Name: 視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: 学ぶ マウス脳スライスにおけるGFPタグニューロンのカルシウム応答イメージング法。赤色蛍光カルシウムインジケーターを用いて、共焦点顕微鏡で時空間的なシグナル変化を可視化する手法です。

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私たちは作業に参加の仲間たちに感謝ここにまとめました。この作品は、ドイツ学術振興（SFB 894）、フォルクスワーゲン財団（TLZ）によるDFG​​ Schwerpunktprogramm 1392 &#39;嗅覚の統合解析 &quot;からの補助金によって支えられている。 TLZは、フォルクスワーゲン財団のリヒテンベルグ教授です。

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
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<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
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<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

神経科学の主要な問題は、脳が社会的な情報の処理方法を理解することです。社会的認識のために必要な情報の主なソースは、嗅覚やフェロモンの信号により符号化されている。神経鼻の集団、特に脳、視床下部における信号の認識によって、これらの信号の検出は、多くの社会的プロセスと影響ホルモンおよび他の神経内分泌因子13-16の重要な役割を果たしています。複数のニューロンと多機能の核を含む視床下部のように脳の領域における神経応答を解析するのに不可欠な障害は、関心のある特定のニューロンの同定である。 多くのトランスジェニックマウス系統は、主にGFPは神経細胞を識別するのに役立ちますている、開発されている。残念なことに、GFPの蛍光特性は、このようなのFluo-3、Fluo-4を17としてのCa 2 +指示薬色素を用いた測定を複雑にします。そこで我々はinvesti始めゲートFURA-赤3,4のように、赤方偏移のCa 2 +指示薬色素を用いた神経細胞をGFPタグ付き。のFura-赤基づくのCa <...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> 猫。 N° </td></tr><tr><td>寒天</td><td>シグマ</td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td>インビトロジェン</td><td> F-3021 </td></tr><tr><td>プルロニックF-127 </td><td>シグマ</td><td> P2443 </td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP231 </td></tr><tr><td>振動刃ミクロトームハイラックスV 50 </td><td>ツァイス</td><td> 9770170 </td></tr><tr><td>ミクロトームハイラックスV 50の冷却装置CU 65 </td><td>ツァイス</td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2インキュベーター、CB210-UL </td><td>バインダー</td><td> 0019389 </td></tr><tr><td>スーパー接着剤、ロックタイト406TM </td><td>ヘンケル</td><td> 142580 </td></tr><tr><td>ダブルへら、スプーン形状</td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Microspoonのへら、スプーン形状</td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td>春はさみ、モリア-Vannas·ウォルフ - 7ミリメートルブレード</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15370から52 </td></tr><tr><td>春のはさみ、Vannas - 3ミリメートルブレード</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 15000から00 </td></tr><tr><td>ワーグナーはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14071から12 </td></tr><tr><td>医療鉗子、デュモン7bは</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11270から20 </td></tr><tr><td>大きな長方形の露天風呂商工会議所（RC-27） </td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> 64から0238 </td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡ラッドラディアンス2100 </td><td>ツァイス</td><td> NA </td></tr></tbody></table>

