Name: 機能アッセイのための組織抗原の抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶ 機能アッセイ用の組織抗原抽出法。ヒト組織をBAW溶液でホモジナイズし、タンパク質濃度測定後に凍結乾燥して溶媒を除去する。毒性溶媒を使用せず、T細胞増殖およびサイトカイン分泌アッセイに適用可能な抗原を調製できる。

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この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（NHMRC＃559007）と若年性糖尿病研究財団（JDRF 4-2006-1025）とビクトリア州政府の業務インフラスキームからの補助金によってサポートされています。我々は、ヒト組織を提供するためのトムマンデル膵島移植プログラムの膵島分離チームのメンバーに感謝。ヒトの組織は、ローカル倫理承認（聖ビンセント病院HREC-011/04とセント·ビンセント健康HREC-135/08）で収集され、使用されていました。

1。脾臓組織の準備<ol><li>注 - すべての人間の材料は、感染の危険として扱われるべきであり、すべての手続きは、クラスII層流内閣で実施すべきである。滅菌ハサミとピンセットを用いて、脾臓切片（サイズは〜1-2 CM）から脂肪や繊維組織を除去し、可能な限り外側のカプセル材料の限りを切り落とす。 </li><li>脾臓組織の小片（1〜2 cm 3）をカットし、滅菌した50mlファルコンチューブに各ピースを置きます。 </li><li>液体N 2中に浸漬することにより、組織の断片をスナップインの凍結。 </li><li> -80℃で保存同様のプロトコルは、他の組織（複数可）に適しています。 </li></ol> 2。ストレージ用ヒト膵島の準備<ol><li> CMRL培地で培養膵島。 10ミリリットルコニカルチューブに小島を収集し、5分間1,500 rpmで遠心分離することにより、PBSで2回洗浄する。 PBSを捨て、ペーパータオルの上に簡単に反転管を配置することによって、残った液を排水します。ないように注意する膵島を取り除きます。 </li><li>一度-80℃で液体窒素や店舗内にチューブとスナップ凍結℃に再キャップ、排水</li></ol> 3。抽出液を調製<ol><li> 4℃のBAWミックス（10:30:60％v / v）およびストアを準備℃に</li><li> -80℃からチューブを取り外し室温で解凍する。 </li><li>組織片をカバーするのに十分な氷のように冷たいBAWを追加します。小島が3-5 mlを使用しています。脾臓組織のための組織片の大きさに応じて10〜20ミリリットルを使用しています。 </li><li>組織ホモジナイザーを組み立てる。 70％エタノール/水の10〜20 mlを &quot;均質化&quot;によって清掃してください。 </li><li>組織とBAW溶液をチューブにホモジナイザーのプローブを配置した後、複数のバーストで組織をホモジナイズする。その後氷バケツにチューブを保持します。 </li><li>徹底的に10から20まで、70％エタノール/ mlの水とその後のBAWバッファを均質化することにより、サンプル間のホモジナイザーを清掃してください。これは、私たちの後に70％エタノール/水でsamples.Dismantleandクリーンとの間の組織の交差汚染を防止電子。 </li><li>唯一の水溶性物質を含有する抽出物が必要な場合は、RTで10分間4,000 rpmで均質化された組織抽出液を遠心分離します。より多くの粗抽出液が必要な場合は、室温で5分間1,000 rpmでスピン。 BAWの不溶性タンパク質を抽出するための最も適切な手法は、タンパク質の下流分析に依存します。機能的な免疫学的ア ​​ッセイで使用するために我々は以前に、これは6忍容性が良好であることが判明しているように、8 M尿素で不溶性画分を溶解しようとお勧めします。 </li><li>きれいなチューブに上清移し、氷の上に置いた。 </li><li> BCAアッセイまたは類似を使用して抽出液中のタンパク質の濃度を決定する。 </li></ol> 4。乾燥抽出物を凍結<ol><li>必要なタンパク質の質量（ すなわち 、チューブあたり100μg）に応じて、それに応じてホモジネートを希釈し、ラベルの付いた5.0ミリリットル滅菌、ファルコン（12x75 mm）のチューブにアリコートを分注する。私たちは頻繁には100μg/チューブを使用してください。 </li><li> 1を使用します各チューブのキャップに3つの穴を作るために8から20ゲージ滅菌注射針。 </li><li> 〜10分間ドライアイス上または&gt; 1時間-80℃の冷凍庫に入れて、どちらかのチューブを凍結。 -80℃で保存凍結乾燥機を置くために準備ができるまで。 </li><li>凍結乾燥機のスイッチを入れ、（-100℃）で平衡化させます。これは、約30分かかります。 </li><li>ボリュームに応じて、凍結乾燥を3時間以内に完了しますが、我々は日常的に一晩私たちのサンプルを残すことができます。 </li><li>乾燥サイクルが完了した後、真空ポンプのスイッチを切り、ゆっくりチャンバに圧力を許す。ラックを取り外します。 </li><li>無菌フードでは、チューブから穴あきキャップを外し、新しいもの（ファルコン352032）と交換してください。 </li><li> -20℃で保存して管サンプルは培養培地、または他の緩衝液中で再構成し、機能的または生化学的アッセイに使用することができる。 </li></ol> 5。代表的な結果 図1は、タンパク質の染色を示すゲルは脾臓および膵島枯渇膵臓組織（腺房のラベルが付いている）からの抽出物が搭載されており、ヒト膵島（ラベル付き小島）精製した。結果は、各組織ごとに異なる​​分子量のタンパク質の良い表現を示しています。 ヒトT細胞増殖を刺激する組織抽出物の容量はCFSEベースの増殖アッセイ7（ 図2）を用いて試験した。このアッセイにおいて使用PBMCは1型糖尿病を持つ個体から単離された。応答の大きさは、83.1 5000、CD4 +、CFSE明るい細胞あたりCFSE 薄暗い細胞数の比として表される：5000 CD4当たりCFSE 薄暗い細胞の+、三連の試料7からの抗原を持つ細胞のCFSE 明るい 。結果は、弱者を示すが、腺房に応じて検出可能な、増殖（CD1 = 3.5）および膵島エキス（6.8）への強い応答。不活化インフルエンザウイルス（CDI = 142.6）は次のように含まれていますポジティブコントロール。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> 図1タンパク質ゲル。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> 図2房と膵島エキスに対してCFSEベースの増殖アッセイの結果は。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

