Name: 隔離された心筋細胞の細胞機能に対する抗体の効果測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 42 s
Description: 学ぶ 拡張型心筋症患者のカルジオトロピック抗体検出法。ラット心筋細胞の収縮とカルシウム動態を測定し、患者IgGの影響を評価する機能的アッセイ技術です。

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心血管疾患における体液性免疫応答（ - この作品は、ドイツ学術振興協会（DFG）のSonderforschungsbereich Transregio 19（SFB/TR19、C2）は、経済技術プロジェクトZIM-KF 2727801MD0連邦省とイノベーションのコンピテンスセンターでサポートされていたZIK-ハイキング、教育研究、ドイツ連邦省BMBF FKZ 03Z2CN12）。動物とハウジングとの実験は、実験動物学（ゲゼルシャフトエリーゼのためVersuchstierkunde、GV-SOLAS条約）と欧州実験動物学協会（FELASA）連合学会の勧告に従って行われた。

1。患者サンプルからのIgGアイソ<ol><li>空のエコノパックカラムに2ミリリットル患者EDTA血漿当たり3ミリリットル抗IgGセファロースを充填することにより、ミニ免疫吸着カラムを準備します。 IgGの分離は、患者血漿の少なくとも2ミリリットルを必要とします。 </li><li>抗IgGセファロースの上にフィルターを置き、カラムの下部先端を開き、約1滴/秒の流速に到達するためにフィルタを押しカット。欄が不足する保存液してみましょう。 </li><li>プラズマの体積あたりの3倍量の0.9％NaClでカラムを洗浄する。 </li><li>カラム上でプラズマをピペット。プラズマは完全に抗IgGセファロースに浸漬した場合には、同じ体積の0.9％NaClで洗浄します。 </li><li>ピペットカラムに0.2MのグリシンHCl、pHが2.8の1血漿量とセファロースに浸すことができます。カラムにグリシンHClの別のボリュームを追加します。 15mlチューブ内を通る流れを収集し、0.5Mのトリス-HCl、pH 8.0で7.3にpHを調整する。 </li><li>列を再生成するには、3プラズマボリュームグリシンHClで洗浄してください。 2倍量の0.9％NaClで最終洗浄後、カラムは次の血漿試料に使用されるかもしれません。 ℃で4週間までに8 - あるいは、その列は保存液を充填し、4℃で保存することができます。 </li><li>心筋細胞上で使用するために、収集したIgG画分では、実験的なバッファ（EB）に対して透析しなければならない。 EBの調製のために、マグネチックスターラーで1リットルの蒸留水に117 mMのNaCl、2.8のKCl、0.6 mMのMgCl 2、1.2mMのKH 2 PO 4、1.2 mMのCaCl 2、10mMのHEPESおよび20mMグルコースを追加して、pHを調整7.3へ。 </li><li> 100kDaのカットオフ分子量を有するセルロースエステル透析膜チューブにIgG画分を埋める。 1LのEBにチューブを入れて、4℃でマグネチックスターラーでゆっくりかき混ぜる℃、 8時間後、新鮮なEBの3 Lに透析チューブに移し、4℃でさらに20時​​間透析℃、 </li><li>透析後、57℃で30分間inactivatする水浴中でCのために試料を加熱eの補体因子。総IgG濃度を決定し、330μgのIgGのそれぞれを含むアリコートを準備します。測定（ステップ4.3）のための心筋細胞にサンプルを追加するときは、EBで1mlにアリコートを埋める。原液アリコートをさらに使用するまで-20℃で保存することができます。 </li></ol> 2。ラット心筋細胞の単離<ol><li>のCa 2 +遊離、分離バッファ（IB）の調製のために、2.6のKCl、1.2mMのMgSO 4を 、1.2mMのKH 2 PO 4、20mMのHEPESおよび磁気を用いて1Lの蒸留水に11 mMグルコース、110 mM NaClを追加スターラー。滅菌のための0.2μmのボトルトップフィルターを通して室温とフィルターでpHを7.4に調整してください。 </li><li>サーモスタットランゲンドルフ灌流システムの上部貯水池で、IBの80ミリリットルを充填します。 37℃のバッファ温度を維持し、95％O 2/5％30分間、CO 2でバッファを通気するため、サーモスタットの設定値を調整します。 </li><li>約10,000の重量を量る - collag 12,000 Uをenase II型、175 mgの脂肪酸フリーBSAおよび100 mMのCaCl 2ストック溶液22.5μlを含む20ミリリットルIBに溶かす。上部貯水池の分離緩衝液のpHを制御し、必要に応じて調整します。 </li><li>チオペンタール375μg/ kg体重で200グラム - 175のWistarラットをAnaesthetize。チオペンタールソリューションに2500 IUのヘパリンを追加します。無傷の大動脈弓と慎重に開胸、心臓を切除した後、氷冷した0.9％のNaClにそれを転送します。血液からの心と周囲の組織と新鮮な0.9％のNaClへの転送を清掃してください。大動脈を露出させ、2-3/secの滴下速度を取得し、カニューレに心臓を添付するランゲンドルフシステムの流れの減速を開きます。 </li><li>最大3分までの残りの血を洗い流すために1滴/秒の流速を持つための心臓を灌流する。ランゲンドルフシステムで、IBを循環させるために起動します。 80ミリリットルに達するために必要に応じて上部貯水池から20mlのバッファーを外し、はるかにバッファとしてコラゲナーゼ溶液とリフィルに記入してください。 cを循環させる<html>別の27分間ollagenaseソリューションを提供します。流量が流れ減速機を使用して、1滴/秒で周期的に制御され、維持されるべきである。 </li><li>心房と大動脈からクリーンカニューレから心臓を、切り離し、小片に切り刻む。コラゲナーゼ溶液を下池に実行できるように、40ミリリットルの最大にボリュームを削減し、さらに10のために刻んだ心室を消化- 95％O 2/5％CO 2で連続曝気下に15分。その後、50 mlチューブに200μmのメッシュサイズのガーゼで細胞懸濁液をろ過する。 </li><li> 200μMのCaCl 2を含有する 10mlのIBの室温再懸濁した細胞で2分間43 xgで細胞懸濁液を遠心：3つのステップで細胞のCa 2 +のコンテンツを復元します。再び遠心分離し、500μMのCaCl 2を10ミリリットルIBに細胞を再懸濁する。最後の遠心分離の後、50,000細胞/ mlの密度に（1.8を参照）を滅菌濾過し、EBで心筋細胞を再懸濁します。 </li></ol>心筋細胞のe_title &quot;&gt; 3。のFura-2染色<ol><li>コー​​トウェルあたり10μgのラミニンとの4ウェルにチェンカバーガラスと、それが完全に乾燥するまで待ちます。 </li><li>よくカットチップ付きマイクロピペットを用いて各々に心筋細胞懸濁液1mlを埋める。細胞は室温で1時間付着することができます。 </li><li> 1 mg / mlののFura-2の10μlを希釈は、5mlのEBにおける原液AM。暗闇の中で染色液を保管してください。 </li><li>カバーガラスと各ウェルに染色液をピペット0.5ミリリットルからバッファと非付着細胞を脱ぐ。適度な揺れで10分間細胞をインキュベートします。続いて、染色液を脱いで1ミリリットルEBで一度細胞を洗浄し、最後に各ウェルに0.5 mlのEBを埋める。染色工程中に直接光を避け、常に暗闇の中で染色した細胞を保つ。 </li></ol> 4。細胞短縮とCa 2 +過渡の記録<ol><li>逆蛍光mにチャンバーカバーガラスを置きicroscopeは筋細胞のカルシウムと収縮記録システムに接続されています。よく最初の流入と流出管が付いているカスタムメイドの電極を配置します。 1ml /分のEBと電気刺激（20V、1Hzで、5ミリ秒の期間）を開始して心筋細胞を表面かん流する。細胞は約2分間刺激に適応することができます。 </li><li>明確なストライエーションと一定の収縮にそのまま棒状の心筋細胞を選択してください。視野の中央にあるセルを置き、カメラのチャンネルを開いてください。セルフレーミングアダプタを回転させ、顕微鏡ステージを移動することによって、ビデオ領域内で水平方向にセルを方向付ける。 </li><li>初期細胞短縮とCa 2 +の一過性を得るために15の収縮-エッジがビデオ領域の制御要素（ 図2）を検出調整、蛍光チャネルおよびレコード10を開きます。 </li><li>蛍光染色の漂白を避けるために顕微鏡光チャネルを閉じます。サンプルにEBから通る流れを切り替える3方弁と患者のIgG 1ミリリットルと表面かん流する心筋細胞でバイパスしてください。空気がよく達する直前にポンプを停止します。 </li><li>光チャネルを開き、別の10記録 - 急性細胞応答を得るために15の収縮を。録音を一時停止し、再び光チャネルを閉じます。 2と5分後に録画を繰り返します。 </li><li>井戸の電極を取り出します。 EBで徹底的に管をきれいにし、チャンバーカバーガラスの次のウェルに進みます。 </li><li>それぞれ細胞短縮とCa 2 + &quot;Edge-Length/Length&quot;を使用してIonWizardソフトウェアと過渡と&quot;フラ2数値は、/比を差し引いた&quot;ウィンドウを、分析します。初期細胞短縮とCa 2 +急性のベースライン（BL％ピーク時間）と呼ばれるピーク高さの過渡、2分、5分間応答からの変化率を計算します。 </li></ol>

