Name: 患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶ 生存循環腫瘍細胞の分離法。E-セレクチンと抗体を用いた機能化マイクロチューブデバイスで、患者血液から損傷なくCTCを捕捉し、個別化がん治療への応用を可能にする技術です。

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説明する作業は、国立がん研究所から受賞番号U54CA143876介して微小環境＆転移にコーネルセンターによってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立がん研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。この作品は、さらに国立科学財団大学院研究フェローシップ（ADH）によって一部で賄われていた。

次のプロトコルは、単一のマイクロデバイスの製造のためのものです。 1。ハロイサイトナノチューブ溶液の調製<ol><li>超音波処理（10〜13 W（RMS））250μLハロイサイトナノチューブの溶液（水で6.6重量％）30秒。一度冷たい水と繰り返し超音波のクールなソリューションを提供します。再び冷却する。 </li><li>シリンジに超音波処理したソリューションを引く、きれいな微量遠心チューブに0.45μmのシリンジフィルター、およびフィルタソリューションを添付してください。均質性を維持するために、時折渦ソリューションを提供します。 </li></ol> 2。ハロイサイトナノチューブとマイクロチューブ内表面のコーティング<ol><li> 50センチメートルマイクロRenathane microtubingの長いセクション（300μmの内径、35.3μLの内部ボリューム）を取得します。対角でチューブの一方の端を切り取り、小さなIDEXアダプタ部分に挿入します。チューブのもう一方の端に3月10日CC 29G注射器の針を挿入します。 </li><li>マイクロチューブをきれいにするには、チューブの開放端（エンド配置アダプタ付き）70％エタノールにしてチューブを埋めるために注射器に約50μLのエタノールを描画します。 </li><li>注射器に蒸留水の寛大なボリュームを描画することにより、マイクロチューブのエタノールをすすぐ。 </li><li>マイクロチューブからシリンジを外します、注射器を空にし、マイクロチューブに再接続します。 </li><li>水の中のリジン0.02パーセントw / vのポリ-Lの溶液を調製します。マイクロチューブに50μLを描画し、室温（RT）で5分間座ってすることができます。 </li><li>マイクロチューブに100μLのろ過ナノチューブ溶液を描画し、室温で3分間インキュベートすることができます。 </li><li>ナノチューブ溶液をリンスするためにチューブを介して100μLの水を描画します。 RTで一晩、水で満たされた、座って被覆したマイクロチューブを許可します。 </li></ol> 3。細胞分離用マイクロチューブの調製<ol><li> 1Xダルベッコのリン酸塩の10μg/ mLのタンパク質Gの溶液を調製します（ - 7.2 PBS、pH7.0）で緩衝生理食塩水。マイクロチューブを介して50μLのPBSを描画してからの50μLを描くプロテイン-G溶液と室温で1.5時間インキュベートすることができます。 </li><li> 5μg/ mLのE-セレクチン-IgGとPBSで50μg/ mLの抗体（ほとんどの癌サンプル、抗PSMA前立腺癌サンプルの抗-EpcAM）を含む溶液を調製します。マイクロチューブにE-セレクチンと抗体溶液50μLを描き、室温で2時間インキュベートすることができます。 </li><li>非特異的な細胞接着は、5％乳タンパク質でブロックされています。 5％（w / v）を、PBS中の乳蛋白質の溶液を調製します。マイクロチューブに50μLの乳蛋白質溶液を描画し、室温で1時間インキュベートすることができます。 </li><li>チューブに50μLのPBSを描画し、血液やバフィコートサンプルを処理するための準備が整うまで室温で残す。 </li><li>前の絶縁のためのマイクロチューブを使用して、〜10分、セレクチン分子をアクティブにするのCa 2 +（ &quot;PBS +&quot;）で飽和された50μLのPBSを描画します。 </li></ol> 4。細胞分離用サンプルの調製<ol><li>患者からヘパリンに10 mLの血液を描画または取得チューブ。 </li><li> 50 mLの遠心チューブに10 mLの場所をFicoll-Paqueリンパ球分離液。フィコールの上にそっと層10 mlの全血がように血とフィコールを混在させないように。 </li><li> °C最小限の減速で4℃15分間2000X gで遠心分離します。 </li><li>新しいチューブにバフィーコート層と場所を削除します。 </li><li> PBSで洗浄バフィーコート（10分間230x gで遠心し、上清を捨てる）。 </li><li>静かに1 mLの赤血球溶解バッファーで細胞を再懸濁し、赤血球を溶解する室温で10分間インキュベートする。 </li><li> 10 mLのPBS、穏やかに混合し、10分間230x gで遠心分離を追加します。上清を捨て、ゆっくりと3から4 mLのPBS +でペレットを再懸濁します。 </li></ol> 5。細胞単離<ol><li> IDEXのアダプタを使用して5 mLシリンジに官能チューブの一方の端を取り付けます。 </li><li>シリンジポンプにシリンジを挿入します。 </li><li>水没セルサスペンシオに、官能チューブの開放端N。 </li><li> 1から4 ml /時間でチューブを介して細胞懸濁液を処理します。 </li><li> PBSを含むチューブにチューブの開放端を転送+とチューブから非結合と疎結合した細胞を除去するために0.016 mL / minでシリンジに300μLのPBS +を描画します。 </li><li>きれいなチューブにチューブの開放端に配置します。マイクロチューブからシリンジを取り外し、Accutaseとプレフィルドシリンジを接続します。そっと埋めるためにマイクロチューブに十分なAccutase（〜50μL）を灌流し、10分間室温でインキュベートすることができます。 </li><li>プレートよく扱わ組織培養に廃液収集し、マイクロチューブに増殖培地を1 mL（79％RPMI、20％FBS、1％ペニシリンストレプトマイシン）とプレフィルドシリンジと灌流を添付してください。 </li><li> 37℃で培養細胞℃、加湿条件の下で5％CO 2。 </li></ol> 6。代表的な結果この手法の目的は、癌患者の血液から生存癌細胞を単離することである。デバイスの成功に必要な検証、いくつかの方法では、文化の中でがん細胞を識別するために存在しています。我々は、無傷の細胞核（図2および3）を識別するためにDAPIに加えて、そのようなEpCAM（上皮細胞接着分子）またはPSMA（前立腺特異的膜抗原）などの上皮部分に対する抗体で培養中の細胞を染色することを選択しました。癌細胞の数は、このテクニックを使用してキャプチャ必ずしも出発試料にCTCの数の関数であり、患者のばらつきが高くなることがあります。 IV期のがんと診断された患者から採取したサンプルを処理する際に、我々は日常的に純度の血液のチューブあたり100〜500癌細胞、&gt; 50％をキャプチャします。直ちに分離後に、汚染白血球の大きい番号が存在する可能性があります。しかし、これらの番号は、最大5日間の培養培地中でのインキュベーション後に枯渇されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig1.jpg" /> <stロン&gt;図1。抗体媒介静的接着に続いセレクチンを介した転がりを示すCTCの分離のための官能チューブの模式図。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig2.jpg" /> 図2乳癌患者および肺癌患者から採取した血液サンプルからのCTCの分離の代表的なデータです。 EpCAM染色に基づいて積極的にCTCとして識別され、生存細胞の数は、固体のバーや左側の縦軸と捕捉された細胞の総数と比較して、CTCとして同定された細胞の割合に関係で表されているオープンのバーで表され、右側の縦軸上で測定。結果は、文化の中で五日後にされています。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4248/4248fig3.jpg" /> isolati〜5日以降の文化の中で、CTCの独立したドナー（AとB）から図3代表的な顕微鏡写真癌患者の血液サンプルから上に。細胞は、蛍光核（青）を可視化するためにAlexaFluor 488 EpCAM（緑）と4 &#39;,6-ジアミジノ-2 - フェニルインドール（DAPI）で染色した。

