Name: 事後組織から心筋細胞核の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶ事後組織から心筋細胞核を分離する方法。ホモジナイゼーション、密度遠心分離、蛍光活性化細胞ソーティングを用いて高純度の核を取得し、心臓生物学研究に応用できます。

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我々は、フローサイトメトリーの支援についてはマルセロ·トロに感謝したい。本研究では、スウェーデンのハートと肺財団、欧州委員会FP7 &quot;CardioCell&quot;、スウェーデンの研究評議会、AFA保険やALFによってサポートされていました。 OBは、ドイツ学術振興によってサポートされていました。

1。心臓核の単離<ol><li> 1％BSA / PBSコーティング溶液10mlとコート遠心管（Beckmanの遠心チューブ＃363664）。チューブにフタをし、それらがチューブローテーターで30分間回転させましょう。コー​​ティング溶液を除去し、遠心チューブの空気乾燥した（マウスの心臓ごとに管が異なる種からの単一のマウスの心臓、交互に最大5つのマウスの心臓や心臓の組織の1グラムの分析のために必要とされるみましょう（例えば、ヒト）処理することができます1チューブで）。 </li><li>すべての次の手順は氷の上で実行する必要があります。メスで新鮮な、またはスナップインを凍結したマウスの心臓から左心室を解剖。 （注）このプロトコルは、マウスの心臓のために最適化されていますが、また、ラットやヒトの心臓に適合させることができます。また、異なる種から心臓組織の1グラムまで使用しています。 </li><li>メスの小さな個室に試料をトリミングします。 </li><li>溶解緩衝液15ミリリットルを充填した50mlファルコンチューブに組織片を転送します。 </li><li>ホモジナイズ10秒24,000 rpmでT-25ウルトラタラックスプローブホモジナイザー（IKA）の心臓組織。 </li><li> 30ミリリットルに溶解用緩衝液と等量のホモジネートを希釈する。 </li><li>さらに組織と自由核を均一にガラスdouncer（40ミリリットル）を使用します。大クリアランス乳棒で8打を実行します。 </li><li>連続して、100μmと70μmのナイロンメッシュセルストレーナー（BD Biosciences社）を介して分離し、粗核を渡します。 </li><li>原油核スピンダウンし、10分間700×gで冷却遠心（4°C）に分離します。 </li><li>反転管によって注意深く上清を除去し、ペーパータオルで管の内側を拭いてください。核ペレットを乱さないように注意してください。 </li><li>原油核が上下にソリューションを数回ピペッティングしてショ糖緩衝液の5ミリリットルで分離溶解する。溶解したペレットに、ショ糖バッファのさらに25ミリリットルを追加します。 </li><li>コー​​ティングされた遠心チューブ（ステップ1.1参照）に新たに調製し、ショ糖緩衝液10mlを追加します。&lt;/ LI&gt; <li>慎重にステップ1.9からショ糖緩衝液に溶解し再懸濁した核ペレットを蔗糖バッファーの追加10ミリリットルを重ねる。 </li><li> JS13.1フリースイングローターにそれらを配置する前に、遠心チューブのバランスをとり、高速遠心機（ベックマンアヴァンティS-25）にローターを配置します。 </li><li> 60分間、4℃で13000×gで核サンプルをスピン。 </li><li>スピンが完了したとき、ロータから慎重にチューブを取り外し、反転チューブの上清を捨て、ペーパータオルのチューブの内側から、残りの破片を拭く。 </li><li>核格納バッファの1ミリリットル（NSBプラスバッファ）で核ペレットを溶解する。注：NSBに加えて、DNAの安定剤として1.5mMのスペルミンが含まれています。 </li><li>心筋細胞核の免疫染色は、ステップ2.1に進みます。 </li></ol> 2。フローサイトメトリーのために免疫染色<ol><li>免疫染色のために、ネガティブコントロールを用意します。核サンプルの20μlのアリコートを取り出し、NSB PlusバッファのDD 980μL。 </li><li> immunolabel心筋細胞核に1:500の希釈で核サンプルに抗中心体周辺物質1抗体（ウサギ抗-PCM-1、アトラス抗体）を追加します。ステップ2.1で調製したネガティブコントロールに抗-PCM-1抗体と同じ希釈でアイソタイプの抗体を追加します。 </li><li> 4℃で一晩、ネガティブコントロールとサンプルチューブをインキュベートします。 </li><li> NSBプラスバッファ（10分間700×gで冷却遠心（4℃）にチューブをスピンダウンし、上清を捨て、NSB Plusバッファの1ミリリットルで核ペレットを溶解）で少なくとも1回はネガティブコントロールとサンプルを洗浄します。 </li><li> 1:1000の希釈で、ネガティブコントロールとサンプルチューブに抗ウサギ蛍光二次抗体（FITCまたはAPC）を追加します。 </li><li> 1時間4℃で、ネガティブコントロールとサンプルチューブをインキュベートします。 </li><li> NSBプラスバッファ（10分間700×gで冷却遠心（4℃）にチューブをスピンダウンして、少なくとも一度はネガティブコントロールとサンプルを洗う。上清を破棄して）NSB Plusバッファの1ミリリットルで核ペレットを溶解する。 </li><li>フローサイトメトリー分析およびソートを続行します。 </li></ol> 3。フローサイトメトリー<ol><li>手順1.1で説明したようにソートし、フローサイトメトリーを開始する前に、1％BSA / PBS溶液で被覆核のコレクションチューブ（ファルコン15ミリリットル）。 </li><li> 30μmのセルストレーナーを通してサンプルとネガティブコントロールをフィルタリングし、フローサイトメーター（BD流入）に最初の負の制御をロードします。前方散乱光（FSC）、前方散乱パルス幅（FSパルス幅）と側方散乱（SSC）（ 図2AおよびB）に基づいて、核とシングレット（単核）を定義する第1および第2のゲートを定義します。サンプルにDNA染色（DRAQ5（1:500））を追加すると、最初に核の集団を識別するのに役立ちます。 </li><li>免疫標識サンプルをロードし、非心筋細胞核（PCM-1陰性）から心筋細胞核（PCM-1高い正）を分離する第3のゲートを定義します。ソートを開始（ 図2cおよびd）。 </li></ol> オプション：核DNA量（倍数性）を分析し、核への染色適切なDNA（例えば、ヘキスト33342またはDRAQ5）（ 図2e）を追加し 、細胞周期の解析を実行するために。 <ol start="4"><li>フローサイトメトリー選別した後、氷上に核を配置し、選別純度（ 図3AおよびB）を決定するために再分析します。 </li><li> 15分間冷却遠心機で1500×gでコレクションチューブ内のソート済み核スピンダウンする。 </li><li>下流のアプリケーションと互換性の緩衝液中で核ペレットを溶解する。 </li></ol> 4。代表的な結果核の形態との整合性は、DNA染色により評価し、顕微鏡（ 図1）によって可視化することができます。成功したPCM-1標識は、落射蛍光顕微鏡により、フローサイトメトリー（ 図1、図2CおよびD）で評価することができる。 PCM-1-positiveと負の集団がよく（ 図2cおよびd）互いに分離する必要があります。マウスの左心室にすべての核の約30％が心筋細胞核（ 図2D）でなければなりません。純度のソートは、再分析ソート核（ 図3a及びb）によって評価することができる。両方の原子核の集団は95％を超えて選別純度を持っている必要があります。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> 図1。 PCM-1は心筋細胞の核を識別します。心臓核（）は、成体マウスの心臓にPCM-1（b）に及びNkx2.5（C）に対する抗体で染色されています。 （d）のPCM-1-標識心筋細胞の核細胞質に囲まれた（ミオシン重鎖（MHC））と転写因子Nkx2.5を発現し、PCM-1染色（スケールバーは20μmと10心筋細胞核の正確な識別を文書化されているμmの（D、挿入図））。 （e）のDNAを用いて可視化心臓核分離株はDRAQ5を染色する。 （FおよびG）Cardiomyocyte核は、PCM-1（スケールバーは10μm）に対する抗体で標識されています。 （注）、組織切片の筋細胞核内および単離された核（矢印）のPCM-1のepinuclear染色パターン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> 図2。心筋細胞核のフローサイトメトリー選別（）心臓核は前方散乱光（FSC）と側方散乱（SSC）によって識別されます。 （b）は第二のゲートは、FSCとFSパルス幅5で、単一の核を識別します。 （c、d）の蛍光ゲーティングは、心臓組織から心筋細胞核の分離（PCM-1陽性）と非心筋細胞（PCM-1陰性）が核になります。マウスの心筋細胞はほとんど（&gt; 80％）二倍体（2n）である（e）は、唯一の小さなサブセットの（4n）6倍体である。 （注）、人間の心筋細胞は倍数性核（&gt; 2n）の7,8の高い周波数が含まれています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <stroNG&gt;図3。ソートされた心筋細胞と非心筋細胞核の純度分析。ソートされた非心筋細胞（）と心筋細胞核（b）の再解析。両集団は99％を超えるソート純度を示しています。

