Name: 軟骨アガロースゲルの機械的刺激 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: 学ぶ軟骨細胞への動的機械圧縮負荷法。アガロースゲル封入細胞を用いてコラーゲンとプロテオグリカン合成を評価し、組織工学における軟骨修復戦略の開発に重要な知見を提供します。

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1。プライマリ関節軟骨細胞の単離動物の関節の関節面から収穫10月15日全層軟骨スライス（ローカルabbatoirから得られた骨格成熟した牛の中手·指関節など ）。 <ol><li> 37℃で2時間、ハムF-12（w / v）の中の0.5％プロテアーゼ20mlの100mmペトリ皿とインキュベート℃の場所軟骨スライスハムF-12培地で3回リンスした後、0.15％コラゲナーゼ20mlで37℃で一晩インキュベートハムF-12培地（℃） </li><li>きれいな皿に200メッシュのスクリーンフィルタを介して細胞懸濁液をろ過する。ハムF-12 5mlでフィルターを洗って皿に追加します。 50 mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移す。ハムF-12 10mlのペトリ皿を洗い、コニカルチューブに追加します。 </li><li>室温で6から8分間600から800 rcfでチューブを遠心分離します。 </li><li>目を動かさないように確保し、上清を吸引し電子細胞ペレットとハムF-12培地40mlに再懸濁する。 </li><li> 6月8日分の600から800 rcfでチューブを遠心分離します。 </li><li>合計3回の手順1.4と1.5を2回以上繰り返します。前に三回目の遠心分離に、攪拌を介してペレットを再懸濁し、細胞をカウントするための500μlのアリコートを得る。 </li><li>血球計および倒立光学顕微鏡とトリパンブルー排除法9を使用して生細胞数を数えます。 </li><li>上清を吸引除去し、所望の播種密度（カプセル化後の10×10 6細胞/ mlの最終濃度のために、例えば 20×10 6細胞/ ml）を倍増させるハムF-12培地の体積でペレットを再懸濁する。 </li></ol> 2。軟骨細胞 - アガロースハイドロゲルのカプセル<ol><li>ヒート0.8グラムオートクレーブ滅菌タイプVIIアガロース溶解°Cまで、120に設定したホットプレート上に滅菌1X PBS（pH7.4）を20mlのインチ一度溶解し、℃より高い温度として60に熱を下げるウィルlは、細胞の生存に影響を与えます。 </li><li> 50 mlコニカルチューブでは、徹底的にアガロース（最終2％アガロースヒドロゲルのための例えば、4％アガロース懸濁液）の二重所望の濃度で細胞懸濁液の等量を混ぜる。彼らは細胞の生存に影響を与え、疲労寿命を構築することができるような大きな気泡の生成を避ける。 </li><li>大きな気泡の生成を回避しながら、直径60mmのペトリ皿に注意深くアリコート軟骨細胞 - アガロース混合物10mlを、。 </li><li>ゲル化するまで室温で30分間放置する。 </li><li>必要に応じて4ミリメートル生検パンチを使用して（通常は20から30）は、多くの軟骨アガロースハイドロゲルをサンプルとして取得します。 </li><li>マイクロメーターを用いて代表的なサンプルの物理的な大きさ（直径と高さ）を測定し、記録します。構造物の高さが約5​​ mmでなければなりません、試料高さの分散が2％以上であった領域から得られたすべてのサンプルを破棄します。 </li><li>新鮮な60ミリメートルペトリ皿とサプリメントにサンプルを転送完全培地10ミリリットル（20mMのHEPES、100μg/ mlのアスコルビン酸、および2倍の抗生物質/抗真菌剤とハムF-12培地中で、例えば 20％のウシ胎児血清）を持つ。 </li></ol> 3。軟骨アガロースゲルの機械的刺激と放射性<ol><li>圧縮リグの金属部品をオートクレーブ。 70％エタノール（一晩）と紫外線（少なくとも15分間）でプラスチック部品を使用して滅菌する。 </li><li> 24穴培養プレートのウェル内に、転倒鉗子を使用して、場所12滅菌したプラスチック製リテーニングリング（コンストラクト径より大きい内径を持つ）（ただし、n = 6、検体およびコントロール）から構造物を維持する。 </li><li>ピンセットを用いて、慎重に止め輪の各1を確保し、ペトリ皿から24ウェルプレートに軟骨細胞 - アガロースヒドロゲルを転送します。 </li><li>完全培地を400μl（20mMのHEPESとハムF-12培地中、例えば 20％のFBS、100μg/ mlのアスコルビン酸を移し、各サンプルウェルに）抗生物質/抗真菌剤の2倍。 </li><li>滅菌した圧縮リグ（ 図1）を構築し、止めネジでプラテンを固定します。 24ウェル培養プレートに圧縮リグを取り付けます。 </li><li>プラテンハイドロゲルコンタクト（ゼロひずみ状態）を確立するためにセットスクリューを解放し、再固定します。 </li><li>マッハ1微小機械試験システムに組み立て圧縮リグをロードします。セットネジで位置決めピンとロックを介して垂直ステージへの安全なリグ。間隔治具を外します。 </li><li>周波数（ 例えば 1 Hz）と持続時間またはサイクル数（60分などの時間間隔まで）、所望の振幅（サンプルの元の高さに基づいて、 例えば、10％のひずみ振幅）で動的圧縮荷重を適用します。 </li><li>機械的な刺激が完了すると、間隔治具を交換する位置決めピン止めねじを緩め、マッハ1マイクロメカニカル試験システムから圧縮リグや培養プレートを取り外します。 </lI&gt; <li>放射性標識細胞のヒドロゲル所望の同位体（軟骨細胞特有のコラーゲン合成および[35 S] -硫黄プロテオグリカン合成のためのもの [3 H] -プロリンタンパク質標識）の5μCiのあるメディアを補完することにより構造物。 </li><li> 37℃で24時間、放射性標識された構造物をインキュベート℃、5％CO 2で10。 </li><li>放射性標識されたハイドロゲルの構築物を収穫し、法人格のない任意の同位体を除去するために1X PBS（pH7.4）中で3回すすいでください。パパイン（20 mM酢酸アンモニウム、40μg/ mlの、65℃で1mMのethyldiaminetetraacetic酸および2mMジチオスレイトール℃で72時間の場合）を使用してダイジェストのサンプル。 </li><li>ピコグリーン色素アッセイ11とで設立された同位体の活動、12,13直後パパイン消化を数え、β-液体シンチレーションによって、DNA含量に正規化を用いてDNAコンテンツに関するアッセイダイジェスト。 </li></ol>注：放射性物質の購入·処分（廃棄物の同位体とアイテム接触放射性物質になってきたかもしれない）（および/または政府）の政策や放射性物質の安全な取り扱いと廃棄のための手順、関連制度に従わなければなりません。 4。代表的な結果ウシ関節軟骨細胞-アガロースハイドロゲル構造体（10×10 6細胞/ mlカプセル化された細胞を2％アガロース）を機械的に20から60分（または1200〜3,600サイクルの1 Hzの周波数で10％の圧縮歪の振幅で刺激した）及び放射性同位元素の取り込みによってDNA含量および細胞外マトリックス合成についてアッセイした。 DNAや細胞外マトリックスの合成が用量依存的に影響を受けました。刺激の60分は、（ 図2）は効果を示さなかったのに対し、DNA量は、刺激の20〜30分と有意（p &lt;0.01）の結果として重要な35％の減少を示した。軟骨特異的コラーゲンとプロテオグリカン合成（[3 H] -プロリンとによって決定されるそれぞれ[35 S] -硫黄混入は）観察可能な効果を示さない刺激の60分（ 図3）と、刺激の20〜30分と有意（p &lt;0.01）に対応して約60％の大幅な増加を示した。 <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="図1" /> 。軟骨アガロースコンストラクトを刺 ​​激するための特注の動的圧縮リグの図1の回路図左 ：組み立て済みのリグ右 ：個々の構成要素を示す分解図。 <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：軟骨細胞-アガロースのDNA含量の変化は、機械的に20から60分（平均±SEM、N = 6/groupを意味する）は1Hzで10％の圧縮ひずみ振幅下で刺激ヒドロゲル。 図3：軟骨細胞-アガロースの細胞外マトリックス合成の変化は（コラーゲンおよびプロテオグリカン）機械的に20から60分（平均±SEM、N = 6/groupを意味する）は1Hzで10％の圧縮ひずみ振幅下で刺激ヒドロゲル。