<ol><li>Allard, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+circulate+in+the+peripheral+blood+of+all+major+carcinomas+but+not+in+healthy+subjects+or+patients+with+nonmalignant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases.</a> Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).</li>
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</ol>

MRKはCellTraffix株式会社（ロチェスター、ニューヨーク州）の科学顧問である。

それはしばしば、新しいがん治療薬の発見の初期段階は、原発性癌細胞への不審な似ても似つかない癌細胞株は、まだ実験室での使用の容易さのために使用のままに利用する場合があります。主要なヒト癌細胞が早期に小説の研究で利用された場合は、新しいがん治療法の開発への研究が促進されるでしょう。 CTCは、癌細胞、血液中の彼らの存在のために、標準的な採血のしやすさの中で最も簡単にアクセスできるタイプです。さらに、循環腫瘍細胞が転移5,6の過程で必要なステップを表すので、新しい薬を標的とする疾患やユーティリティとの関連性は明らかである。 in vitroでの血液からCTCの分離は、その低濃度によって複雑にされています。百万ごとに白血球や赤血球億7あたり1つのオーダーで。唯一のFDA承認されたテクニックセルを含む、血液中のCTCを検出するための現在の方法の大部分は<html>検索（Veridex）、損傷または列挙を超えての使用を排除し、検出プロセスで細胞を破壊する。上記の方法は、細胞の生存を危うくするので、がんについての将来の臨床研究のためにドアを開きません。無傷の細胞の回復がこの技術の目標であるとして、それは細胞が特に血液分離のステップの間に、注意して扱われることが不可欠です。 そのような癌の種類などの重要な特性に応じて改善された収率を達成するために変更することができ、このシステムの調整可能なパラメータの数があります。上記の手順では、我々は前立腺癌のサンプルを処理する場合を除き、すべてのがんのタイプのCTC固有の抗体としてEpCAMを使用するように選ばれた、前記抗PSMAが使用されています。癌特異的抗体の更なる置換は確かに個々の患者のためにパフォーマンスを向上させるために使用することができます。また、セレクチンおよび抗体の濃度は、キャプチャ8を高めるために変更することができます。 &quot;&gt;デバイスの本質的な特徴は、表面にE-セレクチン分子の取り込みです。E-セレクチンは、通常、内皮細胞、炎症部位への高速移動白血球を募集するための関数の管腔表面に発現しています。流れる白血球を一時的にバインドするセレクチン分子、インテグリンによる内皮細胞への細胞のいずれか遅い方と強い結合を容易にし、低速回転動作が生じる。説得力のある実験的証拠は、CTCが同様のメカニズム9,10によって浸出することができた場合になりますが存在します。セレクチンを含めることもデバイスが大きい流量で運転することができ、それ以外の抗体11に結合することから細胞を妨げる率は。従って、私たちのデバイスは、生理的にbiomimetically細胞傷害を負わせずにCTCを流れるキャプチャするために静脈を模倣しています。 エンハンスド·デバイスのパフォーマンスは、管腔表面にハロイサイトナノチューブコーティングの添加に起因することができますデバイスの。以前の研究では改良された機能を可能にするナノチューブコーティングの3つの主要コンポーネントがあることが示されている。最初に、ナノチューブのコーティングは、表面4の上に大きなタンパク質の沈着を考慮して、増加した表面積を提供します。第二に、ナノチューブのコーティングに原子間力顕微鏡を実行する際に我々は個々のナノチューブは、フローに表面から突出していることが決定した。これは、細胞が管4を介してキャプチャされ、以前の彼らの軌跡の表面に補充できるように、セレクチン分子が表面に上記のように多くの一つとして、ミクロンを提示することができます。最後に、ハロイサイトナノチューブのコーティングは、白血球の接着とCTC、したがってより大きな後続CTC純度3と共にキャプチャされた白血球の数を減らすことを可能にし、表面上の拡散を防止することができる。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 300 UM IDチューブ</td><td>トリーサイエンティフィック</td><td> MRE025 </td></tr><tr><td>シリンジに接続するための大きなチューブ</td><td> IDEXヘルス＆サイエンス</td><td> 1507L </td></tr><tr><td>ポンプの5mLのシリンジ</td><td> BD </td><td> 309603 </td></tr><tr><td>大型チューブに小さなコネクタ</td><td> IDEXヘルス＆サイエンス</td><td> P-770 </td></tr><tr><td>注射器のコネクタ大型チューブ</td><td> IDEXヘルス＆サイエンス</td><td> F-120とP-659 </td></tr><tr><td>マイクロシリンジ（3/10ccインスリン注射器U-100 29G 1/2 &quot;） </td><td> BD </td><td> 309301 </td></tr><tr><td> Accutase </td><td> MPバイオメディカルLLC </td><td> 1000449 </td></tr><tr><td> Ficol X線不透過性のプラス</td><td> GEヒールthcareバイオサイエンスAB </td><td> 17-1440-03 </td></tr><tr><td> RBC溶解バッファ（buffer EL、1000mlに） </td><td>キアゲン</td><td> 1014614 </td></tr><tr><td>プロテインG、5 mgの</td><td>カルビオケム（calbiochem.com） </td><td> 539303 </td></tr><tr><td>人間EpCAM/TROP-1抗体</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> MAB960 </td></tr><tr><td> PSMA抗体（GCP-04） </td><td>アブカム</td><td> ab66911 </td></tr><tr><td> 96ウェルプレート（マイクロテスト96） </td><td> BDファルコン</td><td> 35から3072 </td></tr><tr><td>ブロッティンググレードブロ​​ッカー脱脂粉乳、300グラム</td><td>バイオ·ラッドラボラトリーズ</td><td> 216005508 </td></tr><tr><td>ハロイサイトナノチューブ</td><td> NaturalNanoの</td><td> NN-HNT200 </td></tr><tr><td>炭酸カルシウム、5グラム</td><td>アルドリッチ化学</td><td> 481807 </td></tr><tr><td> rhE-Selectin/Fcキメラ、100μgの</td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 724-ES </td></tr><tr><td> RPMI培地1640 </td><td>ギブコ</td><td> 22400-089 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td>ギブコ</td><td> 14190-095 </td></tr><tr><td>水のポリ-Lリジン0.1％w / vの</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P8920-100ML </td></tr><tr><td>ソニックDismembrator </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td>モデル100 </td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>アトランタの生化学</td><td> S11056H </td></tr><tr><td>ペニシリンストレプトマイシン</td><td>シグマライフSiiences </td><td> P0781 </td></tr></tbody></table>