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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

提示された方法は不明起源のDCM患者において、機能的に有効な心臓の自己抗体を検出するのに適した方法を提供しています。他の方法と比較して、cAMPレベル6への影響により、β1-アドレナリン受容体に対して機能アクティブ抗体の検出を、例えば 、我々の手法は、特定のエピトープとは無関係です。もちろん、文献に記載されている他のエピトープの独立したアッセイは、パッチクランプ法又は単離されたプルキンエ繊維14の収縮によって成体心筋細胞におけるカルシウム電流を測定する、 すなわち新生児心筋細胞13の拍動数を数えて、あります。これらの方法の利点は、ここで紹介する検定はそれほど時間がかかり、標準化されたプロトコルにより増加した客観性を提供します。さらに、それは同時に収縮と細胞内カルシウムトランジェントの影響を検出することができます。 OTに似て彼女のin vitroアッセイを 、提示された方法で得られた結果をセルに適用された人工的な条件によって挑戦することができる...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> Immunosorba保存液</td><td>フレゼニウスメディカルケア</td><td> 903609211 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼタイプ2 </td><td>細胞系</td><td> LS004176 </td><td></td></tr><tr><td> BSA、脂肪酸フリー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A6003 </td><td></td></tr><tr><td>ラミニン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> L2020 </td><td></td></tr><tr><td>のFura-2 AM </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> F0888 </td><td> DMSO中で1 mg / mlの</td></tr><tr><td>エコノパッククロマトグラフィーカラム</td><td> BioRad社</td><td> 732-1010 </td><td></td></tr><tr><td>スペクトラ/ポアバイオセルロースエステル透析MEMBRAN電子</td><td> Spectrumlabs </td><td> 131417 </td><td></td></tr><tr><td> 4ウェルチェンカバーガラス</td><td>ヌンク</td><td> 155383 </td><td></td></tr><tr><td>筋細胞のカルシウムと収縮レコーディングシステム</td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IonWizard 6.0解析ソフトウェア</td><td> IonOptix </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