視床下部マウス脳スライスのgfpタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

脳内の情報の符号化、正確な分子手順並びに視床下部が残っているとしての脳領域の多機能の核内の特定のニューロンの活動に関わる中心的な問題の根底にあるメカニズムについての我々の知識の巨大な増加にもかかわらず。この問題は、様々な神経ホルモンのシグナル伝達カスケードの調節に関与する分子成分の識別を含む。細胞内Ca 2 +の上昇は両方のシグナル伝達のレベルとシナプス部位で、神経細胞の感度を調節するのに重要な役割を果たしている。 新しいツールは、特定のプロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現させることにより、脳の神経細胞の無数のニューロンを特定するために浮上している。空間的にも時間的刺激によって誘発されるCa 2 +の GFPタグニューロン、非緑色蛍光Ca 2 +指示薬色素nの応答を監視するには使用するeeds。さらに、共焦点顕微鏡は、組織内の深さの異なる平面内のニューロンを可視化するとアウトフォーカスの蛍光を制限するために、その能力のために組織切片におけるイメージング個々のニューロンの好きな方法である。レシオメトリックのCa 2 +指示薬FURA-2は、GFPタグニューロン1と組み合わせて使用されています。しかし、染料は紫外線（UV）光によって励起される。レーザのコストおよびUV光の限られた光の浸透深さは、多くの研究室での使用を妨げた。また、GFP蛍光はFURA-2信号2と干渉する場合があります。したがって、私たちは赤い蛍光Ca 2 +指示薬色素を使用することを決めた。 FURA-赤の巨大なストロークシフトは単一の励起波長を用いて、GFPとの組み合わせで赤色蛍光の多色分析を可能にします。我々はGFPタグ嗅覚ニューロン3と組み合わせてFURA-赤を使用して以前に良好な結果を得た。嗅覚組織切片のためのプロトコルは、電子を動作するように見えたquallyよく視床下部ニューロン4インチのFura-赤基づくのCa 2 +イメージングにも成功し、膵β細胞とHEK細胞に発現し5,6 GFPタグ受容体GFPタグと組み合わせた。 FURA-赤の少し癖は、インジケータがカルシウム7をバインドした後650nmでの蛍光強度が減少することである。したがって、低Ca 2 +濃度と休息ニューロンの蛍光は、比較的高い強度を有している。それは注意すべきで、そのほかの赤のCa 2 +指示薬色素が存在しないか、現在開発されて、それはまた別のニューロンと脳領域におけるより良いまたは改善された結果を与えるかもしれない。

このプロトコルでは、カルシウムイメージングの最近の進捗状況を更新<sup&gt; 2 +</sup赤色蛍光Caを用いた脳組織切片におけるGFPタグニューロンの&gt;信号<sup&gt; 2 +</sup&gt;指示薬色素。