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</ol>

利害の衝突が宣言されません。

心筋細胞核の正確な識別は、心筋2,3の再生過程の分析のために重要である。新鮮な組織から心筋細胞を分離する従来の手法は、主に細胞外マトリックスタンパク質の酵素消化と低速遠心分離により間質細胞からの後続の精製に基づいています。胚性幹細胞（ESC）から生きている心筋細胞のさらなる精製は、そのようなSIRPA 9またはミトコンドリアの染料10などの表面マーカーで免疫標識により行うことができ、固定の心筋細胞は、そのようなミオシン重鎖（MHC）あるいは次のような核タンパク質として細胞質のマーカーにより識別することができますGATA4またはNkx2.5。しかし、Nkx2.5とGATA4の発現は、成熟した心筋細胞に限定されず、また、開発中および心筋梗塞後の11,12前駆細胞で検出することができます。心筋細胞を識別するための遺伝的戦略は、最高の特異性が、Cを示してannotは、大規模な動物モデルやヒト1で適用されます。既存戦略の限界は、増殖、アポトーシスおよびキメラ1,13としてまれな事象の定量化に頼る論争の結論につながって...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1。溶解バッファー </td></tr><tr><td> 試薬の名前 </td></tr><tr><td> 0.32Mスクロース</td></tr><tr><td> 10mMトリス-HCl液（pH = 8） </td></tr><tr><td> 5mMのCaCl 2を </td></tr><tr><td> 5mMの酢酸マグネシウム</td></tr><tr><td> 2.0mMのEDTA </td></tr><tr><td> 0.5mMのEGTA </td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 2。ショ糖バッファ </td></tr><tr><td> 試薬の名前 </td></tr><tr><td> 2.1 Mのショ糖</td></tr><tr><td> 10mMトリス-HCl液（pH = 8） </td></tr><tr><td> 5mMの酢酸マグネシウム</td></tr><tr><td> 1mMのDTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 3。核貯蔵緩衝液（NSBプラス） </td></tr><tR&gt; <td> 試薬の名前 </td></tr><tr><td> 0.44 Mショ糖</td></tr><tr><td> 10mMトリス-HCl液（pH = 7.2） </td></tr><tr><td> 70mMのKClを</td></tr><tr><td> 10mMのMgCl 2 </td></tr><tr><td> 1.5 mMのスペルミン</td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 試薬および器具 </td><td> 会社 </td></tr><tr><td>アイソタイプウサギIgG-ChIP用グレード、＃ab37415 </td><td>アブカム</td></tr><tr><td>ウサギ抗-PCM-1抗体、＃HPA023374 </td><td>アトラス抗体</td></tr><tr><td>ロバ秒。抗体、抗ウサギアレクサ488弗素、＃-21206または同等秒。蛍光抗体</td><td>ライフテクノロジーズ</td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td>セルストレーナーは30μm、70μmと100μm </td><td> BDバイオサイエンス</td></tr><tr><td>ガラスdouncer（40ml）および&quot;L&quot;を乳棒</td><td> VWR（ウィートン工業株式会社） </td></tr><tr><td> T-25ウルトラタラックスホモジナイザー</td><td> IKAドイツ</td></tr><tr><td>分散ツールS25 N-18 G </td><td> IKAドイツ</td></tr><tr><td>ベックマン·アヴァンティ遠心</td><td>ベックマン·コールター</td></tr><tr><td>ファルコンチューブ15ミリリットルと50ミリリットル</td><td> VWR </td></tr><tr><td>ベックマン遠心チューブ＃363664 </td><td>ベックマン·コールター</td></tr><tr><td> JS13.1フリースイングローター</td><td>ベックマン·コールター</td></tr><tr><td>流入メーター</td><td>ベックマン·コールター</td></tr><tr><td>チューブローテーター</td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

