隔離された心筋細胞の細胞機能に対する抗体の効果測定

本実験の全体的な目的は、拡張性心筋症またはその他の自己免疫的背景を持つ心疾患患者の血漿中から心向性抗体を検出することである。これは、まず第2段階として免疫グロブリンGを精製するため、患者血漿を抗IgGスフェロスカラムでミニ免疫吸着させることで達成される。本バイオアッセイの細胞基盤として、成体Wistarラットから心室心筋細胞を単離する。

次に、心筋細胞をチャンバーのカバーガラスに接着させ、収縮時の細胞内カルシウム過渡現象を観察できるようにURA 2:00 AMで染色し、その後、患者のIgGを添加して心筋細胞の収縮能への影響を検討します。この結果から、単離した心筋細胞における収縮能およびカルシウム過渡現象の変化に基づき、患者のIgGに向性抗体が含まれているかどうかが判明します。抗体検出のための標準的な免疫測定法などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、特定の抗原に依存せず、刺激性抗体と遮断性抗体を区別できることです。

本手順のデモンストレーションは、当研究室の技術支援を受けて行われます。この手順を開始するには、空のEconopakカラムに、患者のEDTA血漿2 mLに対してanti IgG spheros 3 mLを充填し、ミニ免疫吸着カラムを準備します。次に、anti IgG spherosの上にフィルターを配置します。

カラムの下端を切り開き、フィルターを押し下げて、流速が約1秒に1滴になるように調整します。次に、0.9%塩化ナトリウム溶液を1プラズマ分量を用いて、カラムを3回洗浄します。プラズマがanti IgG Spherosに完全に浸った状態で、プラズマをピペットでカラム内に導入し、同量の0.9%塩化ナトリウム溶液で洗浄します。続いて、pH 2.8の0.2 molar グリシン塩酸塩を1プラズマ分量カラム内にピペットで導入し、粒子に浸透させます。

次に、グリシン塩酸塩をさらに1カラム容量分加えます。流出液を15 mLチューブに回収し、pH 8.0の0.5 M Tris-HClを用いてpHを7.3に調整し、カラムを再生させます。0.9%塩化ナトリウムを2容量分で最終洗浄した後、グリシン塩酸塩3プラズマ容量分で洗浄します。

このカラムは、心筋細胞に使用する次の血漿サンプルのために再利用可能です。回収したIgG画分を実験用バッファー（EB）に対して透析させる必要があります。まず、分画分子量100 kilodaltonsのセルロースエステル透析膜チューブにIgG画分を満たします。次に、チューブを1 literのEBに入れ、4 °Cでマグネチックスターラーを用いてゆっくりと撹拌します。8時間後、透析チューブを3 litersの新しいEBに移し、さらに4 °Cで20時間透析を行います。

サンプルをウォーターバスで57 °Cで30分間加熱します。補体因子を不活性化するため、総IgG濃度を測定し、それぞれ330 µgのIgGを含む分注液を調製します。この手順では、付属の論文に従ってカルシウムフリー分離バッファーを調製してください。

次に、恒温ランナー灌流システムの上のリザーバーにIBを80 milliliters充填し、バッファーを37 degrees Celsiusに維持して、95%oxygen、5%carbon dioxideで30分間エアレーションします。約7,000から10,000 unitsのcollagenase type twoと174 milligramsの脂肪酸フリーBSAを、112.5 micromolarのcalcium chlorideを含む20 millilitersのIBに溶解させ、必要に応じて上のリザーバー内にある分離バッファーのpHを調整します。

次に、チオペンタール（375 µg/kg）を用いて体重175～200 gのWistarラットを麻酔します。この際、チオペンタール溶液に2,500 IUのヘパリンを添加しておきます。開胸後、大動脈弓を温存したまま心臓を慎重に摘出し、氷冷した0% NaCl溶液（氷冷生理食塩水）に移します。その後、心臓から血液および周囲の組織を除去します。

次に、新鮮な0.9% sodium chlorideに移し、大動脈を露出させます。Langorシステムの流量調節器を操作し、滴下速度が毎秒2〜3滴になるように調整します。その後、心臓をカニューレに接続します。

残存する血液を洗い出すため、1秒に1滴の流速で最大3分間灌流します。その後、LORシステム内でIBを循環させます。次に、上部リザーバーから20 millilitersの緩衝液を除去します。