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

脳内における情報の符号化の根底にあるメカニズムに関する知見が飛躍的に増加したにもかかわらず、...に関する中心的な問いが依然として残っている。

本手順の全体的な目的は、非緑色蛍光カルシウム指示薬を用い、脳切片におけるGFPタグ付きニューロンの刺激誘発性カルシウム応答を、空間的および時間的にモニタリングすることです。まず、特定の細胞でGFPを発現するトランスジェニックマウスから脳を摘出し、次にマイクロトームを用いて組織切片を作製することでこれを達成します。次に、脳細胞に染料を取り込ませるため、カルシウム指示薬染料の負荷溶液をスライスにピペッティングします。最終ステップとして、共焦点顕微鏡を用いて蛍光細胞のタイムスタンプ記録を行います。最終的に、GFPタグ付きニューロンにおけるカルシウム応答を、マルチカラーカルシウムイメージング解析を用いて示します。共焦点顕微鏡を用いた既存の手法に対する本技術の主な利点は、赤色シフトした蛍光カルシウム指示薬を用いることで、緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識されたニューロン内のカルシウムをイメージングできる点にあります。この赤色蛍光色素の大きなストークスシフトにより、単一の励起波長を用いて、緑色GFPと赤色蛍光を組み合わせた多色解析が可能になります。この手法のアイデアは、遺伝的な蛍光標識である緑色蛍光タンパク質を用いてのみ同定可能なニューロンにおいて、カルシウムシグナルをモニタリングするという課題に直面した際に得られました。これから本手順のいくつかの重要なステップを実演します。まず、加熱したアガロース溶液を正方形のペトリ皿に高さ1cmまで注ぎ、冷却・凝固させた後、4%アガロースゲルを1立方センチメートルのブロック状に切り分け、保存用のボトルに入れます。マウスを断頭した後、カミソリの刃を用いて、前頭骨から外後頭隆起に向かって正中矢状方向に頭皮を切開します。続いて、切開した頭皮をまず吻側外側方向へさらに開きます。次に腹側方向へ開きます。その後、外側に2箇所、吻側に1箇所の切開を加えます。小型のスプリングシザーを用いて大後頭孔から慎重に頭蓋骨を切り離します。この時点で、後頭骨、間頂骨、および頂骨が分離している必要があります。硬膜がまだ残っている場合は、脳への損傷を防ぐため、ピンセットで慎重に取り除いてください。次に、鱗状骨、前篩骨、および前頭孔を除去します。これで、反転させたマイクロスプーンスパチュラを用いて脳を容易に取り出すことができ、脳神経を切断することが可能です。脳は、耐切創性の表面に腹側を下にして置くようにしてください。片刃カミソリを使用して小脳を除去します。この直線的な切断面が、冠状断の脳切片を作成するために脳をプレートに固定する際の基準となります。次に、速乾性の高性能シアノアクリレート系接着剤（瞬間接着剤）を少量用い、切断面を下にして脳をミクロトームのベースプレートに接着します。その後、スライス中の脳を支持し固定するために、1 cubic centimeterのアガーゲルのブロックを脳の腹側からミクロトームのベースプレートに接着します。接着剤が乾燥した後、6 °Cに冷却し酸素飽和させた細胞外液を満たしたミクロトームのバスにプレートを浸します。次に、低速で脳を300 micronsの厚さでスライスし、脳全体が切片化されるまで冠状面の脳切片を回収します。次に、onic F1 27粉末にDMSO溶液を加えて、20%onic F1 27 DMSO溶液を調製します。続いて、溶液を直接2分間ソニケーションして溶解させます。その後、50 µgの細胞透過性furred amが入ったチューブに、20%onic F1 27溶液を5 µL加えます。ピペットで溶液を混合します。次に、混合液に細胞外液を45 µL加え、ボルテックスで攪拌します。続いて、さらに325 µLの細胞外液を加え、チューブをさらに3分間超音波処理します。ソニケーション後、1.156 millilitersの酸素飽和細胞外液を加え、最終的なカルシウムインジケーターD負荷溶液を作成します。冠状断脳切片を、酸素飽和細胞外液を満たした6ウェル細胞培養プレートに、1ウェルあたり最大6枚まで移します。その後、脳切片を傷つけないように注意しながら、チャンバーから酸素飽和細胞外液を吸引します。次に、カルシウム指示薬D負荷溶液750 µLを各ウェルに直接ピペッティングします。脳切片がrore amを含む溶液で覆われていることを確認してください。その後、切片を酸素・二酸化炭素細胞培養インキュベーター内で37 °Cにて45～60分間インキュベートします。インキュベーションの終了後、細胞への過剰負荷を防ぐため、カルシウム指示薬DIローディング溶液を新鮮な酸素供給済み細胞外液に交換します。刺激によって誘発される蛍光信号の変化をモニタリングするため、赤色蛍光負荷した脳スライスの一片を記録チャンバーに移し、任意の位置に配置します。チャンバーを共焦点顕微鏡装置に装着した後、酸素供給済み細胞外液でスライスを10分間灌流し、過剰な細胞外カルシウム指示薬染料を除去します。記録チャンバーから排出した後、PERFUSE eightを真空ボトルに回収します。次に、顕微鏡を用いて低倍率でスライスを観察します。スライスの向きを確認し、目的の領域（本法では脳の視床下部領域）を特定します。その後、高倍率に切り替えます。GFP画像を取得し、同時にURA赤色信号の蛍光強度を確認することで、スライス内から目的の細胞を探します。レーザー出力を、URA赤色蛍光強度の変化を測定でき、かつ2つの蛍光色素の退色が起こらない値に調整します。次に、fureおよびGFPシグナルを収集するため、0.5から2 Hzの速度で画像取得を開始します。この図は、脳の冠状切片におけるGN、RHR Tau GFPニューロンの共焦点画像を示しています。これは、脳切片にfure amをロードした後に観察される比較的均一な蛍光シグナルであり、こちらはカルシウムインジケーター染料をロードしたニューロンを示すマージ画像です。以下は、異なる視床下部脳領域にある個々のGFPタグ付きニューロンにおける、体細胞刺激誘発性カルシウム応答の例です。異なる視床下部核のGN RHR発現ニューロン間の明確なカルシウム信号は、習得後であれば、同一期間における特定の細胞のカルシウム総変化量の推定値として曲線下面積を用いて比較することが可能です。適切に実施すれば、カルシウム指示薬染料の調製、スライスのローディングおよびインキュベーションを含め、この手法は90分以内に完了させることができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

