事後組織から心筋細胞核の分離

この手順の全体的な目標は、死後組織から心筋細胞の核を分離することです。これは、最初にプローブホモジナイザーとガラスダウナーで組織を均質化し、続いていくつかのろ過ステップを行うことで達成されます。第2のステップは、密度沈降遠心分離法により、核画分を他の細胞画分から単離することです。

次に、心筋細胞の核をPCM1に対して誘導した抗体で免疫標識します。最後のステップは、蛍光活性化細胞ソーティングにより、標識された心筋細胞核を単離することです。最終的には、さらなる下流の操作の直前に、選別された核分画の再分析により、心筋細胞の核の純度が確認されます。

この技術の主な利点は、心筋細胞の核を新鮮または凍結のアーカイブ組織からハイスループットで同等に分析できることです。心筋細胞におけるDNAベースの研究は、いくつかの理由で特に困難です。まず、心筋細胞は心臓の細胞の約20〜30%しか構成していません。

さらに、それらはかなりの程度まで核化されています。さらに、心筋細胞はかなりの程度倍数体です。ここで説明する方法は、これらすべてのハードルを克服します。

手順を開始する前に。超遠心チューブに10ミリリットルの1%BSAとPBSコーティング溶液をコーティングします。チューブを30分間回転させた後、コーティング液を取り出し、自然乾燥させます。

メスを使用して、スナップ凍結マウスの心臓から左心室を解剖することにより、心臓核の分離手順を開始します 解剖した標本を小さなセグメントにトリミングし、組織片を15ミリリットルの溶解緩衝液で満たされた50ミリリットルの円錐管に移します。次に、プローブホモジナイザーで24, 000 RPMで10秒間心臓組織をホモジナイズし、次にホモジネートを最大30ミリリットルの等量の溶解緩衝液で希釈します。ホモジネートをガラスダウンホモジナイザーに移し、大きなクリアランスペトルから8ストロークを使用して核を解放します。

次に、粗い原子核を通過させます。最初に100ミクロンのセルストレーナーで分離し、次に70ミクロンのセルストレーナーで新しい50ミリリットルの円錐管に分離します。次に、原原子核分離株をGの700倍、摂氏4度で10分間スピンダウンします。

チューブを反転させて上澄みを慎重に取り除き、チューブの内側をペーパータオルで拭きます。原子核ペレットを乱さないように注意してください。溶液を数回上下にピペットで動かし、粗核を再懸濁します。

5ミリリットルのショ糖緩衝液で単離し、次にさらに25ミリリットルのショ糖緩衝液を核懸濁液に加えます。次に、調製したばかりのショ糖緩衝液10ミリリットルを、事前に調製したコーティングされた超遠心チューブの1つに加えます。次に、再懸濁した核ペレット溶液をバッファーに慎重に重ねます。

自由スイングローターでチューブのバランスをとった後、ローターを高速遠心分離機に入れ、核サンプルを13,000倍gおよび摂氏4度で60分間回転させます。スピンが完了したら、ローターからチューブを慎重に取り外し、再度反転させます。上清を捨てるには、以前と同様にチューブの内側から残った破片をペーパータオルで拭き取り、その後、核ペレットを1ミリリットルの核貯蔵バッファーに再懸濁します。

免疫染色手順を開始する前に、20 μリットルの核サンプルをファックスチューブに移します。980マイクロリットルの核貯蔵バッファーをアリコートに加え、チューブのネガティブコントロールにラベルを付けます。次に、抗PCM 1抗体を核サンプルとネガティブコントロールチューブに1〜500の希釈で追加します。

次に、両方のチューブを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日。チューブを核貯蔵バッファーで洗浄し、上清を廃棄した後、核ペレットを別のミリリットルの核貯蔵バッファーに懸濁します。

次に、抗ラビッド蛍光二次抗体を細胞サンプルに1〜100希釈で添加し、摂氏4度で1時間インキュベートします。核貯蔵バッファーでチューブを洗浄した後、ペレットを1ミリリットルの核貯蔵バッファーに懸濁し、フローサイトメトリーソーティングと分析を行います 核をコーティングした後、ビデオの冒頭にあるように、BSAおよびPBSを含むコレクションチューブは、サンプルをろ過し、個々の30ミクロンセルストレーナーを介してネガティブコントロールを開始します。ロードする直前に、A DNA染色液を添加します。

核集団の同定のために1〜500希釈液を追加します。ネガティブコントロールをフローサイトメーターにロードします。前方散乱光と側方散乱光のパラメーターを使用して、ここに示す DOT プロットと同様に、心核を定義するための最初の歩行を配置します。

次に、前方散乱と前方散乱のパルス幅パラメータを使用して、ここに示すDOTプロットと同様に、原子核一重項の周囲に2つ目のゲートを作成します。次に、免疫標識サンプルをロードし、PCMの陽性心筋細胞核とPCMの陰性の非心筋細胞核を区別するための3番目のゲートを配置しました。核DNA染色試薬を使用してDNA含量を分析し、このヒストグラムで示されている分析と同様の細胞周期分析を実行します。

PCM 1陽性に基づいて核を選別した後、選別した核を氷上に置き、選別された各サンプルのアリコートを再分析して、選別純度を決定します。最後に、選別された原子核をコレクションチューブ内で15分間、Gの1500倍、摂氏4度でスピンダウンします。廃棄後、上清は、目的の下流アプリケーションに適合したバッファーに核ペレットを懸濁します。

この最初の図では、成体マウスの心臓を核色素とPCM色素、murn心臓転写因子N KX 2.5、およびミオシン重鎖またはMHCに対する抗体で染色しました。ここでは、前の図のオーバーレイのクローズアップを示しています。白色で標識された核のPCMが、赤で転写因子NK X 2.5を発現し、緑で心筋細胞の細胞質に囲まれていることに注意してください。

これらのデータを組み合わせることで、PCM 1 染色が心筋細胞の核を同定する精度が実証されています。挿入図は、これらの次の3つの図に示されている実験の矢印によってさらに示されるように、筋細胞核におけるPCM oneのエピ核染色パターンを強調しています。これは、心核分離株をDNA染色DRAC 5で染色し、PCM oneに対する抗体で染色しました。ここでは、前の2つの図を重ね合わせると、矢印は単離された心筋細胞核におけるPCM oneのエピ核染色パターンを再び強調しています。

このドットプロットは、この方法で単離された核の約30%が、PCM One標識で示されているように心筋細胞の核であることを示しています。最後に、これらのヒストグラムが示すように、マウス心筋細胞の核は、2つのNピークで示されるように主に二倍体であり、小さな4つのNピークで示されるように、小さなサブセットのみが四倍体です。この手法の利点の1つは、他の種に簡単に適応できることです。

人間については。