我々はこのような界面活性剤などの有害な化学物質から自由であったヒト組織からの抽出物を生成したかったので、このプロトコルが開発されました。具体的に我々は、in vitroでのヒト免疫機能のアッセイに使用することができるヒト組織の抽出物を調製し、それを使用している。このプロトコルを使用して調製した抽出液を均等に任意のバッファで再構成し、そのようなウェスタンブロッティングや液体クロマトグラフィーなどの多くの生化学的解析に使用できます。これは、多くの下流のアプリケーションにこの技術が適用可能になります。 我々のプロトコルを使用して、組織抽出物への応答は強くありません。我々は&quot;自己&quot;抗原に対する応答を探しているので、これは予想され、我々の場合には膵島抗原に対するT細胞応答は、頻繁に1弱い。以前に我々は、ヒトCD4 +組換えインスリンおよびグルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）に対するT細胞応答、1型糖尿病の自己抗原は、私たちのCFSEベースを使用して検出することができることが分かった増殖アッセイ7,...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 5ミリリットル12×75ミリメートル無菌ポリスチレンチューブ</td><td> BDファルコン</td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td>チューブのポリスチレンチューブ用キャップ（上） </td><td> BDファルコン</td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ミリリットル滅菌チューブ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td> Mallinckradtケミカル</td><td> 2856から10 </td><td></td></tr><tr><td>ブタン-1 - オール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td>ホモジナイザー：PRO200 </td><td>バイオ戦略</td><td> 01-01200 </td><td> 10×115ミリメートルのこぎりジェネレータ</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td></td><td></td><td> VIRTIS、ベンチ4K </td></tr><tr><td>滅菌針18から20ゲージ</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066ミディアム</td><td>シグマ</td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td>シグマ</td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1に特異的な試薬や機器。