患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

Rapid Isolation of Viable Circulating Tumor Cells from Patient Blood Samples

循環腫瘍細胞（CTC）、循環器系全体に原発腫瘍から普及し、最終的に遠隔サイトでの二次腫瘍を形成することができる細胞である。 CTC数が血液や疾患の重症度1のCTC濃度との相関関係に基づいて疾患の進行を追跡するために使うことができます。治療ツールとして、CTCは、パーソナライズされた治療法を開発するために実験室で研究することができます。この目的のために、CTCの分離がなく細胞の損傷、特に他の細胞型、白血球による汚染を引き起こしてはならない、できるだけ2として避けなければならない。 CTCの列挙のための唯一のFDA承認されたデバイスを含めて、現在の技術の多くは、（詳細については、文献[2]を参照してください）​​分離プロセスの一環としてCTCを破壊する。実行可能なCTCをキャプチャするためのマイクロ流体デバイスは、上皮マーカ3に対する抗体に加えて、E-セレクチン糖タンパク質で官能面で構成され、説明されています。デバイスの性能を向上させるマンスナノ粒子コーティングは、ハロイサイトナノチューブから成る粘土4から収穫アルミノケイ酸塩ナノ粒子を適用した。 E-セレクチン分子は、別のマイクロ流体デバイス上の利点は、より長い処理時間は、表面と相互作用するのに十分な時間と標的細胞を提供するために必要である請求貸す、デバイスを介してポンピングされる動きの速いCTCをキャプチャするための手段を提供します。上皮のターゲットに対する抗体は、デバイスにCTC特異性を提供するとともに、分離を調整するために容易に調整可能なパラメータを提供しています。最後に、ハロイサイトナノチューブのコーティングはタンパク質吸着のために表面積の増加を提供し、大幅に強化されたアイソレーションは動きの速い細胞をキャプチャするために支援することで、他の技術に比べて可能にし、混入白血球の3,4を撃退。このデバイスは、既製の材料を使って簡単な手法によって生成され、正常に転移の血液からがん細胞を捕捉するために使用されていますがんの患者さん。キャプチャされた細胞は、分離後に文化の中で、最大15日間維持し、これらのサンプルは、通常、各患者からの&gt; 50％可能な主要な癌細胞で構成されています。さこのデバイスは、希薄化後の全血およびバフィーコートサンプルの両方から可能なCTCをキャプチャするために使用されています。最終的に、私たちはパーソナライズされた癌治療を開発するために臨床の現場で機能を持つ手法を提示します。

循環腫瘍細胞は細胞のダメージを与えることなく癌患者の血液から分離されています。腫瘍細胞の単離は上皮マーカーに対する抗体に加えて、E-セレクチンの二分子表面を使用して行われます。ナノチューブのコーティングは、特に高い捕捉純度で得られた癌細胞の接着を促進する。

循環腫瘍細胞（CTC）は、原発腫瘍から血行系を通じて全身に播種し、最終的に二次的な...