隔離された心筋細胞の細胞機能に対する抗体の効果測定

Measurement of Antibody Effects on Cellular Function of Isolated Cardiomyocytes

拡張型心筋症（DCM）は、若年成人1で心不全のための主要な原因の一つです。有毒物質に対する遺伝的気質と博覧会は、患者の約3分の1で、この病気の原因を知られているが、DCMの起源は、主に不明なままである。これらの患者の相当数は、心臓エピトープに対する自己抗体が検出されており、2,3病の発症と進行に重要な役割を果たすことが疑われている。心筋自己抗体の重要性は、免疫吸着3月5日で自己抗体を除去した後、DCM患者において観察された血行動態の改善によって強調される。特定の種々の抗原は、すでに2,3同定されており、これらのターゲットに対する抗体は免疫アッセイによって検出することができる。しかし、これらのアッセイは、刺激（したがって、機能的に有効な）と自己抗体をブロッキングを区別することはできません。 evidenが高まっているこの区別は6,7重要であることをCE。またcardiotropic抗体の数のターゲットはまだ正体不明であるため、免疫アッセイでは検出できないことが想定される。したがって、我々はそれぞれの抗原とは独立し、機能的に活性なcardiotropic抗体の検出のための方法を確立した。法の背景には、通常哺乳類8,9間に心臓のタンパク質の機能領域について観測と高い相同性があります。これは、ヒト抗原に対する抗体が心臓になる成体ラットの心筋細胞のDCM患者からのIgGのテストを許可する非ヒト標的細胞と交差反応することを示唆している。本手法は3つのステップで構成されています：最初に、IgGは免疫吸着カラム（PlasmaSelect、テーテロー、ドイツ）から入手セファロース結合抗IgG抗体を用いて患者血漿から分離されています。第二に、成体心筋細胞は、APを使用してランゲンドルフ灌流装置にコラゲナーゼ灌流によって分離されているrotocolは、以前の作品から、10,11を変更しました 。得られた心筋細胞は容易に細胞内カルシウム（Ca 2 +）の内容12を観察するための細胞内に持ち込むことのできるカルシウム選択的蛍光色素、ラミニンコートチャンバーcoverglassesに取り付け、のFura-2で染色されています。最後のステップでは、細胞短縮とCa 2上の患者IgGの効果フィールドの+過渡刺激心筋細胞は、商業筋細胞のカルシウムと標準蛍光逆に接続されている収縮性監視システム（IonOptix、ミルトン、MA、USA）を使用してオンラインで監視されている顕微鏡。

フィールドでの携帯変力作用を測定するための二つの例は以下のとおりである筋細胞のCa 2 +および収縮記録システムを用いて成体心筋細胞を（ 図2）を刺激した。 図3は、制御測定の印象を与え、 図4の間cardiodepressive抗体の効果DCMを使用した患者の図が示されている。 どちらの例でも、初期の細胞短縮とCa 2 + EBで灌流時の過渡では分析のための前提条件である、明確かつ一定のピークを示す。我々は、細胞が7の範囲で初期BL％のピーク時間を示すことを経験から知っている - 私たちのアプリケーションに最適な14％のスーツを、低い、または高い初期収縮による心筋細胞は、しばしば細胞短縮のいわれのない変化を示す傾向がある。健常者から分離されたコントロールIgG、 すなわち IgG抗体を塗布した後、心筋の変力作用はuのまま全体の測定（ 図3A）を通じてnchanged。これとは対照的に、...

提示された方法は、細胞の短縮と分離したラットの心筋細胞の細胞内カルシウムトランジェントの隔離患者の免疫の影響を分析することで、にかかわらず、特定の抗原の、拡張型心筋症患者の血漿中で機能的な効果cardiotropic自己抗体を検出する方法を提供します。

拡張型心筋症（DCM）は、若年成人における心不全の主な原因の一つです1。遺伝的素因や毒性物質への曝露があるものの...