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

<html>細胞播種アガロースヒドロゲルへの制御された機械的刺激を加えるための記載された方法は、軟骨代謝に及ぼす動的圧縮力の影響への直接調査を行うことが可能。保持リングと一緒にカスタム·テスト·リグを使用することによって、サンプルの転倒の潜在的な問題を回避するための構成体の横方向の制約を提供した。セットのクルーによって保護死ん加重ローディングプラテンを使用することによって、サンプルの高さの潜在的な違いにもかかわらず、構造物との直接の接触を確実にします。刺激後の細胞の生合成を測定するために放射性同位元素標識法は、動的機械刺激の複数の用途に利用される単一のテスト·リグを考慮して、汚染の可能性を低減します。この方法は簡単に別の機械的負荷モード（ 例えばせん断1,4、緊張1,2）の効果を調べるために、または特定のメカノトランスダクション経路が責任を解明するために適合させることができます。 ove_content &quot;&gt;代表的な結果は、約35％の細胞死少量のコンストラクト細胞性15から17に影響を及ぼしていない機械的な刺...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬や機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>ハムF-12 </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸塩</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td>抗生物質/抗真菌薬</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshopカナダ株式会社</td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td>ライヘルトブライトライン 血球計</td><td> Hausser科学</td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td>クワント-iTのピコグリーン</td><td>インビトロジェン</td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td>パパイヤラテックスからのパパイン</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyldiaminetetraacetic酸</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-ジチオスレイトール</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース、VII型</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;TR&gt; <td>メッシュスクリーン（200）フィルタ</td><td>シグマアルドリッチジャパン（株） </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td>マッハ1マイクロメカニカルテスター</td><td> Biomomentum株式会社</td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td>圧縮ローディングジグ</td><td>特注の</td><td></td><td>同様の製品はBiomomentum社によって供給することができる</td></tr><tr><td>ファルコン24ウェル培養プレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β - 液体シンチレーションカウンター</td><td>ベックマン·コールター</td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H]プロリン</td><td>パーキンエルマー</td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S]硫黄</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

軟骨アガロースゲルの機械的刺激

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

機械的傷害や変形性関節症などの疾患による劣化によって破損時の関節軟骨は、限られた修復能力に苦しんでいる。この欠点を改善するために、いくつかの医療介入が開発されている。そのような方法の一つは、組織工学軟骨損傷した領域を再浮上することですが、設計された組織は、典型的には、長期的な存続可能性に疑問を投げかけ、ネイティブ軟骨の生化学的特性と耐久性を欠いている。これは、注入材料を保護するために、周囲の組織に頼らず、小焦点欠陥の修理に軟骨組織工学の応用を制限します。開発組織の特性を改善するために、機械的な刺激は、軟骨細胞外マトリックスの合成と同様に設計された組織の結果として得られる機械的特性を向上させるために利用される一般的な手法です。機械的な刺激は、組織への力は、生体内で経験したものと類似の構築に適用されます。この機械的な環境は、部分的には、天然組織1,2の開発と保守を調節していることを前提としている。軟骨組織工学における機械的刺激の最も一般的に適用されたフォームは1Hz 1,3の周波数で約5〜20％の生理的な歪みにおける動的圧縮です。いくつかの研究では、動的圧縮の影響を調査して、それが最終的に開発された4月8日組織の機能的特性に影響を与える、軟骨細胞代謝と生合成にプラスの効果を有することが示されています。本稿では、機械的に、動的圧縮下で軟骨細胞 - アガロースハイドロゲル構造体を刺激し、生化学的および放射性同位体のアッセイを通じて生合成の変化を分析するための方法を示す。また、この方法は容易に機械的刺激の結果として細胞応答におけるどんな潜在的に誘発された変化を評価するために変更することができます。

軟骨細胞による軟骨細胞外基質の生合成は、機械的刺激を印加することによって影響を受けることができます。このメソッドは、3Dコンストラクトおよび軟骨代謝の誘導された変化の評価にカプセル化された軟骨細胞への動的圧縮歪みを適用する方法について説明します。

関節軟骨は、機械的な損傷や変形性関節症などの疾患による劣化が生じた際、その修復能力が限定的であるという課題があります。これを改善するために...

