Name: スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: 学ぶスフィンゴ糖脂質抗原の質量分析法。イオントラップ質量分析を用いて免疫細胞内の低豊度糖脂質を高感度に検出し、構造解析を行う技術です。がんバイオマーカー研究への応用が期待されます。

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1。ラボの安全性の懸念<ol><li>すべての有機溶媒は、明確なラベルを持つ特定の領域に格納する必要があります。必要な消火器のタイプのために製造して、ラベルを参照してください。 </li><li>使用されるいくつかの試薬は、潜在的に発がん性があると、精神的なうつ病を引き起こす可能性があります。これらの試薬は、換気との化学フード（具体的に特異的な試薬や機器の表を参照してください）​​で処理する必要があります。 </li><li>それは、有機溶剤や細胞を扱う場合、手袋、白衣、および眼の保護のような個人用保護具を常時利用することをお勧めします。 </li></ol> 2。ラット白血病細胞からスフィンゴ糖脂質の抽出<ol><li>店舗のRBLラット白血病細胞-80℃の条件下で16x100 mmガラス管中の8（10000000から100000000）。細胞は、トリパンブルー染色後に血球計算板でカウントされます。細胞の生存率は95％よりも高くなければならない。 </li><li>広範sonicatを使用して脂質を抽出イオン1〜2時間毎に混合極性溶媒との4倍。最初と最後の溶媒としてクロロホルム - メタノール1:1（v / v）の6ミリリットルを使用しています。イソプロパノールの六ミリリットル：ヘキサン：H 2 O 55:25:20（V / V / V、使用前に吸引して上相を除去）を、第2、第3の溶媒として使用することができる。ヘキサン：この溶媒はイソプロパノールを混合することにより調製される55:25:20の割合でH 2 Oを、積極的にそれを振って、削除されます表示される上相を、できるようになります。使用のための下相を保つ。 </li><li>ペレット不溶性物質を遠心分離して超音波処理に従ってください。上清をプール。 4時間Speed​​vacにそれらを乾燥させてください。 Speed​​vacが使用できない場合、窒素気流またはロータリーエバポレーターを使用することができます。蒸発有機溶剤を保持するために優れたコールドトラップを使用します。真空ポンプ油への有機溶媒の汚染は、真空ポンプの効率が低下します。 </li><li>高性能薄層クロマトグラフィー（HPTLC）を使用して予備的な分析を実行します。糖脂質を定量化するために、、50％硫酸溶液（50ml中100mg）とガラクトース標準（100ミリリットル原液で40mg）を、0.2％オルシノールを準備します。 30μlの反応容積で標準曲線（g / Lの0〜20 g / lに）として使用する希釈系列を用意してください。各希釈系列試料にメタノール20μLを追加します。 、メタノール200μlの各糖脂質試料を溶かす超音波処理し、糖量測定のための20μlを使用しています。ねじ込むキャップ（ザルスタット、72.692.005）と1.5mlのエッペンドルフチューブに、標準曲線のために役立つガラクトース-H 2 O-メタノール溶液のシリーズでは、各サンプルを50％硫酸溶液中でオルシノール0.2％0.4ミリリットルを追加。 100℃の加熱ブロック中で5分間沸騰℃までテカンサンライズマイクロプレートリーダーを用いて440nmの呈色反応の光学濃度を読み取る。クロロホルム-メタノール1:1（v / v）で処理された中性脂質のための溶媒としてH 2 O 60:35:8（v / v / v）のメタノール：HPTLC実行するには、クロロホルムを使用しています。ヘキサン：H 2 O 55:25:20（v / v / v）のイソプロパノールを使用酸脂質（ガングリオシド）のための溶媒。隔離された中性糖脂質は、200μlのクロロホルムに溶解し、溶媒：メタノール1:1（v / v）とドラモンドMicrocapsによってMerckシリカゲル薄層クロマトグラフィープレート上にロードされます。プレートは、溶媒クロロホルムに実行されました：メタノール：H 2 O 60:35:8（v / v / v）を、乾燥させた。スフィンゴ糖脂質は、300℃オルシノール硫酸により可視化した℃の</li><li> DEAEセファデックスA-25の小さなカラムに陰イオン交換クロマトグラフィーによる中性および酸性脂質のうち、酸性脂質画分から中性脂質を分離するために、[DEAEセファデックスA25樹脂は、セファデックスA-25樹脂を浸漬することによって調製することができるクロロホルムで粉：メタノール：H 2 O 30:60:8（v / v / v）の一夜。デックスA25樹脂が残っているのになるまで上清を吸引します。メタノール：H 2 O 30:60:8（v / v / v）の樹脂を洗浄し、新鮮なクロロホルムを追加します。デックスA25樹脂]から負に荷電した残基を除去するために3回繰り返します。 </li><li>ディゾルブ（10個を超える分）超音波処理し、クロロホルムでステップ2.1から脂質を懸濁する：メタノール：必要に応じてH 2 O 30:60:8（v / v / v）を。 </li><li>グラスウールと9使用して小さなDEAEセファデックスA25（塩素フォーム）カラムを準備し、 &quot;パスツールピペットを。樹脂粉末がカラムを通過しないように慎重にグラスウールを梱包してください。にDEAEセファデックスA25（塩素フォーム）樹脂を追加する&quot;カラムが乾燥せずにパスツールピペット &quot;9の&quot;首。