鋤鼻器（VNO）は、社会的および生殖的情報を伝える種内化学信号を検出します。我々は、VNO組織にG-CaMP2を発現させた遺伝子組換えマウスを用いて、Ca2+イメージング実験を行いました。このアプローチにより、多数のフェロモン刺激に対する鋤鼻ニューロンの複雑な応答パターンの解析が可能になります。...

遺伝的にコードされたカルシウムセンサーを発現する鋤鼻器のスライス標本のイメージング神経細胞応答

Source: バンクロフト、E. A., et al.自発的なCa style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'2+ &gt; Fluxes and their downstream effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020)...

マウス胚由来の腹側中脳ニューロンにおけるカルシウム流入の可視化

Thy1で二国間一次体性感覚 corticies (S1) 上記デュアル光学窓から神経細胞の活動を測定するための実験手順について述べる-2 光子 (2 P) 顕微鏡による生体内でを使用して GCaMP6s トランスジェニック...

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

ここでは、生きた麻酔薬用マウスのジェニュー酸神経節を暴露する方法と、カルシウムイメージングを使用してこれらのニューロンのアンサンブルの応答を測定して刺激を味わう方法を紹介し、異なる覚醒剤を用いた複数の試験を可能にする。これにより、どのニューロンがどのタスタントに反応するかを深く比較することができます。...

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

我々は、腹側から成虫マウスの脳幹を暴露するプロトコルを提示する。ミニチュア顕微鏡で傾斜屈折率レンズを用いることで、インビボでのオリーブ神経ソマタの活性を調べるためにカルシウムイメージングを用いることができる。...

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

このプロトコルは、後根神経節(DRG)の外科的曝露とそれに続くGCaMP3(遺伝的にコードされたCa2+ インジケーター;緑色蛍光タンパク質-カルモジュリン-M13タンパク質 3)Pirt-GCaMP3マウスを用いて、同側後肢に様々な刺激を加えながら神経細胞集合体をCa2+...

インビボ 無傷の背根神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

このプロトコルは野生型マウスの皮質をそのまま残している間2光子の顕微鏡検査との単一ニューロンの活動をイメージ投射すること、および部分皮質の突然変異体のマウスの広視野顕微鏡検査が付いている全体のSCをイメージ投射することを含む目がさめているマウスの優秀なcolliculus (SC)のカルシウム応答を、イメージ投射するためのプロシージャを詳述する。...

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

本プロトコルは、体細胞および内臓刺激に対する腰椎-6 DRGニューロンのアンサンブルの応答を測定するためのin...

インビボ体細胞および内臓刺激に対する背根神経節ニューロンの応答のカルシウムイメージング

海馬の歯状回は、学習と記憶において重要で明確な機能を果たします。このプロトコルは、自由に動くマウスの歯状回における顆粒細胞の in vivo...

マウス海馬歯状回における顆粒細胞のin vivoカルシウムイメージング 

このプロトコルは、無傷の三叉神経節(TG)ニューロンの in vivoGCaMPカルシウムイメージングを記述します。この説明には、TG 曝露手術、TG ニューロンの in vivo 共焦点顕微鏡イメージング、TG ニューロン顕微鏡イメージング中の体細胞刺激の適用、および in vivo GCaMP カルシウム イメージング...

インビボ 無傷の三叉神経節における一次感覚ニューロンのネットワークにおけるニューロンアンサンブルのカルシウムイメージング

学ぶ マウス脳スライスにおけるGFPタグニューロンのカルシウム応答イメージング法。赤色蛍光カルシウムインジケーターを用いて、共焦点顕微鏡で時空間的なシグナル変化を可視化する手法です。

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

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