事後組織から心筋細胞核の分離

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

ほとんどの戦略は、唯一の細胞マーカータンパク質1に依存しているとして、心筋細胞の核の同定は、組織切片に挑戦されています。そのような増殖およびアポトーシスとして心筋細胞では稀なイベントは、心筋細胞核の正確な同定は、恒常性と病理学的状態2の細胞の更新を分析する必要があります。ここでは、中心体周辺物質1（PCM-1）およびそれ以降のフローサイトメトリー選別に対する抗体を用いた密度の堆積作用と免疫標識によって死後組織から心筋細胞核を単離する方法を提供します。この戦略は、新鮮な組織と凍結アーカイブ材料にも同様の作業の利点を有するハイスループット解析と分離することができます。これにより、既にバイオバンクで収集された材料を研究することができます。この手法は適用可能で、種の広い範囲でテストし、そのような炭素14年代測定3、セル-CYなどの複数のダウンストリームアプリケーションに適していますCLE分析4、チミジン類似体の可視化（例えば、BrdUとIDU）4、トランスクリプトームとエピジェネティクス解析。

心臓核密度沈降を介して分離し、フローサイトメトリーにより心筋細胞核を識別し、ソートするための中心体周辺物質1（PCM-1）に対する抗体で免疫標識されています。

心筋細胞の核の同定は、ほとんどの手法が細胞質マーカータンパク質のみに依存しているため、組織切片において困難であった1。稀なイベント...