あなたは溶離液に樹脂が表示されないことを確認してください。クロロホルムに溶解したサンプル：メタノール：H 2 O 30:60:8（V / V / V）を溶解させた。中性脂質画分には、小数部を通って流れている。 </li><li>メタノール中の酢酸ナトリウム8mlで酸性脂質画分（樹脂にバインドされている）溶出します。両方中性および酸性画分を乾燥し、透析によってそれらを脱塩、Speed​​vacことによって、それらを乾燥させ、HPTLCによってそれらを分析。 </li></ol>酸性画分は、直接ステップ3の反応のため透析できガングリオシドが含まれています。中性画分には、アセチル化反応によって除去しなければならない中性スフィンゴ糖脂質だけでなく、リン脂質（ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン）だけでなく、含まれています。 我々の経験では、透析カセットの方法は、透析チューブまたは逆相C18カラムクロマトグラフィーよりも効率的で便利です。 <ol start="9"><li>次のステップは、アセチル化と過アセチル化反応によって中性スフィンゴ糖脂質からリン脂質を除去することである。 DEAEセファデックスA-25に、パススルーSpeed​​vacの小数（冷房付き）で4時間乾燥させてください。サンプルは乾燥していたら、別の4時間Speed​​vacとドライにそれらを戻す。任意の残留水が過アセチル化反応を防止するように、これらのサンプルは完全に乾燥していることを確認します。 </li><li>ピリジン1mlと室温または37℃で一晩、暗闇の中で無水酢酸0.5mlのサンプルをPeracetylate。ピリジンと無水酢酸の量はアップするために適切であるスフィンゴ糖脂質の200μgまで。スフィンゴ糖脂質は、良好な溶解性を持っているように、この反応は、37℃で行うことができる。 </li><li>完全に蒸発を確保するためにトルエン3倍の1ミリリットル（共蒸着）を添加し、3時間Speed​​vacによって過アセチル化物質を乾燥させます。サンプルは乾燥するまでまだSpeed​​vac、完全に乾燥していない場合。 </li><li>フロリジルビーズを用いて、ガラスウールをパスツールピペットでフロリジル（Sigma-Aldrich）をカラム（30〜60メッシュ、10×80 mm）を用意します。フロリジルビーズが完全に110℃のオーブン中でインキュベーションすることにより、使用前に乾燥させる必要があります。首にパスツールピペットにビーズをいっぱいに、1,2 - ジクロロエタン、ヘキサン4:1（v / v）に平衡化します。 </li></ol>フロリジルカラムからの溶出は非常に高速です。溶剤の急激なボラティリティがカラムの乾燥につながることができます。したがって、すべての溶媒混合物は、それが溶出時に列を停止することはできませんので、列を実行する前に準備する必要があります。 <ol start="13"><li> peracetylを適用1 1,2 - ジクロロエタン-ヘキサン4:1（v / v）のミリリットル、1,2 - ジクロロエタン10mlを、続いて同じ溶剤の6ミリリットルでカラムを洗浄でatedサンプル。 1,2 - ジクロロエタン - アセトン1:1（v / v）の6ミリリットルで中性過アセチル化糖脂質を溶出する。過アセチル化リンがいない間過アセチル化スフィンゴ糖脂質は、フロリジルカラムにバインドするため、この手順は、グリコから過アセチル化リン脂質を除去します。 </li><li> 2ミリリットルの0.5 Mナトリウムメトキシドで2時間と脱アセチル化のためSpeed​​vacによって分画を乾燥[Sigma-Aldrich社、403067]室温で3時間メタノール2mlインチ</li><li>メタノール酢酸3ml透析によるSpeed​​vac、脱塩によるもの[酢酸/メタノール85分の15 v / v]の、乾燥した[水3mlの乾燥品を溶解し、スライドインアナライザに注入して混合物を中和透析カセットは、24時間、水に対して透析する。少なくとも2回水を変更する]。サンプルが完全に乾くまでSpeed​​vacで透析したスフィンゴ糖脂質（水溶液中で）乾燥させます。 </li&gt; </ol> 3。スフィンゴ糖脂質13の化学修飾（Permethylation） <ol><li>スクリューキャップとテフロンライナー付きガラス管にスフィンゴ糖脂質（1〜20μg）を導入し、特殊な乾燥条件または不活性ガス雰囲気を使用せずに、ジメチルスルホキシド（150μL）を追加します。 </li><li>乳棒と化学モルタルでそれらを粉砕することにより水酸化ナトリウム粒子から粉末水酸化ナトリウム（40-60 mg）を準備します。非常に乾燥した環境で粉体を保存して、粉末の吸入を避けるために、化学フード内で研削を行うように注意していることを確認してください。 </li><li>次にへらで試料溶液に水酸化ナトリウムの粉末を追加します。 100マイクロシリンジHalmiltonとヨードメタン（80μL）を加える[またはピペットはゴムチューブを介してシリンジにリンクされて校正された100マイクロリットルVWRを使用することができます]と、1時間室温で混合物を横に振る。 </li><li>水（2mL）でメチル化反応をクエンチ。 3倍過メチル化生成物を抽出ジクロロメタンを加えて（2ミリリットル）は[糖脂質が低い段階であるジクロロメタン相であるので、上相を新しいガラス管に転送することができますし、ジクロロメタンで再度抽出]。 </li><li>合わせたジクロロメタンは、[、水で上相、その後に処分することができる] 2 mlの水で3回抽出し、洗浄します。最後の洗浄の後、新しいチューブにサンプルを転送し、Speed​​vacを使用して乾燥させます。 </li><li>次いで、試料をESI-MS分析用メタノールの100から200μlに溶解させることができる。 </li></ol> 4。パーメチルGycosphingolipidsのMALDI-TOF解析<ol><li> MALDI TOF-TOF型質量分析装置（アプライドバイオシステムズ4700、Foster City、CA）を上に、MALDI-TOF-MSとMALDI-TOF/TOF-MS/MS実験を行った。 10 mg / mlのジヒドロキシ安息香酸（DHB）のアセトニトリルと水で0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）の50％の体積の50％の体積を混合することにより行列を準備します。 </li><li> DHBマトリックスをMALDIタージェに発見することができますメタノールに溶解した試料を1μl（100ngの糖脂質を含む）スポット続いトン（1μl）を、。徐々に適用され、それが分析する前に乾燥することができます。 </li></ol> 5。パーメチル化スフィンゴ糖脂質のイオントラップMS分析<ol><li> 30から50パーセントの衝突エネルギーと正イオンモードで℃のキャピラリー温度230℃で0.30μL/ minの流量、ナノエレクトロスプレー源を用いた線形イオントラップ質量分析計（LTQ、ThermoScientific、サンノゼ、カリフォルニア州）で質量分析を行う。プリカーサイオンの微小残存豊かさを残すために衝突エネルギーを設定します。ナトリウム付加物等の全てのイオンを検出します。 </li><li>糖鎖フラグメントのm / z 667および末端二糖1を介しsodiated分子イオンからMS 4プロダクトイオンの異なるパターンを比較することにより、Gb3の（Galα4Galβ4Glcβ1Cer）とiGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）規格の重体混合物中iGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）を識別する-エンイオンm / z 445（ すなわちX→667→445→、X過メチルGb3の（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）のものと、ESI-LIT-MSを介して純粋な過メチルiGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）標準のMS 1）で検出された分子イオンを意味します。 </li></ol>

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グライコーム、ゲノムとプロテオームと同様に作られた言葉は、生物のすべての糖構造を指す。完全にグリコシル化のマニホールドの機能を理解するために、両方の機能と構造グライコミクス研究を含む統合的なアプローチが必要になります。どちらも、糖鎖の生合成、糖鎖構造の結果として生じる複雑さと多様性、分子レベルで調節する糖鎖リガンドとレセプターの相互作用のアグリコン構造の頻繁な関与、および低濃度のリガンドの機能的重要性の非テンプレート駆動型の性質によって複雑化されています。 これは、一般的に質量分析（MS）は、特に低濃度のリガンドを同定および特徴付けるために、構造グライコミクス研究のために必要不可欠な方法であることが認められている。分子種としての糖鎖または糖質を観察するために、私たちはしばしば、エレクトロスプレーイオン化（ESI）と呼ばれる高効率、低エネルギーイオン化法を使用します。もっとDET用グリカン構造のキャラクタリゼーションailed、それは個々の分子種を選択して、より小さな部分に糖鎖を断ち切ることが不可欠である。これは通常、不活性ガス分子と衝突して、糖鎖を活性伴う衝突誘起解離によって行われます。増大したエネルギーは、債券の破損を誘発し、得られた断片の体系的な分析では、糖鎖の分子構造に関する情報を提供します。多くの場合、 &quot;署名&quot;の断片は、特定の糖鎖構造の機能の診断であることを生成することができます。一緒に分子量を有する、これらの断片は、その構造が新規である場合は特に、時には糖鎖を識別するために十分なことができますが、過去に多くの情報を完全にそれらを特徴づけるために必要とされてきた。これらのメソッドは、糖組成分析、連鎖解析のために部分的にメチル化アルジトールアセテートのガスクロマトグラフィー質量分析、および特定のグリコシダーゼ消化17を含む。 18から19を介して実証し、効果的にイオントラップ型質量分析計（IT-MS）の中で実施することができる低エネルギーの断片化のため、複数のラウンドでは、大幅に糖鎖質量スペクトル分析からの情報収率を向上させる。断片化（他のMS機器を使って行うことができない）の4または5ラウンドで、これらは同じで成分の混合物中に一緒に存在している場合でも、異なる糖結合に配置された同一の糖成分が含まれている異性体糖鎖を区別することが可能である分子量（等圧線）。この分析では、糖鎖はpermethylationを使用してメチル基を持つすべての遊離ヒドロキシル基を置き換えて、誘導体化した。糖鎖構造の割り当てがpermethylationなしで可能ですが、permethylationは感度17を増加させます。 LeveryとZhouは、異性STRUの検出など、IT-MSの方法論の潜在的な利点のすべてを組み合わせている7月9日 、複数の同重体の混合物の形で存在するスフィンゴ糖脂質の高感度同定および定量のためのMSとMS 4 5スペクトルにおいてのみ観察署名診断イオンを用いctures。