HT画面をご紹介します。このプロトコルは、自然免疫応答のオーケストレーションに関与する薬物のメカニズムと経路のより詳細な分析のための良い出発点を提供しています。将来的には、創薬の初期段階では耐えられない毒性やオフターゲット効果を識別する助けとすることにより薬剤開発のための手続きのリスクとコストを減らすことができます。

ここでは、免疫調節活性物質の同定を目指した新規な高含有化学的に誘発される炎症アッセイを説明します。我々は正常、炎症反応だけでなく、さらに、データ処理、解析、マイニング、およびストレージの自動定量化を可能にするカスタム開発したソフトウェアのスクリプトで自動化された顕微鏡を組み合わせています。

ゼブラフィッシュの幼魚は、サイズが小さく、操作が比較的容易であるため、個体レベルでの低分子化合物スクリーニングに特に適しています1,2。

本手順の全体的な目的は、in vivo ゼブラフィッシュ炎症アッセイを用いて、化合物の免疫調節活性を同定するための表現型スクリーニングを行うことです。まず、ゼブラフィッシュの幼魚を384ウェルプレートに分注し、次にスクリーニング対象の化合物を幼魚に添加して組織への浸透を促すことで、これを達成します。次に、組織特異的な損傷を誘発させるために硫酸銅溶液を添加します。最後に、化合物および硫酸銅を新鮮な培地で置換します。最終的に、リアルタイムin vivo顕微鏡データの解析を通じて、組織特異的な白血球浸潤の経時的な程度を示す結果を得ることができます。この手法の主な利点は、数百個体に対して同時に炎症を誘導できるため、実験および分析の自動化が可能になることです。本手順の実演は、私の研究室の博士課程学生であるChristina Whitmanが行います。チン・アッセイ（chin assay）のために、ホモ接合体ダブルトランスジェニック魚と野生型AB魚の間でグループ交配を行い、自然産卵により胚を採取します。その後、1プレートあたり50〜70個体をE3培地中で29 °Cにて受精後3日目まで育成します。蛍光ステレオ顕微鏡下で、すべての幼虫について蛍光レポーターの発現、自然炎症、および年齢に応じた適切な発達状態を確認します。スクリーニング用培地を調製し、384ウェルプレートの各ウェルに20 µLずつ分注した後、74 µLの培地で麻酔した個別の幼虫を各ウェルに転送します。この際、柔軟なマイクロピペットチップを用い、先端を2 mmの口径にカットしたピペットチップを使用してください。幼虫をウェル内で側方に向けます。薬剤処理においてすべての幼虫に同時に処置を行うため、以降のすべての液体分注ステップはロボット液体分注ワークステーションを用いて実施してください。薬剤ストックプレート内の化合物を混合するため、ピペッティングを5回行います。7.5 x 薬剤ストックプレートから16 µLをスクリーニングプレートに加え、10 µL/sの速度で5回混合します。スクリーニングプレートをアルミホイルで覆い、29 °Cで1時間インキュベートします。化学的な創傷を誘導するため、それぞれに120 µMの硫酸銅作動溶液を10 µL添加します。陰性コントロールを各ウェルに4回加え、29 °Cでさらに1時間インキュベートします。90分後から、各ウェルから80 µLの培地を除去し、新しい培地と交換することを2回繰り返し、胚を洗浄します。初回銅処理後、倒立自動顕微鏡とForex対物レンズを用いて画像を取得します。右側および左側の後側線から神経塊が見えるように初期のZレベルを設定し、各ウェルを1時間ごとに1回撮影します。明視野（Brightfield）側とGFPチャンネルの3つの明視野および4つの焦点面を使用します。カスタムのLabVIEWソフトウェアにより、各チャンネルについて4つの焦点面から拡張焦点画像が作成されます。その後、これらの画像を合成して最終的なRGBオーバーレイ画像を作成します。パターン認識ツールを用いてRGBオーバーレイ画像内の神経腫（ニューローマ）を特定し、神経腫の周囲に経験的に定義された関心領域を作成します。損傷した神経腫を取り囲む赤色蛍光白血球をスコア化し、白血球が占める面積の割合または淡色領域として一次読み取り値を算出します。平均して95%の幼虫が適切に検出され、その後、さらなるデータ処理に供することが可能です。個々の実験の成否は、炎症マップまたは眼マップを用いて評価します。淡色のデータは色分けされており、明るい緑色は初期炎症指数が高いことを示し、黒色は炎症がないことを示します。この迅速な概観により、失敗した実験を速やかに特定し、その後のデータ解析から除外することが可能です。時間 0.0 および時間 0.5 の iMap を確認することで、その実験を以降のデータ処理に含めるべきかどうかが明確に判断できます。銅コントロールはさまざまな色調の緑色で表示されますが、DMSO コントロールウェルは時間 0.5 において濃い緑色または黒色で表示されます。銅コントロールにおいて炎症がほぼ消失している場合は、コントロールを処理するために濃い緑色または黒色で示されます。32個のコントロール反復試料の平均値を算出し、標準偏差を求めます。標準偏差の2倍以内に収まるデータポイントのみを抽出します。陰性コントロールであるDMSOの平均値を0とし、銅コントロールの最大平均PAOLを1に設定して、実験プレート上の各化合物のPAOLをそれぞれのコントロールに基づいて線形補間または外挿します。反復実験から得られた正規化後の生データを平均し、炎症消退による炎症指数の最終的な読み取り値を算出します。時間の経過に伴い、初期の炎症に対する単調指数非線形回帰フィッティングを行います。0を時間0における初期反応の測定値とし、1を特徴空間を生成するための時間経過に伴う大きさの傾きとするこの式を用いることで、非線形回帰を適用し、クラスター分析によって特徴空間を特性領域に分割します。これにより、異なる免疫調節カテゴリーから興味深い候補化合物を自動的に特定することが可能になります。すべてのパラメータは、ACEが0およびaceが1のパラメータに基づいた2Dプロットに表示されます。データ処理ルーチンにより、結果のクイックオーバービューを提供するウェブページと、ユーザーのリクエストに応じた詳細ビューが作成されます。また、これらのルーチンには、比較研究や新規研究に有用なリソースを提供するため、他の関連するヘテロジェネウス、生物学的、および化学的データベースへのソフトリンクが統合されています。パイロットスクリーニングにおけるデータの長期保存に向けて適切なデータ標準およびメタ情報が設定され、FDA承認済みの既知の生物活性化合物640化合物からなるライブラリーを用いて、顆粒球性炎症反応の開始、進行、または消退への影響に関する解析が行われました。観察された効果に基づき、抗炎症、抗消退、前炎症、および促進消退という、異なる作用機序を示す可能性のある4種類の免疫調節表現型が分類されました。640化合物のうち45化合物が、初期炎症指数を50%以下に減少させることで、有意な抗炎症効果を示しました。このカテゴリーにおいて、真正の抗炎症薬の薬理学的クラスに属する6つの化合物が見出されました。このアプローチの妥当性が確認されました。このビデオを視聴することで、免疫調節化合物の活性に関する表現型in vivoスクリーニングが大部分自動化可能であり、個体全体という文脈において一貫したデータ収集と解析の両方が行えるようになることを十分に理解できるはずです。