この手順の目的は、細胞を播種したハイドロゲルに動的機械圧縮負荷をかけることです。そのために、まず軟骨スライスを解剖し、酵素消化を行うことで初代細胞を回収します。単離した細胞を2%アガロースハイドロゲル内に封入し、生検パンチを用いて細胞播種コンストラクトを作成します。その後、サンプルを圧縮負荷装置にセットし、Mach-1マイクロメカニカルスティミュレーターに装着します。次に、細胞を播種した構築物に動的圧縮負荷を加え、コラーゲンおよびプロテオグリカンの合成を評価します。インキュベーション後、構築物を放射性標識し、取り込みを確認します。アイソトープはシンチレーション計数法によって定量化し、得られたデータをDNA量で標準化します。この内容は、機械的刺激後の細胞外マトリックス合成の変化を示しています。この手法により、カウンターサイトの応答と機械的刺激に関する知見を得ることが可能です。本手法は、幹細胞や他の結合組織、あるいは機械受容細胞などの他の系にも適用可能です。本研究で使用した骨格的に成熟した牛の中手指節関節は、地域の屠畜場において、無菌的な解剖エリアで採取しました。ラミナーフローフード内で、軟骨スライスを0.5% protease含有hams, F 12 20 mL入りの直径100 mmのペトリ皿に入れ、37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、プロテアーゼ溶液を吸引し、Hams F 12培地を加えてスライスを優しく撹拌しながら洗浄し、その後吸引します。この操作をさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後、培地を吸引除去します。0.15% collagenase Aを含むHams F 12を20 milliliters加え、ディッシュを37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、細胞懸濁液を200メッシュのスクリーンフィルターを用いて清潔なペトリ皿にピペットでろ過します。フィルターを洗浄するため、さらに5 millilitersのHams F 12をピペットで加え、ろ液を同じ皿に回収します。細胞懸濁液を50 milliliterコニカルチューブに移します。シャーレを10 millilitersのhams F 12で洗浄します。次に、洗浄液をコニカルチューブに移します。室温で600から800 RCFで6分から8分間、遠心分離します。遠心完了後、細胞ペレットを乱さないように注意しながら上清を吸引します。ペレットを40 millilitersの培地で再懸濁します。チューブを600から800 RCFで6から8分間遠心分離します。吸引、再懸濁、および遠心分離をさらに2回繰り返し、3回目の遠心操作前までに計3回行います。撹拌してペレットを再懸濁し、細胞計数用に500 µLのアリコートを分取します。3回目の遠心操作の間に、ヘモサイトメーターと倒立光学顕微鏡を用い、トリパンブルー排除法によってアリコート中の生存細胞数を計測します。細胞数が決定し、3回目の遠心分離が完了したら、上清を吸引して再懸濁します。ペレットを、目的の播種密度の2倍の濃度の培養液で懸濁します。ここでは、軟骨細胞を20 × 10⁶ cells/mLで再懸濁します。手順の次のステップは、単離した初代関節軟骨細胞をarosハイドロゲルに封入することです。ビーカーに0.8 gのarosを20 mLの滅菌PBSに懸濁させます。ビーカーを120 °Cに設定したホットプレートの上に置き、arosが溶解するまで待ちます。50 mL conical tubeを用いて、温度を60 °Cに下げます。細胞懸濁液と、目的濃度の2倍の濃度に調整した加熱済みaro溶液を等量ずつ混合します。ここでは、5 mLの細胞懸濁液に4% agro懸濁液5 mLを加え、最終的に2% Agrosハイドロゲルとします。細胞の生存率に影響を及ぼす可能性がある大きな気泡ができないように注意しながら、ピペッティングにより十分に混合してください。次に、軟骨細胞アガロース混合液10 millilitersを、直径60 millimeterのペトリ皿に慎重に分注します。この際、大きな気泡ができないように注意してください。皿に蓋をします。その後、混合物を室温で30分間静置します。混合物が凝固したら、4 mmの生検パンチを用いて、可能な限り多くの軟骨細胞アグロハイドロゲルサンプルを採取します。通常、20〜30個のサンプルが得られます。マイクロメーターを用いてサンプルを清潔なペトリ皿に配置し、各サンプルの直径と高さを記録します。理想的には、構築物は高さ約5 mmである必要があります。サンプルの高さが2%を超える領域から得られたサンプルは破棄してください。サンプルを、10 mLの完全培地を含む新しい60 mmペトリ皿に移します。プロトコルのこの段階では、細胞が定着した構築物に動的圧縮による機械的刺激を与えます。これは、コンストラクトを負荷するPLAを模擬的な1マイクロメカニカルシステムに機械的に結合し、コンストラクトに適用される圧縮量を制御するカスタム設計の圧縮リグを用いて行われます。