隔離された心筋細胞の細胞機能に対する抗体の効果測定
March 8th, 2013
提示された方法は、細胞の短縮と分離したラットの心筋細胞の細胞内カルシウムトランジェントの隔離患者の免疫の影響を分析することで、にかかわらず、特定の抗原の、拡張型心筋症患者の血漿中で機能的な効果cardiotropic自己抗体を検出する方法を提供します。
次の実験の全体的な目標は、拡張型心筋症または自己免疫の背景を持つ他の心臓病の患者の血漿中の心電性抗体を検出することです。これは、第2ステップとして抗IgGスフェロスカラム上で患者血漿をミニ免疫吸収し、免疫グロブリンGを精製することで達成されます。心室心筋細胞は、このバイオアッセイの細胞基盤を提供する成体Wistarラットから単離されます。
次に、心筋細胞をチャンバーカバースリップに付着させ、収縮中の細胞内カルシウム一過性の観察を可能にするために、URA 2:00 AMで染色し、患者のIgGをテストして心筋細胞の収縮性への影響を観察します。この結果は、単離された心筋細胞の収縮性とカルシウム一過性の変化に基づいて、患者のIgGに向性抗体が含まれているかどうかを示しています。この手法が抗体検出のための標準的なイムノアッセイのような既存の方法と比較した場合の主な利点は、特定の抗原に依存せず、抗体の刺激とブロッキングを区別できることです。
Googleによる手順のデモンストレーションを行い、当研究室からの技術支援を体験します。この手順を開始するには、空のエコノパックカラムに2ミリリットルの患者EDTA血漿あたり3ミリリットルの抗IgGスフェロスを充填して、ミニ免疫吸収カラムを準備します。次に、抗IgGスフェロの上にフィルターを置きます。
カラムの下端を切り開き、フィルターを押して、毎秒約1滴の流量に達します。次に、血漿量0.9%塩化ナトリウムの1つの血漿量でカラムを3回洗浄し、血漿が抗IgGスフェロスに完全に浸されたら、カラム内の血漿をピペットでピペットで交換し、同量の0.9%塩化ナトリウムで洗浄します。次に、pH 2.8 の 0.2 モル塩酸グリシンの血漿容量 1 つをカラム内でピペットで移動し、リンに浸します。
次に、別の容量の塩酸グリシンをカラムに加えます。15 ミリリットルのチューブに流れを回収し、0.5 モルの塩酸トリス塩酸塩で pH を 7.3 に調整し、p pH 8.0 でカラムを再生します。0.9%塩化ナトリウムの2つの容量での最終洗浄後、3つの血漿容量の塩酸グリシンで洗浄します。
このカラムは、心筋細胞に使用する次の血漿サンプルに使用できます。採取したIgG画分は、まず分子量カットオフが100キロダルトンのセルロースエステル透析膜チューブにIgG画分を充填することにより、実験バッファーに対して透析する必要があります。次に、チューブを1リットルのEBに入れ、摂氏4度の磁気攪拌でゆっくりと攪拌します8時間後、透析チューブを3リットルの新鮮なEBに移し、透析後4°Cでさらに20時間透析します。
サンプルを57°Cの水浴で30分間煮沸します。補体因子を不活性化するには、総IgG濃度を決定し、それぞれに330マイクログラムのIgGを含むアリコートを調製します。この手順では、添付の原稿に従ってカルシウムフリー分離バッファーを調製します。
次に、サーモスタットラノール灌流システムの上部リザーバーに80ミリリットルのIBを満たし、バッファーを摂氏37度に維持し、95%の酸素、5%の二酸化炭素で30分間通気します。約7, 000〜10, 000ユニットのコラゲナーゼタイプ2および174ミリグラムの脂肪酸を含まないBSAを20ミリリットルに溶解します。IB は 112.5 マイクロモルの塩化カルシウムを含み、必要に応じて上部リザーバーの分離バッファーの pH を調整します。
次に、チオペンタール溶液に2,500IUのヘパリンを添加したチオペンタールを375マイクログラム/キログラムで使用して、175〜200グラムのウィスターラットに麻酔をかけます。開胸術後、無傷の大動脈弓で心臓を慎重に切除し、氷冷した氷冷塩化ナトリウムのゼロポイントパーセント塩化ナトリウムに移します。心臓から血液と周囲の組織を取り除きます。
次に、それを新鮮な0.9%塩化ナトリウムに移し、大動脈を露出させます。ランゴールシステムの流量減流装置をオンにして、毎秒2〜3の落下速度を取得します。次に、心臓をカニューレに取り付けます。
1秒に1滴の流量で最大3分間灌流し、残りの血液を洗い流します。その後、LORシステム内でIBを循環させます。次に、上部のリザーバーから20ミリリットルのバッファーを取り外します。
リザーバーにコラゲナーゼ溶液を充填し、80ミリリットルに達するまで必要な量のバッファーを補充します。次に、消化溶液をさらに27分間循環させます。次に、カニューレから心臓を取り外します。
心房と大動脈を取り出し、心室を細かく刻みます。消化バッファーが下部リザーバーに流れ込むのを待ちます。容量を最大40ミリリットルに減らして、95%酸素、5%二酸化炭素の連続曝気下で10〜15分間、刻んだ心室をさらに消化します。
その後、細胞懸濁液を200ミクロンのメッシュサイズのガーゼで50ミリリットルのチューブにろ過します。最後に、細胞懸濁液を40 3Gで2分間遠心分離することにより、細胞のカルシウム含有量を回復します。室温で、細胞を10ミリリットルに再懸濁します。
200マイクロモルの塩化カルシウムを含むIBを再度遠心分離し、細胞を10ミリリットルに再懸濁します。500マイクロモルの塩化カルシウムを含むIB。最終的な遠心分離の後、蘇生し、無菌ろ過されたEB中の心筋細胞を50, 000細胞/ミリリットルの密度で懸濁します。
カバーグラスを1ウェルあたり10マイクログラムのラミニンが入った4ウェルチャンバーにコーティングし、完全に乾くまで待ちます。次に、1ミリリットルの心筋細胞懸濁液を各ウェルに充填します。先端をカットしたマイクロピペットを使用し、細胞を室温で1時間接着させ、1ミリグラム/ミリグラムのフィラ2:00 AM原液10マイクロリットルを5ミリリットルのebで希釈し、染色溶液を暗所に保管します。
次に、バッファーと未付着の細胞をカバーグラスピペット0.5ミリリットルの染色溶液から取り出します。それぞれについて、適度な振とう下で細胞を10分間よくインキュベートします。続いて、染色液を除去し、細胞を1ミリリットルのebで1回洗浄します。
次に、この手順で各ウェルに0.5ミリリットルのEBを加え、カバーガラスを筋細胞カルシウムおよび収縮性記録システムに接続された逆蛍光顕微鏡の下に置きます。流入と流入チューブを備えたカスタムメイドの電極を最初のウェルとスーパーに配置します。心筋細胞を1分あたり1ミリリットルのebで融合させます。
