患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

循環腫瘍細胞は細胞のダメージを与えることなく癌患者の血液から分離されています。腫瘍細胞の単離は上皮マーカーに対する抗体に加えて、E-セレクチンの二分子表面を使用して行われます。ナノチューブのコーティングは、特に高い捕捉純度で得られた癌細胞の接着を促進する。

この手順の全体的な目標は、血液サンプルから生存可能な循環腫瘍細胞を分離することです。まず、アイソレーションマイクロチューブの調製から始め、次に血液サンプルからバフィーコートを分離します。次に、バフィーコートを機能化されたマイクロチューブデバイスを介して処理します。

マイクロチューブから捕捉した細胞を採取し、細胞の損傷を与えることなく流れるCTCを生体模倣する会場を模倣したデバイスを使用して培養を維持します。この技術は、臨床現場での機能性を提供し、個別化されたがん治療を開発します。主な利点は、これが一般的に入手可能な材料を使用する簡単な技術であり、血管で発生する天然の固形組織プロセスを再現することです。

コーネル大学の生物医学工学の准教授であるマイク・キングで、私の研究室の上級技術者であるジェフ・マディソンが手順を実演します。次のプロトコルは、単一のマイクロチューブデバイス、6.6%ハローサイトナノチューブ溶液の250マイクロリットルを超音波処理するためのものです。30秒間、冷水で溶液を呼び出します。

2回目の超音波処理の後、溶液をシリンジに引き込みます。0.45ミクロンのシリンジフィルターで溶液をろ過し、きれいなマイクロゴミチューブの渦流に入れます。ハロサイトナノチューブ溶液を定期的に

均質性を維持するために、50センチメートルの長さのマイクロリハンマイクロチューブのセクションを入手してください。マイクロチューブのインレットを斜めに切り、マイクロチューブの一方の端を小さなIDEXXアダプターピースに挿入し、シリンジ針をマイクロチューブのもう一方の端に挿入します。マイクロチューブを洗浄するには、マイクロチューブの開放端を70%エタノールに入れ、約50マイクロリットルのエタノールをシリンジに引き込んでマイクロチューブを満たし、マイクロチューブからエタノールをすすぎます。

シリンジに大量の蒸留水を吸い込みます。次に、シリンジをマイクロチューブから取り外し、シリンジを空にしてから、マイクロチューブに再度取り付けます。体積あたり0.02重量の50マイクロリットルを引き出します。

ポリオールリジンをマイクロチューブに入れ、室温で5分間インキュベートします。次に、100マイクロリットルのろ過されたナノチューブ溶液をマイクロチューブに引き込み、室温で3分間インキュベートします。ナノチューブ溶液を洗い流すには、マイクロチューブから100マイクロリットルの水を吸い込み、室温で一晩インキュベートし、マイクロチューブから50マイクロリットルのPBSを吸引し、続いて1ミリリットルあたり10マイクログラムの50マイクロリットルを吸い

プロテインG溶液を室温で90分間平衡化します。次に、5マイクログラム/ミリリットル、EセレクチンIgG、および50マイクログラム/ミリリットルの抗体溶液をマイクロチューブに50マイクロリットルを吸い込みます。室温で2時間インキュベートし、5%乳タンパク質で非特異的な細胞接着をブロックします。

次に、血液またはバフィーコートのサンプルが処理の準備が整うまで、PBSを室温でインキュベートし、マイクロチューブを細胞単離に使用します。50マイクロリットルのカルシウム飽和PBSを引き出して、ヘパリン化チューブ内のセレクチン分子を活性化します。リンパ球を分離するために、患者から10ミリリットルの血液サンプルを採取します。

10ミリリットルのフォルパック溶液を50ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。10ミリリットルの全血サンプル遠心分離機をGの2000倍で15分間、摂氏4度で、最小限の減速で穏やかに重ねます。次に、バフィーコート層を新しいチューブに移します。

バフィーコートをPBSで洗い、赤血球を遠心分離して横たわらせます。細胞ペレットを1ミリリットルのRBC溶解液に穏やかに再懸濁し、緩衝液を緩衝し、室温で10分間インキュベートします。次に、10ミリリットルを追加します。

PBSは穏やかに混合し、中心化によって細胞を口蓋にします。IDEXXアダプターを使用して、PBS plusで細胞を穏やかに再懸濁します。機能化されたマイクロチューブの一端を5ミリリットルのシリンジに取り付けます。

シリンジをシリンジポンプに挿入し、機能化されたマイクロチューブの開放端を細胞予防に沈めます。細胞懸濁液をマイクロチューブで処理し、結合していない細胞と緩く結合した細胞を除去します。マイクロチューブの開放端をPBSプラスを含むチューブに移します。

300マイクロリットルのPBSプラスをシリンジに引き込みます。次に、マイクロチューブの開放端をきれいなチューブに入れます。シリンジをマイクロチューブから外し、acuateが入ったシリンジを取り付け、acuateを優しく灌流してマイクロチューブを満たします。

室温で10分間インキュベートした後、1ミリリットルの増殖培地が入ったシリンジを取り付け、マイクロチューブを灌流して、廃液を適切な組織に回収します。培養プレートは培養に進みます。血中腫瘍細胞を単離した細胞は、乳がん患者と肺がん患者の血液サンプルから5日後に分離されました。

文化で。これらの調製物は、上皮細胞分子エピカンの染色に基づいてCTC捕捉について特徴付け、核捕捉純度は、捕捉細胞の総数に対するCT Cとして同定された細胞の割合として計算されました。この画像は、ドナーAおよびBから単離されたCTCの代表的な顕微鏡写真を示しています。培養に5日後、細胞をAlexa Fluor 4 88でEPAMについて蛍光染色しました。

核はDPI染色によって視覚化されました。この手順に続いて、生存可能なCTCと培養を使用して、薬剤感受性や細胞マーカー発現などの患者固有の情報を取得できます。ご覧いただきありがとうございます、そして幸運を祈ります。