理論的には、化学的に合成することができる標準的な糖脂質の可用性保留中、すべての既存の糖脂質構造を識別することができるかもしれません。 この分析の重要なステップは、生体サンプルから糖脂質の回収率である。 GSLの典型的には80μgのは、RBLなど億腫瘍細胞から回収することができる。イオントラップ型質量分析計内の断片化の複数のラウンドのための十分な分子イオンを生成するには、腫瘍GSLの少なくとも10マイクログラムが必要です。精製中脂質の収率が低い、さらに断片化に供することができなかったイオンの低い存在につながる。解析の成功は、回収される脂質の量に依存します。一般的に、最終濃度完全メチル化糖脂質のentrationは、ナノエレクトロスプレーイオン源で分析される前に、メタノールに溶解した1 mg / mlとを、到達する必要があります。徹底したMS n分析の限界は、MS 1プロファイル内の特定のイオンの存在量に依存しています。一般的なe 7イオンの存在量は、徹底したMSの5分析のために必要とされる。精製中脂質の収率が低いは、per-アセチル化糖脂質は、フロリジル樹脂クロマトグラフィーカラムにバインドされて洗浄し、その後に溶出されている必要があり、過アセチル化ステップの間GSLの損失（リン脂質を除去する）が原因で発生することができます。シリカゲルにあたりアセチル化糖脂質の結合を確保するために、試料を流れる後にクロマトグラフィーカラムに二回リロードする必要があります。

<table><tbody><tr><td>1,2ジクロロ&amp;#8211;エタン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34872</td><td>発がん性</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>VMR</td><td>JT9524-0</td><td></td></tr><tr><td>無水酢酸</td><td>Fluka</td><td>45830</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Fischer</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Fischer</td><td>C606-1</td><td>発がん性</td></tr><tr><td>DEAE Sephadex A25 (Cl型)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>AB 17&amp;#8212;170-01</td><td>100 gram</td></tr><tr><td>デカン (無水): </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457116</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>ジクロロ酢酸</td><td>Sigma</td><td>D54702</td><td>発がん性</td></tr><tr><td>透析カセット</td><td>Fischer(Pierce)</td><td>66110</td><td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20684</td><td></td></tr><tr><td>酢酸エチル</td><td>Fischer</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>Florisil</td><td>Fluka</td><td>46384</td><td>クロマトグラフィーカラム充填用</td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>EMD</td><td>HX0290-6</td><td></td></tr><tr><td>ヨードメタン</td><td>Riedel de Haen, Germany</td><td>03810</td><td>銀箔で安定化、発がん性</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR/EMD</td><td>MXO475-1</td><td></td></tr><tr><td>中性糖スフィンゴ脂質 Qualmix </td><td>Matreya</td><td>1505</td><td></td></tr><tr><td>モノシアリルガングリオシド混合物</td><td>Matreya</td><td>1508</td><td></td></tr><tr><td>ジシアリルガングリオシド混合物</td><td>Matreya</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>ラクトシルセラミドおよびシアリル誘導体</td><td>Matreya</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>ガングリオテトラオシルセラミドおよびシアリル誘導体</td><td>Matreya</td><td>1511</td><td></td></tr><tr><td>パストゥールピペット</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>ピリジン: </td><td>Sigma</td><td>270407</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム: </td><td>BDH</td><td>0292</td><td>500 gram</td></tr><tr><td>ナトリウムメトキシド</td><td>Sigma</td><td>404367</td><td>0.5 M メタノール溶液</td></tr><tr><td>トルエン</td><td>J.T. Baker</td><td>9351-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>パストゥールピペット</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"''</td></tr><tr><td>グラスファイバー (ガラスウール)</td><td>Corning Incorporated</td><td>3950</td><td>Pyrex 9989 glass</td></tr><tr><td>12x75 mm ガラスチューブ</td><td>Fischer</td><td>14-962-10B</td><td></td></tr><tr><td>校正済みピペット (100 µL)</td><td>VMR</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>16x100 mm 使い捨てホウケイ酸ガラスチューブ x1,000 </td><td>Fischer</td><td>14-961-29</td><td>スクリューキャップ付き</td></tr><tr><td>ガラスチューブ用キャップ</td><td>Kimble</td><td>40566C</td><td>サイズ/13-415 </td></tr><tr><td>Merck TLCプレート</td><td>Sigma</td><td>Z 29, 301-6</td><td></td></tr><tr><td>TLC用ガラスタンク</td><td>Sigma</td><td>Z 12,619-5</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps </td><td>Drummond scientific company</td><td>1-000-0100</td><td>10 &amp;mu;l、TLCサンプルのスポット用</td></tr><tr><td>Sunrise マイクロプレート吸光光度計</td><td>Tecan</td><td>A-5082</td><td></td></tr><tr><td>Whatman クロマトグラフィー用紙</td><td>Fischer</td><td>05-716-3E</td><td>18 cm x 34 cm TLCタンク用</td></tr><tr><td>オルシノール塩化鉄スプレー試薬</td><td>Sigma</td><td>O7875</td><td>TLCプレート上の糖スフィンゴ脂質検出用</td></tr><tr><td>Prevel スプレーユニット</td><td>Sigma</td><td>Z 36,555-6</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>Fischer</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Savant</td><td>AS160</td><td>有機溶媒用化学トラップ付き</td></tr><tr><td>MALDI TOF-TOF 質量分析計</td><td>Applied Biosystems</td><td>Proteomics 4700</td><td></td></tr><tr><td>イオントラップ型質量分析計</td><td>Thermo</td><td>LTQ</td><td></td></tr></tbody></table>

スフィンゴ糖脂質抗原の質量分析

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

スフィンゴ糖脂質（GSLの）は、胚発生、シグナル伝達、免疫受容体認識1-2など重要な生物学的プロセスの構造情報を負担生体高分子、複合糖質のクラスに属する。彼らは複雑な異性体の形で糖部分、および脂肪アシル鎖長、不飽和、および水酸化含むバリエーションを持つ脂質部分を含んでいます。炭水化物とセラミド部分の両方は、生物学的意義の基礎となると考えられる。例えば、トライhexosylceramidesは、同一分子量が、3月4日完全に異なる生物学的機能を担う糖鎖部分の異なる糖結合を持つグロボトリアオシルセラミド（Galα4Galβ4Glcβ1Cer）とisoglobotriaosylceramide（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）が含まれます。別の例では、α-ガラクトシルセラミドの一部の変更、不変のための強力なアゴニストリガンドが実証されているアリNKT細胞、がんや自己免疫疾患5の動物モデルにおける変化、そのサイトカイン分泌プロファイルと機能を。免疫臓器や細胞での異性体の構造解析を行うには困難が6多くの生物学的機能を決定するためのバリアとして機能します。 ここでは、7月9日免疫細胞におけるスフィンゴ糖脂質プロファイルの比較的簡単、迅速、かつ高感度な分析法の可視化バージョンを提示します。このメソッドは、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化を使用して、その後の分析に続いスフィンゴ糖10-15の抽出と化学修飾（permethylationは、 図5A以下を参照、ヘキソースのすべてのOH基がpermethylation反応後MEOに取って代わられた）に基づいている時間をの飛行質量分析（MALDI-TOF/MS）とイオントラップ質量分析。