アミロイド前駆体タンパク質細胞内ドメインの精製と集約

この手順の目的は、A ICDとしても知られるアミロイド前駆体タンパク質の細胞内ドメインを精製し、原子間力顕微鏡によるA ICDの熱凝集と特性評価のためのプロトコルを提示することです。これは、最初にA ICDのA GST融合を細菌に発現させることによって達成されます。次に、G-S-T-A-I-C-Dタンパク質をトロンビンで切断して精製し、GSTをICDから分離し、GSTを除去します。

次に、A ICDの熱凝集が誘発されます。最後に、A ICD凝集体を原子間力顕微鏡を用いて画像化します。最終的には、A ICDを生化学的および生物物理学的分析に十分な量で均一に精製できることを示す結果を得ることができます。

複雑なクロマトグラフィーステップを必要とする既存のメソッドに対するこの手法の主な利点は、高純度で溶解性が高いことです。ICDは、標準的な試薬と機器を使用してベンチトップで分離できます。このプロトコルによって製造されたICDは、さらなる生化学的および生物物理学的特性評価に適しています。

手順のデモンストレーションはAmina tiです。私の研究室の元ポスドクであるAndres Oberer博士は、組換えA PP細胞内ドメインまたはA ICDを発現するためのA ICDの原子間力顕微鏡イメージングの実行方法を示します。まず、pgx 41ベクターで形質転換したBL 21細胞を、GSTのC末端に融合させたヒトA ICDを1つのコロニーで保有し、10ミリリットルのLBブロスにアンピシリンを接種し、翌朝激しく振とうしながら摂氏37度で一晩インキュベー

400ミリリットルのLBアンピシリンを1リットルのフラスコに入れ、5ミリリットルの一晩培養物でインキュベートします。37°Cで激しく振とうしながらインキュベートし、600ナノメートルでの光学濃度が0.4〜0.6に達するまでインキュベートします。これには通常、G-S-T-A-I-C-Dの発現を誘発するのに2〜2.5時間かかります。

0.4ミリモルのIPTGを加え、摂氏37度で5時間激しく振とうしながらインキュベートしました。細胞をGの6, 000倍で摂氏4度の15分間遠心分離し、ペレットを摂氏マイナス80度で保存します。溶解、緩衝液、氷上でのバクテリアの投入を調製した後、ペレットに20ミリリットルの緩衝液を加え、ピペットで氷上でのボルテックスとテーチオンの組み合わせを徹底的に使用します。

リースは、バクテリアペレットを懸濁し、リースに懸濁したバクテリア溶解物を予め冷却した乳化剤またはフレンチプレスに通します。30, 000 PSI でライセートを乳化剤に 2 回目に通過させ、ライセートを事前に冷却した 50 ミリリットルのチューブに収集します。15, 000倍のGと摂氏4度の溶解物を30分間遠心分離します。

すりおかしを分離し、予め冷やした50ミリリットルのチューブに移します。500マイクロリットルのグルタチオンの50%スラリーが生じた。サンプルが回転している間、摂氏4度で30分間回転させます。

インキュベーション後に新鮮な溶出バッファーを作製します。溶解液とスラリーを、コースフィルター付きの使い捨て5インチポリスチレンクロマトグラフィーカラムに注ぎます。カラムを3ミリリットルのPBSで5回洗浄します。

カラムの底にキャップをし、500マイクロリットルの室温溶出バッファーを加えます。カラムの上部にキャップをし、室温で5分間回転させます。初期の重量を冷やした1.5ミリリットルのマイクロゴミチューブに集めます。

溶出をさらに2回繰り返します。10, 000分子量のカットオフ透析膜で溶出液を4リットルのPBSで翌日に摂氏4度の一晩で透析します。さらに4リットルのPBSに対して摂氏4度で1時間透析します。

透析カセットからタンパク質を取り出し、タンパク質定量アッセイを実施して、G-S-T-A-I-C-Dの収量を決定します。400ミリリットルの培養物からの典型的な精製は、精製タンパク質の20ミリグラムを超える収率をもたらし、1ミリリットルあたり10〜20ミリグラムの濃度である。タンパク質を200マイクロリットルに分注し、分注し、摂氏マイナス80度で凍結します。

GSTの解凍からA ICDを解放するために、精製G-S-T-A-I-C-Dの200マイクロリットルとトロンビンのマイクロリットルあたり1ユニットの20マイクロリリースを翌日37°Cで一晩インキュベートし、20, 000倍Gで4°Cの30分間遠心分離することにより、凝集した材料を除去します。SUPINATEを事前に冷却したマイクロチューブに移し、GSTとトロンビンを取り除きます。50マイクロリットルの50%グルタチオンaroスラリーと50マイクロリットル、50%pとwino zaine aroスラリーをそれぞれ追加します。

室温で5分間回転させてインキュベートします。遠心分離機で短時間遠心分離し、アグロビーズを沈殿させ、サピネートを新しいチューブに移します。GSTをグルタチオンでさらに4回抽出します。

Arosは、精製されたA ICDの5マイクロリットルでタンパク質定量アッセイを行います。400ミリリットルの培養物からの典型的な収率は、0.2〜0.5ミリグラム/ミリリットルの濃度で50〜100マイクログラムです。新たに調製したA ICDをPBSで0.1ミリグラム/ミリリットルの濃度に希釈した後、サンプルを摂氏43度、800RPMで加熱シェーカーで48時間インキュベートすることにより、熱凝集を誘発しました。

サンプルを脱イオン水で20倍に希釈し、新たに劈開した上に2マイクロリットルを見つけます。マイカは、金の山羊とタッピングモードで原子間力顕微鏡を使用して、凝集したA ICDを視覚化するために、サンプルを乾燥剤で一晩乾燥させます。公称先端半径2ナノメートルのマイクロシャープ窒化物カンチレバー。

イメージング中の典型的なタッピング振幅は、カンチレバーの共振周波数で10〜20ナノメートルです。G-S-T-A-I-C-D の発現と相対的な濃縮度を次に示します。溶解後、融合タンパク質の大部分は可溶性画分中に存在するため、封入体からの抽出は必要ありません。

グルタチオンが生じたカラムから言及された材料は、純度が95%を超えています。ここに示す調製物では、カラムから言及されたタンパク質の濃度は14.5ミリグラム/ミリリットルであり、収率は22ミリグラムでした。この調製物の200マイクロリットルを20ユニットのトロンビンで一晩切断すると、融合タンパク質がほぼ100%切断されました。

使用されるトロンビンの量は、クマシによって検出されないほど十分に少ないです。青色染色、トロンビンの除去、GSTにより、材料がいくらか失われました。しかし、純度は90%を超えており、この調製では、0.35ミリグラム/ミリリットルの濃度で70マイクログラムのA ICDの収率が得られました。

FMによって画像化されたICD凝集体は、通常、ステロイド非晶質であり、サイズは50〜100ナノメートルの範囲です。シャペロンUBI Quillin 1の等モル量が凝集反応に添加された場合、凝集物質は検出されません。このビデオを見た後、EICDを精製し、その凝集を誘導し、凝集ベイA-F-M-E-I-C-Dを画像化する方法についてよく理解できるはずです。

この技術によって精製されたものは、光散乱やフィルタートラップアッセイなどの他の方法に適用して、EACD凝集に対する分子シャペロンの影響に関する質問に答えることができます。