視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

本手順の目的は、非緑色蛍光カルシウム指示薬を用いて、脳スライス中のGFPタグ付きニューロンにおける刺激誘発性カルシウム応答を、空間的および時間的にモニターすることです。まず、特定の細胞にGFPを発現するトランスジェニックマウスから脳を摘出し、次にマイクロトームを用いて組織スライスを調製することでこれを達成します。

次に、カルシウム指示薬のローディング溶液をスライスにピペットで滴下し、脳細胞に色素を取り込ませます。最後のステップは、共焦点顕微鏡を用いて蛍光細胞のタイムスタンプ記録を行うことです。最終的に、GFPタグ付きニューロンにおけるカルシウム応答を、マルチカラーカルシウムイメージング解析を用いて示します。

共焦点顕微鏡を用いた既存の手法に対する本手法の主な利点は、赤色シフトした蛍光カルシウム指示薬を用いることで、緑色蛍光GFPで標識されたニューロン内のカルシウムをイメージングできる点にあります。赤色蛍光の大きなストークスシフトにより、単一の励起波長を用いて、緑色GFPと赤色蛍光の多色解析を行うことが可能になります。本手法を考案したきっかけは、緑色蛍光タンパク質という遺伝的蛍光標識を用いてのみ同定可能なニューロンにおいて、カルシウムシグナルをモニタリングするという課題に直面したことでした。

これから、本手順のさまざまな重要なステップについて実演します。まず、加熱したアガー溶液を正方形のペトリ皿に高さ1cmになるように注ぎます。冷却して凝固させた後、4%アガーゲルを1cm³のブロックに切り分け、保存ボトルに入れます。マウスを断頭した後、片刃カミソリを用いて、前頭骨から外後頭隆起に向かって正中矢状方向に頭皮を切開します。

続いて、切開した頭皮をまず吻側外側方向に、次に腹側方向へとさらに開きます。その後、外側に2箇所、吻側に1箇所の切開を加えます。

小型のスプリングシザーを用いて大後頭孔から慎重に頭蓋骨を切り離します。この時点で、後頭骨、間頂骨、および頂骨が分離しているはずです。硬膜がまだ残っている場合は、脳への損傷を防ぐため、ピンセットで慎重に除去してください。

次に、鱗状骨、前篩骨、および前頭孔を除去します。これで、反転させたマイクロスプーンスパチュラを用いて脳を容易に摘出し、脳神経を切断することができます。脳は、耐切創性の表面に腹側を下にして置くようにしてください。

片刃カミソリを使用して小脳を除去します。この直線的な切断面が、冠状断面の脳切片を作成するために脳をプレートに固定する際の基準となります。次に、速乾性の高性能シアノアクリレート系超強力接着剤を少量用い、切断面を下にして脳をミクロトームのベースプレートに接着します。

その後、スライシング中の脳の支持および固定のため、1 cm³のアガーゲルのブロックを脳の腹側からミクロトームのベースプレートに接着します。接着剤が乾燥した後、プレートを6 °Cに冷却し、酸素飽和させた細胞外液を満たしたミクロトームのバスに入れます。次に、低速で脳を厚さ300 µmの厚さで切断し、脳全体がセクションされるまで冠状断の脳切片を回収します。

次に、onic F1 27粉末にDMSO溶液を加え、20%onic F1 27 DMSO溶液を調製します。続いて、溶液を直接2分間超音波処理して溶解させます。その後、50 µgの細胞透過性furred amが入ったチューブに、20%onic F1 27溶液を5 µL添加します。

ピペットを用いて溶液を混合します。次に、混合液に45 µLの細胞外液を加え、ボルテックスで撹拌します。続いて、さらに325 µLの細胞外液を加え、チューブをさらに3分間ソニケーションします。

超音波処理後、1.156 millilitersの酸素飽和細胞外液を加え、最終的なカルシウムインジケーターDロード溶液を作成します。冠状断脳切片を、酸素飽和細胞外液を満たした6ウェル細胞培養プレートに、1ウェルあたり最大6枚まで移します。その後、脳切片を傷つけないよう注意しながら、チャンバーから酸素飽和細胞外液を吸引します。

次に、カルシウム指示薬D負荷溶液を各ウェルに750 µLずつ直接ピペットで分注します。脳切片がrore amを含む溶液で完全に覆われていることを確認してください。その後、酸素・二酸化炭素細胞培養インキュベーター内で、37 °Cで45〜60分間インキュベートします。

インキュベーションの終了後、細胞への過剰負荷を防ぐため、カルシウムインジケーターDIローディング溶液を、酸素飽和させた新鮮な細胞外液に交換します。刺激による蛍光信号の変化をモニタリングするため、 loaders redをロードした脳スライスを1枚記録チャンバーに移し、任意の場所に配置します。チャンバーを共焦点顕微鏡装置に設置した後、酸素飽和させた細胞外液でスライスを10分間灌流し、過剰な細胞外カルシウムインジケーター染料を除去します。

記録チャンバーから出した後、PERFUSE eightを真空ボトルに回収します。次に、顕微鏡を用いて低倍率でスライスを観察します。スライスの向きを記録し、目的の領域（本実験では脳の視床下部領域）を確認します。

その後、高倍率に切り替えます。GFP画像を取得しながら、同時にURA赤色信号の蛍光強度を確認し、スライスの中から目的の細胞を探します。URA赤色蛍光強度の変化の測定が可能であり、かつ2つの蛍光色素の退色を防ぐ値にレーザー出力を調整します。

次に、fureおよびGFPシグナルを収集するため、0.5から2 Hzの速度で画像取得を開始します。この図は、脳の冠状切片におけるGN、RHR Tau GFPニューロンの共焦点画像を示しています。こちらは、脳切片にfure amをロードした後に観察される比較的均一な蛍光シグナルであり、もう一方はカルシウム指示薬でロードされたニューロンを示す統合画像です。

以下は、異なる視床下部脳領域における個々のGFPタグ付きニューロンから得られた、細胞体刺激誘発性カルシウム応答の例です。異なる視床下部核のGN RHR発現ニューロン間の個別のカルシウムシグナルは、習得後は、同一期間における特定の細胞内の総カルシウム変化量の推定値として、曲線下面積（AUC）を用いて比較することが可能です。適切に実施すれば、カルシウムインジケーター染料の調製、切片への導入およびインキュベーションを含め、この手法は90分未満で完了させることができます。