この方法は、完全な分析のための5000万免疫細胞を必要とします。実験は1週間以内に完了することができます。さまざまなスフィンゴ糖脂質の相対量は、合成標準規格との比較によって線引きすることができます。この方法は、Gb3の異性体、合計iGb3/Gb3混合物が存在している9の2 fmolの間で1パーセントiGb3の測定感度を持っています。 イオントラップ質量分析法は、異性体の分析に使用できます。例えば、同じ試料中グロボトリアオシルセラミドとisoglobtriaosylceramideの存在を分析するために、一つは構造的に2（ 図5下記参照）を区別するスフィンゴ糖脂質分子のフラグメンテーションを使用することができます。さらに、糖部分の化学修飾は、（permethylation反応を介して）より高い感度と特異性のためにイオン化し、断片化の効率を向上し、シアル酸残基の安定性を高めます。スフィンゴ糖脂質の抽出や化学修飾は、古典的な認定化学フード内で行うことができ、質量分析法は、コアによって行うことができるイオントラップMS機器と設備を備えています。

ラット白血病細胞株RBL（NKT細胞にスフィンゴ糖脂質抗原を提示する抗原提示細胞型）のスフィンゴ糖脂質のMALDI MS分析の例を図3に示します。イオンは特定のスフィンゴ糖脂質の構造（ 図3A）に割り当てることができます。 NB-DGJ 16、スフィンゴ糖脂質合成を阻害する薬剤によって治療RBL細胞では、すべてのスフィンゴ糖脂質の有意な減少が（ 図3B）が観察された。構造異性体を区​​別することはできません。アプライドバイオシステムズ4700のMS / MSの容量が限られた構造情報を生成することができるように、MS2フラグメントにMS1イオンの断片化を可能にします。しかし、MS2分析はしばしばオリゴ糖の異性体を区​​別するために十分ではありません。 スフィンゴ糖脂質のイオントラップMS分析は、そのようなiGb3（Galα3Galβ4Glcβ1Cer）とGb3の（Galαとして、異性体の研究を可能にする図3Aに検出されたトリヘキソシルセラミドイオンとして存在することができる4Galβ4Glcβ1Cer）。違いは（ 図4Aおよび4B）発見されたまで、このような異性体を検出するために、標準iGb3とGb3のは、断片化の複数のラウンドで分析した。ここで紹介する例では（ 図5C）iGb3とGb3のは標準iGb3とGb3のに比較することによって識別することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> 図1。スフィンゴ糖脂質の抽出手順を示すフローチャートであり、スフィンゴ糖脂質の化学修飾（permethylation）。スフィンゴ糖脂質は有機溶媒により細胞から抽出された。非スフィンゴ糖脂質を除去するには、脂質が過アセチル化と脱アセチル化することができます。第二に、スフィンゴ糖脂質は、化学的に、MS detectioの感度と特異性を向上させpermethylation反応により変更されたnである。最後に、スフィンゴ糖脂質プロファイルは、MALDI-TOF質量分析とイオントラップ質量分析法を用いて決定した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> 図2。オルシノール硫酸法で糖脂質定量化 ：50％硫酸溶液とグルコース標準曲線のオルシノール0.2％を使用したスフィンゴ糖脂質の定量。 <img alt="図3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> 図3。ラット白血病細胞のGlycosphingolipidomics A.代表MALDI質量スペクトル;。各イオンが特定のスフィンゴ糖脂質の構造を表し、構造異性体を区別することができませんBの NB-DGJ、スフィンゴ糖脂質の合成を阻害する薬剤は、s。ignificantly RBL細胞で生成されたすべてのスフィンゴ糖脂質を減らすことができます。 <img alt="図4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> 図4。スフィンゴ糖の異性体のタンデム質量分析。完全メチル化糖脂質のGb 3 CerおよびIGB 3 Cerのポジティブモードイオントラップ質量分析法のためのA.特性分解経路。 GB 3とigb 3は明らかに彼らのフラグメンテーションパターンで区切られています。リンケージの違いは重体のm / z 445の前駆体と一致してMSの4プロダクトイオンに反映されます。Bは 。 iGB3を示す代表的な結果をiGb3/Gb3異性体の混合物で測定することができます。スターだけiGb3ための診断イオンを示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">ここをクリックする</a>拡大図を表示します。 <img alt="図5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> 図5。イオントラップMSは、スフィンゴ糖の異性体の分析を行うことができます。A.標準iGb3とイオントラップLTQ質量分析計内の断片化の4ラウンド後に断片化プロファイルのGb3のショーの違い。iGb3またはGb3の℃から派生したイオンのBの特性、MS 4プロファイルTrihexosyleramidesは、イオントラップMS法（大鵬周によって図）で識別できiGb3とGb3の異性体の混合物である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

