ゼブラフィッシュで自動化されたハイコンテンツ炎症アッセイ：創薬を促進する

この手順の全体的な目標は、in vivoゼブラフィッシュ炎症アッセイを使用して化合物の免疫調節活性を特定するための表現型スクリーニングを実施することです。これは、最初にゼブラフィッシュの幼生を384に分配することによって達成されます。次にスクリーニングするウェルプレートの化合物を幼虫に添加して、組織への浸透を可能にします。

次に、硫酸銅溶液を添加して組織特異的な損傷を与えます。最後に、化合物と硫酸銅は新しい媒体に置き換えられます。最終的には、リアルタイムのin vivo顕微鏡データの解析を通じて、組織特異的な白血球の流入の程度を示す結果を経時的に得ることができます。

この技術の主な利点は、数百人の個人で同時に炎症を誘発できるため、実験および分析の自動化が可能になることです。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるクリスティーナ・ホイットマンです。ホモ接合体のダブルトランスジェニックと野生AB型の魚の間でグループ交配を設定し、自然産卵によって胚を収集し、受精後3日まで摂氏29度のE3培地でプレートあたり50〜70を育てます。

蛍光立体視鏡の下ですべての幼虫を検査し、蛍光レポーターの発現、自然発生的な炎症、および適切な加齢に伴う発生を確認します。スクリーニング培地を調製し、384のウェルに20マイクロリットルを追加した後、ウェルプレートは、74マイクロリットルの培地で単一の麻酔幼虫を各ウェルに移します。2mmのボアサイズにカットされたピペットチップを使用し、フレキシブルなマイクロピペットチップを使用。

幼虫を井戸内の横方向に向ける ロボットの液体処理ワークステーションを使用して、以下のすべての液体処理手順を実施し、薬物治療のためのすべての幼虫の同時治療を確保します。ピペットを5回上下させて、ドラッグストックプレートで化合物を混合します。7.5 x ドラッグストックプレートの16マイクロリットルをスクリーニングプレートに加え、毎秒10マイクロリットルで5回混合します。

スクリーニングプレートをアルミホイルで覆い、摂氏29度で1時間インキュベートします。化学的傷害を誘発する。それぞれに10マイクロリットルの120マイクロモル硫酸銅作業溶液を追加します。

ネガティブコントロールを4回混合し、再び摂氏29度で1時間インキュベートします。各ウェルから80マイクロリットルの培地を取り出して交換することにより、胚を洗浄します 90分から2回。最初の銅処理の後、Forex対物レンズを使用して倒立自動顕微鏡で画像を取得します。

左右の後側線からの神経腫瘤が見えるように初期Zレベルを設定し、1時間に1回、それぞれの井戸を画像化します。明視野側3チャンネルとGFPチャンネルを4つの焦点面で使用。カスタムラボビューソフトウェアは、各チャンネルの4つの焦点面から拡張フォーカス画像を作成します。

次に、画像をマージして、最終的な RGB オーバーレイ イメージを作成します。パターン認識ツールは、RGBオーバーレイ画像内の神経腫瘍を特定し、神経腫瘍の周囲に経験的に定義された関心領域を作成します 損傷した神経腫を取り巻く赤い蛍光白血球がスコアリングされ、白血球が占める領域または淡い領域の割合の一次読み取りが得られます。平均して、幼虫の95%が適切に検出され、その後、さらなるデータ処理を行うことができます。

個々の実験の成功は、炎症マップまたは眼マップを使用して評価されます。淡いデータは明るい緑色で色分けされており、初期炎症指数が高いことを表し、黒は炎症がないことを示します。この迅速な概要により、失敗した実験を迅速に特定し、その後のデータ分析から除外することができます。

時間0.0と時間0.5のiMapsは、実験をさらなるデータ処理に含めるべきかどうかを明確に示しています。銅制御はさまざまな緑の色合いで表示されますが、DMSO 制御井は時間 0.5 で濃い緑または黒で表示されます。炎症は銅製のコントロールでほぼ解消され、コントロールを処理するために緑または黒の暗い色合いで示されています。

32回のコントロール反復が平均化され、標準偏差が計算されます。唯。2 標準偏差内のデータ ポイントが含まれます。ネガティブコントロールDMSOの平均値はゼロに設定され、銅コントロールの最大平均PAOLは1に設定され、各化合物のPAOLは実験プレート上のそれぞれのコントロールに線形、補間、または外挿されます。

反復実験から正規化された生データを平均化して、炎症の分解能による炎症指数である最終的な読み出しを生成します。時間の経過とともに、単調指数非線形回帰フィッティングが初期炎症に対して実行されます。この式を使用すると、ゼロがゼロに等しいときの初期応答の尺度であり、1は特徴空間を生成するための時間の経過に伴う大きさの傾きに関連付けられ、非線形回帰が適用され、クラスター分析によって特徴空間が特性領域に分割されるため、さまざまな免疫調節カテゴリから興味深い候補を自動的に識別できます。

すべてのパラメータは、パラメータACEが0、aceが1に基づいて2Dプロットに表示されます。データ処理ルーチンは、結果の概要と、ユーザーから要求された詳細なビューを提供する Web ページを作成します。他の関連する異種データベース、生物学的データベース、および化学データベースへのソフトリンクも統合されており、これらのルーチンによる比較研究や新規研究のための貴重なリソースを提供します。

パイロットスクリーンでこのデータを長期保存するために、適切なデータ標準とメタ情報が設定されており、顆粒球性炎症反応の開始進行または解決への影響について、640のFDA承認の既知の生理活性化合物のライブラリで分析が行われました。観察された効果に基づいて、抗炎症、およびプロ解決の異なる作用機序を示す可能性のある4種類の免疫調節表現型が分類されました。640の化合物のうち45は、初期炎症指数を50%以下に低下させることにより、有意な抗炎症効果を発揮しました。

このカテゴリー内で、正真正銘の抗炎症薬の薬理学的クラスに属する6つの化合物が見出されました。このアプローチの有効性を確認すると、このビデオを見た後、免疫調節化合物活性の表現型in vivoスクリーニングがどのように大幅に自動化され、動物全体の状況で一貫したデータ取得と分析が可能になるかを十分に理解できるはずです。