この手順で最も困難な点は、圧縮リグにサンプルをロードすることです。動的な圧縮負荷を適切に適用するためには、リグ内のプレートを正しく調整することが重要です。使用前に、圧縮装置の金属部品をオートクレーブで滅菌します。プラスチック部品は70% ethanolで一晩滅菌し、さらにUVライトを15分以上照射してください。これは、軟骨細胞含有arosハイドロゲル構築物が倒れないようにするためです。ピンセットを使用して、24ウェル培養プレートのウェルに12個の滅菌済みプラスチック製リテイニングリングを配置します。リテイニングリングの内径は、コンストラクトの直径よりも大きい必要があります。ピンセットを用いて慎重に操作してください。コンドロアロスハイドロゲルをペトリ皿から24ウェルプレートに移し、それぞれを保持リングで固定します。各サンプルに400 µLの完全培地を分注します。次に、滅菌済みの圧縮装置を組み立て、セットスクリューを用いてPLAを固定します。圧縮リグを24ウェル培養プレートに取り付け、ハイドロゲルとの接触状態を確立し、再度固定します。セットスクリューによる変形は、この負荷のない参照状態、すなわちゼロ歪み状態で適用されます。組み立てた圧縮リグを、定位ピンを用いてMach oneマイクロメカニカル試験システムにロードします。装置を垂直ステージに固定し、セットスクリューを使用してロックします。スペーシングジグを取り除きます。Mach oneソフトウェアインターフェースを使用して、周波数を1 Hz、振幅を350 µm、サイクル数を1,200回に設定します。サンプルの元の高さに基づき、10%の歪み振幅で動的圧縮負荷を印加します。機械的刺激を開始するには、スタートボタンを押し、mach one アクチュエータを起動させます。培養プレートに取り付けられた負荷装置には上下に動く6つのインデンタがあり、6つのサンプルを同時に刺激します。非刺激コントロール試料も同じ培養プレート内に配置しますが、くぼみのあるウェルには配置しません。ランが完了すると、mach oneがビープ音を鳴らし、アクチュエータがアンロード済みのリファレンス状態に移動します。機械的刺激の完了後、スペーシングジグを元に戻してください。位置決めピンの固定ねじを緩め、放射性標識の隣にある試験システムから圧縮装置と培養プレートを取り出します。細胞ハイドロゲル構築物の各ウェルに、軟骨細胞特異的なコラーゲン合成用のTritium Proleneタンパク質標識 5 µCiおよびプロテオグリカン合成用のS 35硫黄 5 µCiをそれぞれピペットで加えます。放射性標識した構築物を37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートし、放射性標識ハイドロゲル構築物を回収します。ピンセットを使用し、各ハイドロゲル構築物をPBSに浸漬して3回洗浄します。未結合の同位体を除去するため、洗浄した構築物を1.5 mLチューブに入れます。次に、1.5 mLチューブに500 µLのpape溶液を加えます。加熱ブロックに設置し、65 °Cで72時間消化させます。消化が完了すると、サンプルは比較的透明になります。パペ消化後すぐに、各サンプルから100 µLずつ分注し、pico green Dアッセイを用いてDNA含量を測定します。次に、各サンプルからさらに100 µLを分注し、液体シンチレーション計数法により取り込まれたアイソトープ活性を測定します。得られたアイソトープ活性は、解析のためにDNA含量で標準化する必要があります。10^6 cells/mLの細胞を封入した2% arosで構成される牛関節軟骨細胞arosハイドロゲル構築物を、圧縮歪み振幅10%、周波数1 Hzで20分から60分間、または1,200回から3,600サイクルにわたって機械的に刺激した。その後、放射性同位体取り込み法により、DNA含有量および細胞外マトリックス合成を分析した。ここで示されているように、DNAおよび細胞外マトリックスの合成は、濃度依存的に影響を受けました。DNA含量は、20分または30分の刺激によって、p値0.01未満で有意な35%の減少を示しました。一方、60分の刺激では影響が見られませんでした。軟骨特異的なコラーゲンおよびプロテオグリカンの合成は、それぞれトリチウム、プロリン、および S 35 硫黄の取り込みによって測定されました。これらは、20分または30分間の刺激に応じて約60%の有意な増加を示し、p値は0.01未満でした。一方、60分間の刺激では、観察可能な効果は認められませんでした。このビデオを視聴することで、ダイナミックインプレッションを用いてハイドロゲル培養物を機械的に刺激する方法を十分に理解し、このプロトコルを同様の用途に応用できるようになります。

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

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軟骨アガロースゲルの機械的刺激

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