リザーバーにコラゲナーゼ溶液を満たし、合計で80 millilitersになるまで必要な量のバッファーを追加します。その後、消化液をさらに27分間循環させます。次に、カニューレから心臓を取り外します。

心房と大動脈を取り除き、心室を細かく切断します。消化バッファーを下部リザーバーに流します。液量を最大40 millilitersまで減らし、95%oxygen、5%carbon dioxideで連続的にエアレーションしながら、切断した心室をさらに10〜15分間消化させます。

その後、細胞懸濁液を200 micronのメッシュサイズのガーゼでろ過し、50 milliliterチューブに回収します。最後に、細胞懸濁液を40 3Gで2分間遠心分離し、細胞のカルシウム含量を回復させます。室温で、細胞を10 millilitersで再懸濁します。

200 µM 塩化カルシウムを含むIBを再度遠心分離し、10 mLで細胞を再懸濁します。次に500 µM 塩化カルシウムを含むIBを用います。最終遠心分離の後、心筋細胞を滅菌ろ過済みEBに再懸濁し、密度を50,000 cells/mLに調整します。

4ウェルチャンバーのカバーガラスに、1ウェルあたり10 µgのラミニンでコーティングし、完全に乾燥するまで待ちます。次に、各ウェルに心筋細胞懸濁液を1 mLずつ注入します。チップを切断したマイクロピペットを使用し、室温で1時間、細胞を接着させます。1 mg/mLのfira 2:00 AMストック溶液10 µLを5 mLのebで希釈し、染色液を遮光して保存します。

次に、カバーガラスから緩衝液と未付着細胞を除去し、染色液を0.5 mLピペットで分注します。各ウェルにおいて、緩やかに振盪しながら10分間細胞をインキュベートします。その後、染色液を除去し、1 mLのebで細胞を1回洗浄します。

次に、この手順に従って各ウェルに0.5 millilitersのEBを添加し、カバーガラスを心筋細胞のカルシウムおよび収縮能記録システムに接続された倒立蛍光顕微鏡下に配置します。流入および流出チューブを備えたカスタムメイドの電極を最初のウェルに設置し、1 milliliter per minuteのebで心筋細胞を灌流します。

電気刺激を20 V、1 Hz、パルス幅5 msで開始し、細胞を約2分間刺激に適応させます。横紋が明確で、一定の収縮を示す完全な棒状の心筋細胞を選択し、視野の中心に配置します。次にカメラチャンネルを開き、細胞フレーミングアダプターの回転および顕微鏡ステージの移動により、ビデオ領域内で細胞が水平になるよう調整します。

ビデオエリアの検出コントロール要素の境界を調整します。蛍光チャンネルをオンにし、10〜15回の収縮を記録して、初期の細胞短縮およびカルシウム・トランジェントを取得します。その後、蛍光染料の退色を防ぐために、顕微鏡の光源チャンネルをオフにします。

3方コックを用いて、流れをEBからサンプルバイパスに切り替え、心筋細胞に1 mLの患者IgGを注入します。空気がウェルに到達する直前にポンプを停止させ、光チャネルをオンにして、急性細胞応答を得るためにさらに10〜15回の収縮を記録します。その後、記録を一時停止して再度光チャネルをオフにし、2分後と5分後に記録を繰り返します。完了後、ウェルから電極を回収してください。最後に、IonWizardソフトウェアを用い、それぞれEdge Length/LengthおよびURA2 Numeric Subtracted/Ratioウィンドウを使用して、細胞短縮とカルシウムトランジェントを解析します。

次に、初期の細胞短縮およびカルシウム・トランジェントのピーク高さに対する、急性反応、2分後、および5分後の反応の変動率を算出します。以下に、コントロール測定の代表例を示します。細胞短縮およびカルシウム・トランジェントは、IgGによる還流前、およびIgG還流直後、2分後、5分後にオンラインでモニタリングされました。

ここでは、心抑制抗体を含むIgGサンプルの測定例を示します。細胞短縮およびカルシウムトランジェントを、IgGの還流前、およびIgG還流直後の2分後と5分後にオンラインで測定しました。このビデオを視聴することで、単離した成人ラット心筋細胞の細胞短縮およびカルシウムトランジェントにおける単離IgGの影響を測定し、患者血漿中の心抑制抗体を検出する方法について十分に理解できるはずです。