パルスごとに20ボルト、1ヘルツ、5ミリ秒の持続時間で電気刺激を開始し、細胞が約2分間刺激に適応するのを待ちます。明確な縞模様と一定の収縮を持つ無傷の棒状の心筋細胞を選択し、視野の中心に配置します。次に、カメラチャンネルを開き、セルフレーミングアダプターを回転させ、顕微鏡ステージを動かして、セルをビデオエリア内で水平に向けます。
ビデオエリアの検出制御要素の境界を調整します。蛍光チャンネルをオンにし、10〜15回の収縮を記録して、初期の細胞短縮とカルシウム一過性を求めます。その後、蛍光染色の漂白を防ぐために、顕微鏡の光チャンネルをオフ
にしてください。EBからサンプルバイパスへの流れを三方弁で切り替え、1ミリリットルの患者IgGで心筋細胞をスーパー融合します。空気がに到達する直前にポンプを停止し、ライトチャネルをよくオンにし、さらに10〜15回の収縮を記録して急性細胞応答を取得します。その後、記録を一時停止し、ライトチャネルを再びオフにし、2分後と5分後に記録を繰り返し、最後に電極をウェルから引き出し、エッジ長スラッシュ長とURAの2つの数値減算スラッシュ比ウィンドウを使用して、イオンウィザードソフトウェアでセル短縮とカルシウム過渡を分析します。
次に、初期細胞短縮およびカルシウム過渡ピーク高さからの急性応答、2 分間応答、および 5 分間応答の変化率を計算します。制御測定の代表例をご紹介します。細胞短縮とカルシウムの過渡性を、IgGとの融合前とIgGとの融合の2分後と5分後にオンラインでモニターしました。
そして、これは心抑制抗体を含むIgGサンプルの測定例です。細胞短縮とカルシウムの過渡性は、IgGとの融合の超融合前と、IgGとの融合の直後の2分と5分後にオンラインで測定されました。このビデオを見れば、単離された成人の赤色心筋細胞のカルシウム一過性の細胞短縮に対する単離IgGの影響を測定することにより、患者の血漿中のカーディオトラフィック抗体を検出する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、拡張型心筋症患者の機能的有効な心臓特異的自己抗体を検出する方法を提示します。この技術は、分離した患者の免疫グロブリンが、分離したラットの心筋細胞の短縮と細胞内カルシウム暫定変化に与える影響を分析します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 心臓病学
- 免疫学
- 細胞生物学
背景
- 拡張型心筋症は自己免疫反応と関連しています。
- 心臓特異的抗体の検出は心臓病の理解に重要です。
- 既存の方法は多くの場合、特定の抗原に依存しています。
- 刺激性抗体と阻害性抗体を区別できる技術が必要とされています。
研究の目的
- 患者の血漿中の心臓特異的抗体を検出すること。
- 患者のIgGが心筋細胞の収縮性に与える影響を評価すること。
- 特定の抗原に依存しない方法を提供すること。
使用された方法
- 抗IgGスフェロスカラムの患者血漿のミニ免疫吸着。
- 成体のWistarラットからの心室心筋細胞の分離。
- 細胞内カルシウム暫定変化を観察するための心筋細胞の染色。
- 患者のIgGが心筋細胞の収縮性に与える影響の評価。
主要な結果
- 収縮性とカルシウム暫定変化の変化は、特異的抗体の存在を示します。
- この方法は異なるタイプの抗体を区別することに成功しました。
- 結果は、標準的な免疫アッセイよりもこの技術の有効性を示しています。
- 結果は心臓病における自己免疫メカニズムの理解に貢献しています。
結論
- 提示された方法は、心臓特異的抗体を検出するための信頼できるアプローチです。
- 拡張型心筋症における自己免疫反応の研究能力を向上させます。
- この技術は心臓病学における診断能力を向上させる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to detect functionally active cardiotropic antibodies in patient plasma without requiring prior antigen identification, addressing a key gap in autoimmune heart disease research. By measuring effects on cardiomyocyte contractility and calcium transients, it provides a functional readout that distinguishes stimulating from blocking autoantibodies, supporting target de-risking in early discovery. The antigen-independent approach enhances predictive confidence for therapeutic intervention strategies in dilated cardiomyopathy and related indications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting autoantibodies that directly modulate cardiomyocyte function.
- Operational Value: Provides a functional assay system independent of known antigens, expanding target space for autoimmune cardiology.
- Predictive Value: Discriminates between stimulating and blocking antibody effects, improving confidence in mechanism-based target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, real-time readouts of cell shortening and calcium transients for compound or antibody screening.
- Reproducibility: Standardized isolation and staining protocols support consistent cellular responses across experiments.