本手順の全体的な目的は、死後組織から心筋細胞核を単離することです。まず、プローブホモジナイザーとガラスダウンナーを用いて組織をホモジナイズし、続いて数回のろ過工程を行います。次に、密度沈降遠心分離法により、他の細胞画分から核画分を単離します。次に、心筋細胞核をPCM1に対する抗体で免疫標識します。最終ステップとして、蛍光活性化細胞分級法（FACS）を用いて標識された心筋細胞核を単離します。最終的に、さらなるダウンストリーム操作の直前に、分級した核画分を再解析することで心筋細胞核の純度を確認します。この手法の主な利点は、新鮮な組織または凍結保存されたアーカイブ組織のいずれからでも、心筋細胞核を高スループットに同様の精度で解析できることです。心筋細胞におけるDNAベースの研究は、いくつかの理由から特に困難です。第一に、心筋細胞は心臓内の細胞の約20〜30%しか占めていないためです。さらに、それらはかなりの程度まで核を有しています。また、心筋細胞はかなりの程度まで多倍体です。ここで述べる手法は、これらすべての障害を克服するものです。操作を開始する前に、1% BSA含有PBSコーティング溶液10 mLを用いて超遠心管をコーティングします。チューブを30分間回転させた後、コーティング溶液を取り除き、自然乾燥させます。メスを用いて、急速冷凍したマウス心臓から左心室を切り出し、心核の分離手順を開始します。切り出した検体を小さな断片に切り分け、15 mLの溶解バッファーを満たした50 mLコニカルチューブに組織片を移します。次に、プローブ型ホモジナイザーを用いて、24,000 RPMで10秒間心臓組織をホモジナイズし、その後、同量の溶解バッファーを加えてホモジネートを30 mLまで希釈します。ホモジネートをガラス製ダウンホモジナイザーに移し、隙間の大きいペッスルを用いて8回ストロークし、核を遊離させます。次に、粗抽出した核をろ過します。まず100 µmのセルストレーナーでろ過し、続いて70 µmのセルストレーナーを用いて新しい50 mLコニカルチューブに回収します。その後、粗抽出した核の分離液を700 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。チューブを倒して上清を慎重に取り除き、チューブ内部をペーパータオルで拭き取ります。その際、核のペレットを乱さないように注意してください。ピペットで溶液を数回吸い上げ、出しながら、粗抽出した核を再懸濁させます。5 mLのスクロース緩衝液で単離し、次に核懸濁液にさらに25 mLのスクロース緩衝液を加えます。続いて、あらかじめ準備しておいたコート済み超遠心管のひとつに、調製したばかりのスクロース緩衝液を10 mL加えます。その後、再懸濁した核ペレット溶液を緩衝液の上に慎重に重層させます。フリースイングローターでチューブのバランスを調整した後、ローターを高速度遠心機にセットし、核サンプルを13,000 ×g、4 °Cで60分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、チューブをローターから慎重に取り出し、再度転倒混和します。上清を廃棄するために、前述と同様にペーパータオルでチューブ内壁に残った残渣を拭き取り、その後、核ペレットを1 mLの核保存バッファーで再懸濁します。免疫染色の手順を開始する前に、核サンプルの20 µL分注量をファルコンチューブに移します。分注量に980 µLの核保存バッファーを加え、チューブに「陰性対照」とラベルを貼ります。次に、核サンプルと陰性対照の各チューブに、1:500の希釈率でanti-PCM1抗体を加えます。その後、両方のチューブを4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、チューブを核保存バッファーで洗浄し、上清を除去した後、核ペレットをさらに1 mLの核保存バッファーに再懸濁します。次に、1:100に希釈した抗ラビット蛍光二次抗体を細胞サンプルに添加し、4°Cで1時間インキュベートします。核保存バッファーでチューブを洗浄した後、ビデオの冒頭と同様にBSAとPBSで核回収チューブをコーティングし、フローサイトメトリーによるソーティングおよび解析のため、ペレットを1 mLの核保存バッファーで再懸濁します。サンプルとネガティブコントロールをそれぞれ個別の30 µmセルストレーナーでろ過します。ロードの直前に、DNA染色剤を添加してください。核集団を同定するため、1/500に希釈します。ネガティブコントロールをフローサイトメーターにロードします。ここに示すドットプロットと同様に、前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）のパラメータを用いて、心核を定義するための最初のゲートを設定します。次に、前方散乱光と前方散乱光パルス幅のパラメータを用いて、ここに示されているDOTプロットと同様に、単一核細胞の周囲に2つ目のゲートを作成します。続いて、免疫ラベル化したサンプルをロードし、PCM-1陽性の心筋細胞核とPCM-1陰性の非心筋細胞核を区別するための3つ目のゲートを設定します。核DNA染色を用いてDNA含有量を分析し、このヒストグラムで例示されている分析と同様に細胞周期分析を行います。PCM1陽性に基づいて核を分取した後、分取した核を氷上に置き、分取サンプルの各分画を再解析して分取純度を決定します。最後に、分取した核を回収チューブ内で1500 ×g、4 °Cで15分間遠心分離します。上清を捨てた後、目的の下流アプリケーションに適したバッファーで核ペレットを再懸濁します。この最初の図では、成体マウスの心臓を核染色剤およびPCM1、心臓転写因子NKX2.5、ミオシン重鎖（MHC）に対する抗体で染色しました。ここでは、前図のオーバーレイの拡大図を示しています。白く標識されたPCM1陽性の核が、赤色の転写因子NKX2.5を発現し、緑色の心筋細胞質に囲まれていることに注目してください。これらのデータは、PCM1染色が心筋細胞核を正確に識別できることをまとめて示しています。挿入図は心筋細胞核におけるPCM1の核周縁（epi nuclear）染色パターンを強調しており、これは続く3つの図に描かれた実験における矢印でもさらに示されています。単離した心臓核をDNA染色のDRAC5およびPCM1に対する抗体で染色しました。ここでは、前の2つの図を重ね合わせたものであり、矢印は再び単離心筋細胞核におけるPCM1の核周縁染色パターンを強調しています。このドットプロットは、この方法で単離された核の約30%が、PCM oneのラベルによって示されるように心筋細胞核であることを証明しています。最後に、これらのヒストグラムが示すように、マウス心筋細胞核は主に2Nピークで示される二倍体であり、4Nの小さなピークで示されるように、ごく一部のみが四倍体です。この手法の利点の一つは、他の種にも容易に適用できることです。ヒトの場合と同様に。

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

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