機能アッセイのための組織抗原の抽出

この手順の全体的な目標は、機能的な免疫学的アッセイに適合した組織抽出物を調製することです。これは、最初に目的の組織のサンプルを収集することによって達成されます。次に、組織サンプルをブタノール、アセト、ニトリル、水、またはBAWの混合物でホモジナイズします。

タンパク質濃度を決定した後、抽出物を割り当てて凍結乾燥し、溶媒を除去します。最終的に、再構成された抽出物は、ヒトT細胞増殖またはサイトカイン分泌アッセイにおける抗原源として使用されます。洗剤溶解のような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、脱走抽出物に有毒な溶剤や洗剤が含まれていないことです。

このプロトコルでは、すべての人体材料を感染性の可能性があるものとして扱い、すべての手順をクラス2のラミナフローキャビネットで実施する必要があります。滅菌ハサミと鉗子を使用して、約1〜2センチメートルの大きさの脾臓切片から脂肪と線維組織を取り除きます。外側のカプセル素材をできるだけ切り取ります。

脾臓組織の小片をカットし、各ピースを滅菌済みの50ミリリットルのファルコンチューブスナップに入れます。液体窒素に浸して組織片を凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。保存培養のための人間のアイレットを準備するための手順を開始すること。

摂氏37度のCMRL培地のアイレット。10ミリリットルの円錐形ボトムチューブ遠心分離機でアイレットを1, 500 RPMで5分間収集します。メディアを廃棄し、2回目の洗浄後、PBSで2回洗浄します。

PBSを注ぎ、逆さにしたチューブをペーパータオルの上に短時間置いて、残りのバッファーを排出します。アイレットが外れないように注意してください。水気を切ったら、チューブをキャップし直し、液体窒素でスナップフリーズし、摂氏マイナス80度で保管します。

組織抽出物を調製するには、まず、組織が入ったチューブを摂氏マイナス80度とTトール室温から取り出します。組織は、ブタノール、アセチル ニトリル、および水、または BAW の混合物で均質化されます。これは、以前に摂氏 4 度で調製および保存されています。このデモンストレーションで使用される脾臓組織の組織片を覆うのに十分な氷冷BAWを追加します(10〜20ミリリットルのBAW)。

ティッシュホモジナイザーを組み立てます。20ミリリットルの70%エタノールを水で均質化することにより、ホモジナイザーを洗浄します。次に、ホモジナイザープローブを組織とBAW溶液を入れたチューブにセットし、組織を複数回に分けてホモジナイズします。

その後、サンプル間の組織の相互汚染を防ぐために、チューブをきれいなバケツに保管してください。10〜20ミリリットルの70%エタノールを水で均質化し、続いてBAWバッファー遠心分離機でサンプル間のホモジナイザーを完全に洗浄します。室温で均質化された組織抽出物。

可溶性材料のみを含む抽出物が必要な場合は、4, 000 RPMで10分間回転します。より粗い抽出物が必要な場合は、遠心分離後5分間1000 RPMでスピンアップし、すりお酸をきれいなチューブに移して氷上に置きます。抽出物中のタンパク質の濃度は、その後、A BCAまたは類似のアッセイを用いて決定される。

このプロトコールで最も重要なステップは、抽出物中のタンパク質濃度を正確に測定して、適切な量の抽出物を凍結乾燥できるようにすることです。必要な量のタンパク質を与えるには、乾燥抽出物を凍結するには、まず必要な大量のタンパク質に従ってホモジネートを希釈し、アリコートをラベル付きの5ミリリットルの滅菌チューブに分注します。この例では、チューブあたり 100 マイクログラムのタンパク質が割り当てられています。

18〜20ゲージの滅菌針を使用して、各チューブのキャップに3つの穴を開け、ドライアイスの上に約10分間置いて凍結チューブを凍結し、凍結乾燥機のスイッチを入れ、摂氏マイナス100度まで平衡化させます。これには約30分かかります。凍結乾燥機の準備ができたら、チューブを凍結乾燥機に入れ、真空ポンプのスイッチを入れます。

抽出物の量にもよりますが、凍結乾燥は3時間以内に完了します。サンプルは日常的に一晩中放置されますが。乾燥サイクルが完了したら、真空ポンプのスイッチを切り、ゆっくりとチャンバー内に圧力を送ります。

滅菌フード内のチューブのラックを取り外します。穴あきキャップをチューブから取り外し、新しいキャップと交換します。チューブは摂氏マイナス20度で保管してください。

サンプルは、後で培養、培地、またはその他のバッファーに再溶解し、生化学的アッセイの機能に使用できます。この図は、脾臓アイレットの枯渇した膵臓組織、および精製されたヒトアイレットからの抽出物を充填したタンパク質ゲルの染色を示しています。これらの結果は、各組織について異なる分子量のタンパク質が良好に表現されていることを示しており、ヒトT細胞の増殖を刺激するアサナおよび膵島抽出物の能力は、末梢血単核細胞またはPBMCを抗原に応答して増殖し、その結果CFSE強度が低下する蛍光色素CFSE細胞をフローサイトメトリーで直接測定した増殖アッセイを使用してテストしました。

この例で使用されているPBMCは、1型糖尿病の個人から分離されました。C細胞応答の大きさは、抗原を含まない5,000 CD 4陽性CCF SE明るい細胞あたりのCFSE dim細胞の数と、抗原を含む4つの陽性CCF SE明るい細胞のCFSE薄暗い細胞の数の比として表されました。その結果、Asanaに応答して弱いながらも検出可能な増殖が見られ、細胞分裂指数またはCDIは3.5でした。

この手順に従って、CDIが6.8の不活化インフルエンザウイルスをポジティブコントロールとして含めたアイレット抽出物に対してより強い反応がありました。Ali Spotやe Izaなどの他の方法を使用して、組織由来の抗原に応答してどのサイトカインが分泌されるかなどの追加の質問に答えることができます。