免疫臓器や細胞内のスフィンゴ糖脂質抗原の発現プロファイルを洞察するための特異的かつ高感度の方法が記載されている。この方法は、化学的に合成された基準と比較して、構造解析のためのスフィンゴ糖脂質分子の段階的な断片化を許可するイオントラップ質量分析法を活用しています。

糖スフィンゴ脂質（GSL）は、重要な生物学的プロセスのための構造情報を保持するバイオマクロ分子の糖複合体クラスに属しています。

本手順の総合的な目的は、免疫器官および細胞における糖鎖フィンガー脂質抗原の発現プロファイルを把握するための、特異的かつ感度の高い手法を構築することです。これは、まず細胞から糖鎖フィンガー脂質を抽出することで達成されます。次に、中性糖鎖フィンガー脂質を酸性糖鎖フィンガー脂質から分離します。中性脂質からリン脂質を除去した後、抽出された糖脂質を、ヘキソースのすべてのヒドロキシ基をメトキシ基に置換するパーメチル化反応を用いて化学的に修飾します。最終的に、抽出された糖脂質は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（MALDI-TOF MS）およびイオントラップ質量分析法を用いて分析されます。分析用HPLCや抗体染色などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、質量分析の方が感度が高く、分子量を正確に測定できる点にあります。この手法は、低含有量の糖脂質抗原の測定など、免疫学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。GD2やグローバルHなどの多くの糖脂質抗原ががんバイオマーカーとして発現しているため、この技術の影響はがんの治療や診断にまで及びます。ここでは、DA Pen Zoe教授の研究室の学部生として、その手順を実演します。David Hawk博士が質量分析計を用いて操作を行います。この手順を開始する前に、血球計数計で細胞数を数え、ラット好塩基性白血病細胞を準備してください。トリパンブルー染色後、細胞生存率は95%以上である必要があります。まず、クロロホルムとメタノールの体積比1:1の混合液6 mLを細胞に加えて、脂質を抽出します。混合極性溶媒を用いて、1〜2時間十分に超音波処理を行います。最終抽出として、記載の手順に従って調製したイソプロパノール、ヘキサン、水の体積比55:25:20の溶媒を用いて、この手順を2回繰り返します。クロロホルムとメタノールを6 mLずつ加え、事前に超音波処理を行います。超音波処理の後、遠心分離を行い、4,000 RPMで5分間遠心して不溶性物質をペレット化します。SpeedVacで4時間乾燥させる前に、上清を回収します。中性脂質を酸性脂質から分離するために、DEAE-Sephadex A-20の小型カラムを用いて陰イオン交換クロマトグラフィーを行います。このビデオに付随する書面の手順に従ってDEAE SEDEX A 25を調製した後、ガラス壁と9インチのパステラピペットを用いてカラムを準備します。樹脂粉末がカラムを通り抜けないよう、ガラス壁を注意深くパッキングしてください。カラムを乾燥させないようにしながら、9インチのパステラピペットのネックにDEAE sedex A 25樹脂を加えます。ベントに樹脂が残っていないことを確認します。クロロホルム、メタノール、水の体積比を30:60:10として脂質を溶解し、超音波処理して再懸濁させ、溶解したサンプルをカラムに適用します。中性脂質はカラムを通り抜けますが、荷電脂質はカラム内に保持されます。酸性脂質分画を、メタノール中ナトリウムアセテート8 mLを用いて溶出させます。ここでは、酢酸ナトリウムで処理した後の乾燥させた負電荷画分を示します。透析後、スライド Eliza 透析カセットを用いて透析を行い、画分を脱塩します。高性能薄層クロマトグラフィー（H-P-T-L-C）を用いて脂質の予備分析を行う前に、スピードバックで画分を乾燥させます。H-P-T-L-C を実施するために、単離した中性糖脂質（gsl）を、クロロホルムとメタノールの体積比 1:1 の溶媒 200 µL に溶解させます。シリカゲル薄層クロマトグラフィープレートに試料を負荷します。プレートを乾燥させた後、クロロホルム、メタノール、水の体積比を60:35:8として展開します。酸性脂質またはガングリオシドであるグリコフィンガ脂質を、300 °Cで硫酸を用いて可視化します。溶媒としてイソプロパノール、ヘキサン、水の体積比を55:25:20とし、同様の手順でH-P-T-L-Cに供します。この時点で、中性画分には中性糖脂質だけでなくリン脂質も含まれているため、アセチル化およびパラアセチル化反応によってこれらを除去する必要があります。まず、DEAE-Sephadex A-25を通過した画分を、冷却しながらSpeedVacで4時間乾燥させます。サンプルが乾燥した後、再びスピードバックに戻し、さらに4時間乾燥させます。水分が残っているとパラアセチル化反応が阻害されるため、サンプルが完全に乾燥していることを確認してください。最大200 µgのグリコスフィンゴ脂質のパラアセチル化反応を行うため、1 mLのPERINEと0.5 mLの無水酢酸をサンプルに加え、37 °Cの暗所で一晩インキュベートします。GSLが最適な温度で、1 mLのトルエンを加えて完全に蒸発させ、スピードバックで3時間かけて分離した材料を乾燥させます。サンプルがまだ完全に乾燥していない場合は、乾燥するまでスピードバックを継続します。ここに示されているのが、乾燥したパラセティックサンプルです。その間に、まずFlorisilビーズを110 °Cのオーブンでインキュベートして完全に乾燥させ、Florisilカラムを調製します。