- Platform Utility: Establishes a reusable bioassay for evaluating immunomodulatory candidates in cardiovascular disease models.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses adult rat cardiomyocytes with high homology to human cardiac proteins, enhancing translational potential.
- Mechanistic De-risking: Links autoantibody presence to functional cellular outcomes, supporting causal inference in disease models.
- Preclinical Continuity: Enables longitudinal assessment of antibody effects on contractility and calcium handling in a disease-relevant system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing functional immunological insights that inform preclinical candidate selection in cardiovascular autoimmune research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking patient-derived IgG to measurable changes in cardiomyocyte physiology.
- Screening: Delivers quantitative, real-time measurements of contractility and calcium flux for evaluating immunomodulatory effects.
- Analytics: Enables statistical comparison of acute and time-dependent responses to IgG superfusion, supporting dose-response and kinetic profiling.
- Translational Research: Utilizes a disease-relevant cellular system with cross-species antigen homology, facilitating extrapolation to human pathophysiology.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized platform for screening immunomodulatory compounds or biologics in cardiovascular autoimmune contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into autoantibody-mediated cardiomyocyte dysfunction, reducing ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible functional readouts that minimize assay variability across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying functionally active autoantibodies early, reducing late-stage biological risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-stratified prioritization of targets based on antibody-mediated functional effects in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cardiomyocyte isolation, calcium imaging, and contractility monitoring systems.
- Dependent on Langendorff perfusion equipment, fluorescent microscopy, and ion/wizard-based analysis software.
- Necessitates cross-team standardization for IgG purification, cell preparation, and stimulation protocols.
- Adaptation to other model systems may require validation of antigen homology and cellular responsiveness.
- Practical limitations include tissue access, cell viability windows, and the need for specialized perfusion and imaging infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:51
IgG Isolation from Patient Samples
4:39
Isolation of Rat Cardiomyocytes
8:27
Fura-2 Staining of Cardiomyocytes
9:43
Recording of Cell Shortening and Ca2+ Transients
12:24
Results: The Measurement of an IgG Sample Containing Cardiodepressive Antibodies
13:15
Conclusion