機能アッセイのための組織抗原の抽出

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

A、BおよびT細胞によって認識される、適応免疫応答の抗原標的の多くは1に定義されていない。これは、自己免疫疾患や癌2に特に当てはまります。私たちの目的は、自己免疫疾患の1型糖尿病1,3,4,5にヒトT細胞により認識される抗原を調べることである。 T細胞によって認識される抗原が同定されていない組織に対してヒトT細胞応答を分析するために、我々は機能的アッセイ6と互換性のあるフォーマットでヒト組織からタンパク質抗原を抽出する手法を開発しました。抽出方法は、ヒト末梢血単核細胞に有毒であった洗剤が含まれていることをライセートをもたらすので、以前は、未精製の組織抽出物に対するT細胞応答を測定することができなかった。ここでは、ヒトT細胞に有毒ではない形式でヒト組織からタンパク質を抽出するためのプロトコルを記述します。組織はブタン-1 - オール、アセトニトリル、ワットの混合物中で均質化されるER（BAW）。組織抽出液中のタンパク質濃度が測定され、タンパク質の既知の質量をチューブに等分されています。抽出後、有機溶媒は凍結乾燥によって除去される。必要になるまで凍結乾燥組織抽出物を保存することができます。免疫機能、免疫細胞の懸濁液のアッセイに使用するためには、適切な培養培地中で、凍結乾燥した抽出液に直接添加することができる。 PBMCによるサイトカイン産生と増殖は、この方法を用いて調製した抽出物に応じて、容易に測定した。したがって、我々の方法は、T細胞応答の解析における抗原のソースとして使用することができ、人間の組織ライセートの急速な製造を可能にする。我々は、この方法は移植、がんや自己免疫の組織への適応免疫応答の解析を容易にするであろうことを示唆している。

機能的なT細胞アッセイにおける抗原のソースとして使用するヒト組織の抽出物を調製するための単純なプロトコルが記載されている。この方法は、組織由来の抗原に対するT細胞の反応を測定することができる<em&gt; in vitroで</em&gt;。

B細胞およびT細胞によって認識される適応免疫応答の抗原標的の多くは、まだ定義されていません1。これは特に自己免疫疾患において顕著であり...

この手順の目的は、機能的な免疫学的アッセイに適した組織抽出液を調製することです。まず、目的の組織サンプルを採取します。次に、ブタノール、酢酸、アセトニトリル、および水の混合液（BAW）を用いて、組織サンプルをホモジナイズします。タンパク質濃度を決定した後、抽出液を分注し、凍結乾燥させて溶媒を除去します。最終的に、再構成した抽出液を、ヒトT細胞増殖試験またはサイトカイン分泌試験における抗原源として使用します。界面活性剤による溶解などの既存の手法と比較して、この手法の主な利点は、得られる抽出液に毒性のある溶媒や界面活性剤が含まれていないことです。本プロトコルでは、すべてのヒト由来試料は潜在的な感染源として扱い、すべての操作はクラス2 laminar flowキャビネット内で行ってください。滅菌済みハサミとピンセットを使用して、約1〜2 cmサイズの脾臓切片から脂肪組織および線維組織を除去します。外膜を可能な限り切り取り、取り除いてください。脾臓組織を小さく切り分け、各断片を滅菌済みの50 milliliter Falconチューブに入れます。液体窒素に浸して組織片を凍結し、minus 80 degrees Celsiusで保存します。これで、保存培養用ヒトアイレットを調製する手順を開始します。眼球を37°CのCMRL培地で処理します。眼球を10 mLコニカルチューブに回収し、1,500 RPMで5分間遠心分離します。培地を除去し、PBSで2回洗浄します。2回目の洗浄後、回収します。PBSを捨て、チューブを逆さまにしてペーパータオルの上に短時間置くことで、残りの緩衝液を完全に除去します。この際、アイレットが脱落しないよう注意してください。除去後、チューブにキャップをし、液体窒素で急凍結させ、-80°Cで保存します。組織抽出液を調製するには、まず、-80 °Cから組織の入ったチューブを取り出し、室温に戻します。組織は、あらかじめ調製し4 °Cで保存しておいたブタノール、アセトニトリル、水の混合液（BAW）を用いてホモジナイズします。組織を浸すのに十分な量の氷冷BAWを加えます。本デモンストレーションで使用した脾臓組織では、10〜20 mLのBAWを使用しました。組織ホモジナイザーを組み立てます。70%エタノール水溶液20 millilitersをホモジナイズして、ホモジナイザーを洗浄します。次に、組織とBAW溶液が入ったチューブにホモジナイザーのプローブを挿入し、断続的に組織をホモジナイズします。その後、サンプル間の組織の交差汚染を防ぐため、チューブを適切なバケットに入れて保持します。サンプルごとに、10〜20 mLの70% ethanolを水中でホモジナイズし、続いてBAWバッファーで遠心分離することで、ホモジナイザーを徹底的に洗浄します。ホモジナイズした組織抽出