facilitating-drug-discovery-an-automated-high-content-inflammation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。...

ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

我々の研究室では、7日齢のゼブラフィッシュの幼虫で、いくつかの異なる挙動の検出に有用な新規なハイスループット自動化されたイメージングシステムを開発しました。幼虫は、環境毒素又は薬剤に曝露された後にシステムが動作の微妙な変化を検出するために用いることができる。...

ゼブラフィッシュ幼生における自動化ハイスループット行動分析

このビデオの記事は正常に全動物脊椎動物生物を用いた化合物の試験と創薬のための新しい強力なツールを提供するゼブラフィッシュ胚を大量に感染し、分析するために確立されたハイスループット·パイプラインについて説明します。...

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生過程とモデルヒト疾患を研究するための優れた実験的な生物である。ここでは、読み出しをホールマウントin situハイブリダイゼーション （WISH）とゼブラフィッシュ胚で手動ハイスループット化学画面を実行する方法についてのプロトコルを記述します。...

ゼブラフィッシュ胚を用いた高スループットへのアプローチマニュアル小分子スクリーン

プロトコルは、生物学的製剤; とラリンジアルマスクエアウェイ アダルト ゼブラフィッシュを記述します。解剖し、フローサイトメトリー、共焦点顕微鏡と qPCR...

大人のゼブラフィッシュの経口挿管: 生理活性化合物の腸管吸収の評価モデル

このプロトコルの目的は、高スループット方法でゼブラフィッシュ稚魚の腸を介して蛍光に分類された食物の通過時間を測定することです。...

ゼブラフィッシュ稚魚を用いた消化管通過時間の高スループット測定

ここでは、ゼブラフィッシュ胚および幼虫の全製剤におけるタンパク質の蛍光抗体媒介検出に関するプロトコルを提示する。...

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

ゼブラフィッシュ異種移植片モデルは、生体内微小環境におけるヒト癌細胞のハイスループット薬物スクリーニングおよび蛍光イメージングを可能にする。当社は、自動蛍光顕微鏡を搭載したイメージングユニットを用いて、ゼブラフィッシュにおける患者由来白血病サンプルに対する大規模な自動薬物スクリーニングのワークフローを開発しました。...

ゼブラフィッシュにおける原発性腫瘍異種移植片の薬物スクリーニング

ここでは、最先端のロボット注射システムを使用して、ゼブラフィッシュの幼虫に腫瘍異種移植片を自動移植するための詳細なプロトコルを紹介します。さらに、システムの成功したパフォーマンスを示す注入ビデオと検証データを紹介します。...

がん研究と医学のためのゼブラフィッシュ幼虫への腫瘍移植の自動化

視覚的な分析（VA）は、対話的にデータを分析の新しいアプローチです。このビデオでは、我々はハイスループット生物学的実験によってもたらされるデータの過負荷の問題を議論し、そのような問題に対する解決策として、VA提案する。ビデオでは、内と場札と呼ばれるVAツールを使用して免疫学的データセット間の分析を示しています。...

ビジュアル分析手法と免疫学的データの解析を容易に

学ぶゼブラフィッシュ幼生を用いたハイコンテンツ炎症アッセイで、銅イオン誘導損傷後の白血球遊走を自動顕微鏡で定量し、免疫調節化合物をスクリーニングする方法。この技術は創薬研究に応用可能です。

ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

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