本実験の全体的な目的は、拡張型心筋症またはその他の自己免疫的背景を持つ心疾患患者の血漿中から、心向性抗体を検出することです。これは、まず患者の血漿をanti IgG spherosカラムでミニ免疫吸着させ、第2段階として免疫グロブリンGを精製することによって達成されます。このバイオアッセイの細胞基盤として、成体Wistarラットから心室心筋細胞を単離します。次に、心筋細胞をチャンバーのカバーガラスに接着させ、収縮時の細胞内カルシウム一過性変化を観察できるようにURA 2:00 AMで染色し、その後、患者のIgGを添加して心筋細胞の収縮能への影響を検証します。この結果から、単離した心筋細胞における収縮能とカルシウム一過性変化の変化に基づき、患者のIgGにトロピック抗体が含まれているかどうかが判定されます。抗体検出のための標準的な免疫測定法などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、特定の抗原に依存せず、刺激性抗体と遮断性抗体を区別できることです。この手順のデモンストレーションは、当研究室による技術支援を受けて行われます。この手順を開始するには、空のEconoPakカラムに、患者のEDTAプラズマ2 mLあたり3 mLのanti-IgG sphereを充填して、ミニ免疫吸収カラムを準備します。次に、anti-IgG sphereの上にフィルターを配置します。カラムの下端を切り開き、フィルターを押し込んで、流速が約1秒に1滴になるように調整します。次に、0.9%塩化ナトリウム溶液を1回分の血漿量で3回、カラムに流して洗浄します。血漿がanti IgG Spherosに完全に浸漬されたら、同量の0.9%塩化ナトリウムで洗浄します。続いて、pH 2.8の0.2 Mグリシン塩酸塩を1回分の血漿量でカラムに注入し、粒子に浸漬させます。次に、同量のグリシン塩酸塩をカラムに加えます。流出液を15 mLチューブに回収し、pH 8.0の0.5 M Tris-HClを用いてpHを7.3に調整し、カラムを再生させます。最後に0.9%塩化ナトリウムを2倍量で洗浄した後、グリシン塩酸塩を3プラズマ量で洗浄します。このカラムは、心筋細胞に使用する次の血漿サンプルのために再利用可能です。回収したIgG画分は、まず分子量カットオフが100 kilodaltonsのセルロースエステル透析膜チューブにIgG画分を満たし、実験用バッファー（EB）に対して透析する必要があります。次に、チューブを1 literのEBに入れ、4 °Cでマグネチックスターラーを用いてゆっくりと攪拌します。8時間後、透析チューブを3 litersの新しいEBに移し、4 °Cでさらに20時間透析を行います。サンプルをウォーターバスを用いて57 °Cで30分間煮沸します。補体因子を不活性化させるため、総IgG濃度を測定し、それぞれに330 µgのIgGを含む分注液を調製します。この手順では、付属の原稿に従ってカルシウムフリー分離バッファーを調製してください。次に、恒温ランノー灌流システムの側上部リザーバーにIBを80 milliliters充填し、バッファーを37 degrees Celsiusに保持し、95%oxygen、5%carbon dioxideで30分間エアレーションします。約7,000から10,000 unitsのコラゲナーゼ type twoと174 milligramsの脂肪酸フリーBSAを、112.5 micromolarの塩化カルシウムを含む20 millilitersのIBに溶解し、必要に応じて上部リザーバー内の分離バッファーのpHを調整します。次に、チオペンタール（375 µg/kg）を用いて体重175〜200 gのWistarラットを麻酔し、その際、チオペンタール溶液に2,500 IUのヘパリンを添加します。開胸後、大動脈弓を温存したまま慎重に心臓を摘出し、氷冷した0%塩化ナトリウム溶液に移します。心臓から血液および周囲の組織を取り除きます。次に、新鮮な0.9% sodium chlorideに移し、大動脈を露出させます。Langorシステムの流量調整器をオンにし、1秒間に2〜3滴の滴下速度に調整します。その後、心臓をカニューレに接続します。残存する血液を洗い流すため、1秒間に1滴の流速で最大3分間灌流します。その後、LORシステム内でIBを循環させます。次に、上部リザーバーから20 millilitersのバッファーを取り除きます。