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生物学

堅牢な、小規模のHeLa細胞核抽出物を調製するためのプロトコルが記述されています。このプロトコルはそのような薬剤又はRNAi処理した細胞などの細胞の小集団の使用を必要とするアッセイのために貴重なものです。方法は、患者の細胞を含む遺伝子発現アッセイおよび他の細胞さまざまな種類のに適用する必要があります。...

遺伝子発現用機械の機能的アッセイのための小規模の核抽出物

このビデオでは、ELISpotアッセイを使用して抗体分泌B細胞(ASC)の機能を評価する方法を示しています。ASCから分泌された抗体は、膜結合ポリクローナル抗体フラグメントと相互作用し、酵素標識IgGまたはIgM抗体によって検出されます。各ウェルに生成された色付きのスポットは、B細胞の分泌活性と相関する特定の抗体のアイソタイプの存在を示しています。...

ELISpotアッセイを用いた抗体分泌B細胞の機能評価

ここでは、ホルマリン固定、パラフィン包埋ラット中枢神経系(CNS)および末梢リンパ節(LN)組織切片における二重免疫染色のための最適化された詳細なプロトコールを紹介します。...

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表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

ここでは、免疫組織化学的局在、表現型、組織における抗原特異的 T 細胞の量を決定するとその場でMHC テトラマー染色を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、他のセルの種類および組織の構造を基準にして抗原特異的 CD8 T...

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ひと白血球抗原 (HLA) シーケンス臓器提供者と受信者のペア間の不一致は、臓器移植での拒絶反応の抗体の主要な原因です。レシピエントの抗ドナー HLA 同種抗体をプローブする個々 のドナーの HLA...

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凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

全血ベースのイムノアッセイは、診断および研究目的で抗原特異的免疫を分析するための簡単でリソース効率の高いツールを提供します。この記事では、真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の包括的な分析のための、二重共刺激による最適化された全血ベースのプロトコルを提供します。これには、小児患者および小動物向けの少量バージョンが含まれます。...

真菌およびウイルス性病原体に対する宿主免疫の抗原特異的解析のための二重共刺激による全血アッセイ

私たちは、磁気ビーズベースのT細胞濃縮およびペプチド:主要組織適合遺伝子複合体(MHC)四量体を通じて、マウス肺の希少抗原特異的T細胞集団を単離および同定するための詳細なプロトコールを提供します。...

ペプチド:主要組織適合遺伝子複合体四量体を用いたマウス肺由来の希少抗原特異的T細胞の同定

学ぶ 機能アッセイ用の組織抗原抽出法。ヒト組織をBAW溶液でホモジナイズし、タンパク質濃度測定後に凍結乾燥して溶媒を除去する。毒性溶媒を使用せず、T細胞増殖およびサイトカイン分泌アッセイに適用可能な抗原を調製できる。

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