視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

本手順の全体的な目的は、非緑色蛍光カルシウム指示薬を用い、脳切片におけるGFPタグ付きニューロンの刺激誘発性カルシウム応答を、空間的および時間的にモニタリングすることです。まず、特定の細胞でGFPを発現するトランスジェニックマウスから脳を摘出し、次にマイクロトームを用いて組織切片を作製することでこれを達成します。

次に、脳細胞に染料を取り込ませるため、カルシウム指示薬染料の負荷溶液をスライスにピペッティングします。最終ステップとして、共焦点顕微鏡を用いて蛍光細胞のタイムスタンプ記録を行います。最終的に、GFPタグ付きニューロンにおけるカルシウム応答を、マルチカラーカルシウムイメージング解析を用いて示します。

共焦点顕微鏡を用いた既存の手法に対する本技術の主な利点は、赤色シフトした蛍光カルシウム指示薬を用いることで、緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識されたニューロン内のカルシウムをイメージングできる点にあります。この赤色蛍光色素の大きなストークスシフトにより、単一の励起波長を用いて、緑色GFPと赤色蛍光を組み合わせた多色解析が可能になります。この手法のアイデアは、遺伝的な蛍光標識である緑色蛍光タンパク質を用いてのみ同定可能なニューロンにおいて、カルシウムシグナルをモニタリングするという課題に直面した際に得られました。

これから本手順のいくつかの重要なステップを実演します。まず、加熱したアガロース溶液を正方形のペトリ皿に高さ1cmまで注ぎ、冷却・凝固させた後、4%アガロースゲルを1立方センチメートルのブロック状に切り分け、保存用のボトルに入れます。マウスを断頭した後、カミソリの刃を用いて、前頭骨から外後頭隆起に向かって正中矢状方向に頭皮を切開します。

続いて、切開した頭皮をまず吻側外側方向へさらに開きます。次に腹側方向へ開きます。その後、外側に2箇所、吻側に1箇所の切開を加えます。

小型のスプリングシザーを用いて大後頭孔から慎重に頭蓋骨を切り離します。この時点で、後頭骨、間頂骨、および頂骨が分離している必要があります。硬膜がまだ残っている場合は、脳への損傷を防ぐため、ピンセットで慎重に取り除いてください。

次に、鱗状骨、前篩骨、および前頭孔を除去します。これで、反転させたマイクロスプーンスパチュラを用いて脳を容易に取り出すことができ、脳神経を切断することが可能です。脳は、耐切創性の表面に腹側を下にして置くようにしてください。

片刃カミソリを使用して小脳を除去します。この直線的な切断面が、冠状断の脳切片を作成するために脳をプレートに固定する際の基準となります。次に、速乾性の高性能シアノアクリレート系接着剤（瞬間接着剤）を少量用い、切断面を下にして脳をミクロトームのベースプレートに接着します。

その後、スライス中の脳を支持し固定するために、1 cubic centimeterのアガーゲルのブロックを脳の腹側からミクロトームのベースプレートに接着します。接着剤が乾燥した後、6 °Cに冷却し酸素飽和させた細胞外液を満たしたミクロトームのバスにプレートを浸します。次に、低速で脳を300 micronsの厚さでスライスし、脳全体が切片化されるまで冠状面の脳切片を回収します。

次に、onic F1 27粉末にDMSO溶液を加えて、20%onic F1 27 DMSO溶液を調製します。続いて、溶液を直接2分間ソニケーションして溶解させます。その後、50 µgの細胞透過性furred amが入ったチューブに、20%onic F1 27溶液を5 µL加えます。

ピペットで溶液を混合します。次に、混合液に細胞外液を45 µL加え、ボルテックスで攪拌します。続いて、さらに325 µLの細胞外液を加え、チューブをさらに3分間超音波処理します。

ソニケーション後、1.156 millilitersの酸素飽和細胞外液を加え、最終的なカルシウムインジケーターD負荷溶液を作成します。冠状断脳切片を、酸素飽和細胞外液を満たした6ウェル細胞培養プレートに、1ウェルあたり最大6枚まで移します。その後、脳切片を傷つけないように注意しながら、チャンバーから酸素飽和細胞外液を吸引します。

次に、カルシウム指示薬D負荷溶液750 µLを各ウェルに直接ピペッティングします。脳切片がrore amを含む溶液で覆われていることを確認してください。その後、切片を酸素・二酸化炭素細胞培養インキュベーター内で37 °Cにて45～60分間インキュベートします。

インキュベーションの終了後、細胞への過剰負荷を防ぐため、カルシウム指示薬DIローディング溶液を新鮮な酸素供給済み細胞外液に交換します。刺激によって誘発される蛍光信号の変化をモニタリングするため、赤色蛍光負荷した脳スライスの一片を記録チャンバーに移し、任意の位置に配置します。チャンバーを共焦点顕微鏡装置に装着した後、酸素供給済み細胞外液でスライスを10分間灌流し、過剰な細胞外カルシウム指示薬染料を除去します。

記録チャンバーから排出した後、PERFUSE eightを真空ボトルに回収します。次に、顕微鏡を用いて低倍率でスライスを観察します。スライスの向きを確認し、目的の領域（本法では脳の視床下部領域）を特定します。

その後、高倍率に切り替えます。GFP画像を取得し、同時にURA赤色信号の蛍光強度を確認することで、スライス内から目的の細胞を探します。レーザー出力を、URA赤色蛍光強度の変化を測定でき、かつ2つの蛍光色素の退色が起こらない値に調整します。

次に、fureおよびGFPシグナルを収集するため、0.5から2 Hzの速度で画像取得を開始します。この図は、脳の冠状切片におけるGN、RHR Tau GFPニューロンの共焦点画像を示しています。これは、脳切片にfure amをロードした後に観察される比較的均一な蛍光シグナルであり、こちらはカルシウムインジケーター染料をロードしたニューロンを示すマージ画像です。

以下は、異なる視床下部脳領域にある個々のGFPタグ付きニューロンにおける、体細胞刺激誘発性カルシウム応答の例です。異なる視床下部核のGN RHR発現ニューロン間の明確なカルシウム信号は、習得後であれば、同一期間における特定の細胞のカルシウム総変化量の推定値として曲線下面積を用いて比較することが可能です。適切に実施すれば、カルシウム指示薬染料の調製、スライスのローディングおよびインキュベーションを含め、この手法は90分以内に完了させることができます。