リザーバーにコラゲナーゼ溶液を満たし、80 millilitersになるまで必要な量の緩衝液を追加します。その後、消化液をさらに27分間循環させます。次に、カニューレから心臓を切り離します。心房と大動脈を取り除き、心室を細かく刻みます。消化バッファーを下部リザーバーに流し込みます。液量を最大40 millilitersまで減らし、95%oxygen、5%carbon dioxideで絶えず通気しながら、刻んだ心室をさらに10～15分間消化します。その後、細胞懸濁液を200 micronメッシュサイズのガーゼでろ過し、50 milliliterチューブに回収します。最後に、細胞懸濁液を40 3Gで2分間遠心分離し、細胞のカルシウム含量を回復させます。室温で、細胞を10 millilitersの溶液に再懸濁します。200 µM 塩化カルシウムを含むIBを再度遠心分離し、500 µM 塩化カルシウムを含む10 mLのIBに細胞を再懸濁します。最終遠心分離後、心筋細胞を滅菌ろ過済みのEBに再懸濁し、密度を50,000 cells/mLに調整します。4ウェルチャンバーのカバーガラスに、1ウェルあたり10 µgのラミニンをコートし、完全に乾燥するまで待ちます。次に、各ウェルに心筋細胞懸濁液を1 mLずつ注入します。チップの先端をカットしたマイクロピペットを用いて、室温で1時間、細胞を接着させます。1 mg/mLのfira 2:00 AMストック溶液10 µLを5 mLのebで希釈し、染色溶液を遮光して保存します。次に、カバーガラスからバッファーと未付着細胞を取り除き、染色液を0.5 millilitersピペットで分注します。各ウェルで、適度に振盪しながら細胞を10分間インキュベートします。その後、染色液を取り除き、1 milliliterのebで細胞を1回洗浄します。次に、この手順に従って各ウェルに0.5 millilitersのEBを加え、カバーガラスを心筋細胞のカルシウムおよび収縮能記録システムに接続された倒立蛍光顕微鏡下に配置します。流入チューブと流出チューブを備えた特注の電極を最初のウェルに設置し、1 milliliter per minuteのebで心筋細胞を灌流します。電気刺激を20 V、1 Hz、パルスあたり5 msの持続時間で開始し、約2分間、細胞を刺激に順応させます。横紋が明瞭で、一定の収縮を示す無傷の棒状心筋細胞を選択し、視野の中心に配置します。次に、カメラチャンネルを開き、細胞フレーミングアダプターの回転および顕微鏡ステージの移動によって、ビデオエリア内で細胞を水平に方向付けます。ビデオ領域の検出コントロール要素の境界を調整します。蛍光チャンネルをオンにし、10〜15回の収縮を記録して、初期の細胞短縮およびカルシウム・トランジェントを取得します。その後、蛍光染料の退色を防ぐため、顕微鏡の光源チャンネルをオフにします。3方弁を用いて、流路をEBからサンプルバイパスに切り替え、心筋細胞を1 mLの患者IgGで超融合させます。空気がウェルに到達する直前にポンプを停止し、ライトチャンネルをオンにして、さらに10〜15回の収縮を記録し、急性細胞応答を取得します。その後、記録を一時停止して再びライトチャンネルをオフにし、2分後と5分後に記録を繰り返します。記録が終了したら、ウェルから電極を抜きます。最後に、IonWizardソフトウェアを使用し、それぞれedge length/lengthおよびURA2 numeric subtracted/ratioウィンドウを用いて、細胞短縮とカルシウムトランジェントを解析します。次に、初期の細胞短縮およびカルシウムトランジェントのピーク高さに対する、急性、2分後、および5分後の反応のパーセント変化率を算出します。以下はコントロール測定の代表的な例です。細胞短縮とカルシウムトランジェントは、IgGの灌流前、およびIgG灌流直後、2分後、5分後にオンラインでモニタリングされました。ここでは、心抑制抗体を含むIgGサンプルの測定例を示します。細胞短縮とカルシウム過渡現象を、IgGの灌流前、および灌流直後、2分後、5分後にオンラインで測定しました。このビデオを視聴することで、単離した成人ラット心筋細胞の細胞短縮とカルシウム過渡現象に対する単離IgGの影響を測定し、患者血漿中の心抑制抗体を検出する方法について十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

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