次に、パスタピペットにグラスウールを用いてカラムを調製します。ビーズをパスタピペットのネックまで充填し、1,2-ジクロロエタンとヘキサンの体積比4:1の混合液で平衡化させます。フルーセルカラムからの溶出は非常に速いため、溶媒の高い揮発性によってカラムが乾燥する可能性があります。したがって、カラム操作を行う前にすべての溶媒混合液を調製しておく必要があります。溶出中にカラムを停止させることはできないため、パーセント試料 1 mLを、1,2-ジクロロエタンとヘキサンの4:1（体積比）混合溶媒で適用します。その後、同溶媒 6 mLでカラムを洗浄し、続いて1,2-ジクロロエタン 10 mLで溶出させます。中性パーセトGSLを、1:1の容量比の1,2-ジクロロエタンおよびアセトン6 mLを用いて処理します。このステップにより、パーセト糖脂質はフルオロルカラムに結合しますが、パーセトリン脂質は結合しないため、パーセトリン脂質が除去されます。SpeedVacで2時間かけて分画物を乾燥させた後、2 mLの0.5 Mナトリウムメトキシドおよび2 mLのメタノールを用いて、室温で3時間脱アシル化を行います。インキュベーション後、3 mLのメタノールと酢酸を用いて混合物を中和し、SpeedVacで乾燥させます。乾燥した生成物を3 mLの水に溶解させ、Slide-Ez dialysisカセットに注入し、水を少なくとも2回交換しながら24時間水に対して透析を行います。透析後のGSLをSpeedVacで完全に乾燥させ、パーメチル化を行います。まず、特別な乾燥条件や不活性ガス雰囲気を用いずに、化学フード内でGSLをテフロンライナー付きのスクリューキャップガラス管に150 µLのジメチルスルホキシドとともに導入します。化学用乳鉢と乳棒を用いて水酸化ナトリウム粒子を粉砕し、粉末状の水酸化ナトリウムを調製します。次に、スパチュラを用いて水酸化ナトリウム粉末を試料溶液に加えます。次に、100 µLのハミルトンシリンジを用いて、10 µMのメタンを80 µL加えます。メチル化反応を2 mLの水で停止させた後、室温で1時間振とうします。2 mLのジクロロメタンを添加して、完全メチル化生成物を抽出します。糖脂質は下層であるジクロロメタン相に移行するため、上層を新しいガラスチューブに移します。その後、クロロメタネを用いてパーメチル化産物を合計3回抽出します。合わせたジクロロメタン抽出液を2 mLの水で3回洗浄し、各洗浄後に上層の水相を廃棄します。最終洗浄後、サンプルを新しいチューブに移して乾燥させます。SpeedVacを用いて乾燥させたサンプルを100〜200 µLのメタノールに溶解し、記載のプロトコルに従って質量分析を行います。サンプルはテキサス大学MDアンダーソンがんセンターのプロテオミクス施設に提出され、MALDI-TOF-MS/MS質量分析計およびイオントラップLTQ質量分析計を用いて分析されました。ここでは、ラット白血病細胞株RBLからのグリコフィンガー脂質のMALDI MS分析の例を示しています。RBLは、NKT細胞にグリコフィンガー脂質抗原を提示する抗原提示細胞の一種です。グリコフィンガー脂質の合成を阻害する薬剤で処理したRBL細胞において、イオンを特定のグリコフィンガー脂質構造に割り当てることができます。その結果、すべてのグリコフィンガー脂質が著しく減少していることが観察されました。構造異性体を区別することはできません。Applied Biosystems 4,700のmsms機能により、MS1イオンをMS2フラグメントに断片化させることができ、限定的な構造情報を得ることが可能です。しかし、MS2解析だけではオリゴ糖異性体を識別するには不十分なことが多く、一方でグリコフィンガー脂質のイオントラップMS解析を用いれば、オリゴ糖異性体の研究を行い、そのような異性体を検出することが可能になります。標準のIGB threeおよびGB threeを、この特性に示されるように差異が見つかるまで複数回のフラグメンテーションで分析しました。IGB threeとGB threeを異なる比率で混合した際に得られた、IGB threeまたはGB three由来のイオンのMS fourプロファイルです。各アイソマー由来のシグネチャーイオンのイオン強度に基づいて、標準曲線を作成できます。ここで示す例では、標準物質と比較することでIGB threeとGB threeを識別できました。このスペクトルは、1 3 2 5のMS4分析を示しています。分子イオンはGB3およびIGB3のIMRを表しており、IGB3およびGB3のシグネチャーイオンが検出されたことから、これら2つの異性体の混合物が存在することが示唆されました。IGB3とGB3の比率は、標準曲線との比較により算出されました。この手順を行う際は、糖脂質のプロメチル化の前に、クロマトグラフィーにおいて糖脂質を完全に回収することが重要です。精製過程で少なくとも80 µgの糖脂質が回収されるようにしてください。このビデオを視聴することで、半定量的な質量分析法による糖脂質の分析方法について十分に理解できるはずです。糖脂質の抽出、中性分画と酸性分画への分離、パーミルメチル化反応による修飾、そして修飾した糖脂質の質量分析施設への提出という主要なステップを習得します。1,2-ジクロロエタン、クロロホルム、クロロ酢酸、およびヨードメタンの取り扱いは、極めて危険であり発がん性があるため、本手順の実施中は常に手袋や白衣などの予防措置を講じてください。規則を遵守し、研究に取り組んでください。

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Research

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