事後組織から心筋細胞核の分離

本手順の全体的な目的は、死後組織から心筋細胞核を単離することです。まず、プローブホモジナイザーとガラスダウンナーを用いて組織をホモジナイズし、続いて数回のろ過工程を行います。次に、密度沈降遠心分離法により、他の細胞画分から核画分を単離します。

次に、心筋細胞核をPCM1に対する抗体で免疫標識します。最終ステップとして、蛍光活性化細胞分級法（FACS）を用いて標識された心筋細胞核を単離します。最終的に、さらなるダウンストリーム操作の直前に、分級した核画分を再解析することで心筋細胞核の純度を確認します。

この手法の主な利点は、新鮮な組織または凍結保存されたアーカイブ組織のいずれからでも、心筋細胞核を高スループットに同様の精度で解析できることです。心筋細胞におけるDNAベースの研究は、いくつかの理由から特に困難です。第一に、心筋細胞は心臓内の細胞の約20〜30%しか占めていないためです。

さらに、それらはかなりの程度まで核を有しています。また、心筋細胞はかなりの程度まで多倍体です。ここで述べる手法は、これらすべての障害を克服するものです。

操作を開始する前に、1% BSA含有PBSコーティング溶液10 mLを用いて超遠心管をコーティングします。チューブを30分間回転させた後、コーティング溶液を取り除き、自然乾燥させます。

メスを用いて、急速冷凍したマウス心臓から左心室を切り出し、心核の分離手順を開始します。切り出した検体を小さな断片に切り分け、15 mLの溶解バッファーを満たした50 mLコニカルチューブに組織片を移します。次に、プローブ型ホモジナイザーを用いて、24,000 RPMで10秒間心臓組織をホモジナイズし、その後、同量の溶解バッファーを加えてホモジネートを30 mLまで希釈します。ホモジネートをガラス製ダウンホモジナイザーに移し、隙間の大きいペッスルを用いて8回ストロークし、核を遊離させます。

次に、粗抽出した核をろ過します。まず100 µmのセルストレーナーでろ過し、続いて70 µmのセルストレーナーを用いて新しい50 mLコニカルチューブに回収します。その後、粗抽出した核の分離液を700 ×g、4 °Cで10分間遠心分離します。

チューブを倒して上清を慎重に取り除き、チューブ内部をペーパータオルで拭き取ります。その際、核のペレットを乱さないように注意してください。ピペットで溶液を数回吸い上げ、出しながら、粗抽出した核を再懸濁させます。

5 mLのスクロース緩衝液で単離し、次に核懸濁液にさらに25 mLのスクロース緩衝液を加えます。続いて、あらかじめ準備しておいたコート済み超遠心管のひとつに、調製したばかりのスクロース緩衝液を10 mL加えます。その後、再懸濁した核ペレット溶液を緩衝液の上に慎重に重層させます。

フリースイングローターでチューブのバランスを調整した後、ローターを高速度遠心機にセットし、核サンプルを13,000 ×g、4 °Cで60分間遠心分離します。遠心分離が完了したら、チューブをローターから慎重に取り出し、再度転倒混和します。上清を廃棄するために、前述と同様にペーパータオルでチューブ内壁に残った残渣を拭き取り、その後、核ペレットを1 mLの核保存バッファーで再懸濁します。

免疫染色の手順を開始する前に、核サンプルの20 µL分注量をファルコンチューブに移します。分注量に980 µLの核保存バッファーを加え、チューブに「陰性対照」とラベルを貼ります。次に、核サンプルと陰性対照の各チューブに、1:500の希釈率でanti-PCM1抗体を加えます。

その後、両方のチューブを4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、チューブを核保存バッファーで洗浄し、上清を除去した後、核ペレットをさらに1 mLの核保存バッファーに再懸濁します。

次に、1:100に希釈した抗ラビット蛍光二次抗体を細胞サンプルに添加し、4°Cで1時間インキュベートします。核保存バッファーでチューブを洗浄した後、ビデオの冒頭と同様にBSAとPBSで核回収チューブをコーティングし、フローサイトメトリーによるソーティングおよび解析のため、ペレットを1 mLの核保存バッファーで再懸濁します。サンプルとネガティブコントロールをそれぞれ個別の30 µmセルストレーナーでろ過します。ロードの直前に、DNA染色剤を添加してください。

核集団を同定するため、1/500に希釈します。ネガティブコントロールをフローサイトメーターにロードします。ここに示すドットプロットと同様に、前方散乱光（FSC）と側方散乱光（SSC）のパラメータを用いて、心核を定義するための最初のゲートを設定します。

次に、前方散乱光と前方散乱光パルス幅のパラメータを用いて、ここに示されているDOTプロットと同様に、単一核細胞の周囲に2つ目のゲートを作成します。続いて、免疫ラベル化したサンプルをロードし、PCM-1陽性の心筋細胞核とPCM-1陰性の非心筋細胞核を区別するための3つ目のゲートを設定します。核DNA染色を用いてDNA含有量を分析し、このヒストグラムで例示されている分析と同様に細胞周期分析を行います。

PCM1陽性に基づいて核を分取した後、分取した核を氷上に置き、分取サンプルの各分画を再解析して分取純度を決定します。最後に、分取した核を回収チューブ内で1500 ×g、4 °Cで15分間遠心分離します。上清を捨てた後、目的の下流アプリケーションに適したバッファーで核ペレットを再懸濁します。

この最初の図では、成体マウスの心臓を核染色剤およびPCM1、心臓転写因子NKX2.5、ミオシン重鎖（MHC）に対する抗体で染色しました。ここでは、前図のオーバーレイの拡大図を示しています。白く標識されたPCM1陽性の核が、赤色の転写因子NKX2.5を発現し、緑色の心筋細胞質に囲まれていることに注目してください。

これらのデータは、PCM1染色が心筋細胞核を正確に識別できることをまとめて示しています。挿入図は心筋細胞核におけるPCM1の核周縁（epi nuclear）染色パターンを強調しており、これは続く3つの図に描かれた実験における矢印でもさらに示されています。単離した心臓核をDNA染色のDRAC5およびPCM1に対する抗体で染色しました。ここでは、前の2つの図を重ね合わせたものであり、矢印は再び単離心筋細胞核におけるPCM1の核周縁染色パターンを強調しています。

このドットプロットは、この方法で単離された核の約30%が、PCM oneのラベルによって示されるように心筋細胞核であることを証明しています。最後に、これらのヒストグラムが示すように、マウス心筋細胞核は主に2Nピークで示される二倍体であり、4Nの小さなピークで示されるように、ごく一部のみが四倍体です。この手法の利点の一つは、他の種にも容易に適用できることです。

ヒトの場合と同様に。