この手順の全体的な目的は、血液サンプルから生存可能な循環腫瘍細胞を単離することです。まず単離用マイクロチューブを準備し、次に血液サンプルからバフィーコートを単離します。続いて、機能化されたマイクロチューブデバイスを用いてバフィーコートを処理します。マイクロチューブから捕捉した細胞を回収し、細胞に損傷を与えることなく血流中のCTCをバイオミメティックに捕捉するための生理的環境を模倣したデバイスを用いて、培養を維持します。この手法は、臨床現場において個別化がん治療を開発するための機能を提供します。主な利点は、汎用的な材料を使用する簡便な手法であること、および血管内で起こる天然の固形組織プロセスを再現できることです。私はコーネル大学で生物医学工学の准教授を務めているマイク・キングです。手順の実演は、私の研究室のシニアテクニシャンであるジェフ・マディソンが行います。以下のプロトコールは、単一のマイクロチューブデバイスの作製に関するものです。6.6% Halo site ナノチューブ溶液 250 µL を30秒間ソニケーションし、溶液を冷水で冷却します。2回目の超音波処理の後、溶液をシリンジに吸い込みます。0.45 micronのシリンジフィルターを用いて、溶液を清潔なマイクロ遠心チューブにろ過します。ナノチューブ溶液を定期的にボルテックスします。均一性を維持するため、50 centimeterの長さのmicro rehanマイクロチューブを用意します。マイクロチューブの入口を斜めにカットし、マイクロチューブの一端を小さなIDEXXアダプターに挿入し、もう一端に注射針を挿入します。マイクロチューブを洗浄するには、マイクロチューブの開放端を70%ethanolに浸し、約50 microlitersのethanolをシリンジで吸引してマイクロチューブを満たし、ethanolで内部を洗浄します。十分な量の蒸留水をシリンジに吸い込みます。次に、シリンジをマイクロチューブから外し、中身を空にしてから、再びマイクロチューブに取り付けます。0.02 weight per volumeを50 µL吸い込みます。ポリオールリシンをマイクロチューブに入れ、室温で5分間インキュベートします。次に、ろ過したナノチューブ溶液100 µLをマイクロチューブに吸引し、室温で3分間インキュベートします。ナノチューブ溶液を洗い流すため、100 µLの水をマイクロチューブに通して室温で一晩インキュベートし、続いて50 µLのPBSをマイクロチューブに通し、さらに10 µg/mLの溶液50 µLを通します。Protein G溶液を室温で90分間平衡化させます。次に、5 µg/mLのE selectin IgGおよび50 µg/mLの抗体溶液を50 µLずつマイクロチューブに分注します。室温で2時間インキュベートし、5%脱脂粉乳（milk protein）で細胞の非特異的吸着をブロックします。次に、細胞分離にマイクロチューブを使用する10分前までに、血液またはバフィーコート検体の処理準備が整うまで、PBSを室温でインキュベートします。ヘパリン入りチューブ内でセレクチン分子を活性化させるため、カルシウム飽和PBSを50 µL分取します。リンパ球分離のため、患者から10 mLの血液検体を採取します。10 mLのfol pack溶液を50 mL遠心チューブに入れます。10 mL全血試料を静かに上層に重ね、4 °Cで2000 ×gにて15分間、減速を最小限にして遠心分離します。次に、バフィーコート層を新しいチューブに回収します。バフィーコートをPBSで洗浄し、遠心分離して赤血球を沈殿させます。細胞ペレットを1 mLのRBC溶血バッファーで緩やかに再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。その後、10 mLを添加します。PBSを穏やかに混ぜ、遠心分離によって細胞をペレット化します。IDEXXアダプターを用いて、細胞をPBSプラスに穏やかに再懸濁します。機能化されたマイクロチューブの一端を5 mLシリンジに取り付けます。シリンジをシリンジポンプに装着し、機能化されたマイクロチューブの開口端を細胞懸濁液に浸します。細胞懸濁液をマイクロチューブに通し、非結合細胞および緩く結合した細胞を除去します。その後、マイクロチューブの開口端をPBSプラスを含むチューブに移動させます。300 µLのPBSをシリンジに吸い込みます。次に、マイクロチューブの開口端をきれいなチューブに入れます。シリンジをマイクロチューブから外し、acuateを含むシリンジを取り付け、acuateをゆっくりと灌流してマイクロチューブを満たします。室温で10分間インキュベートした後、1 mLの成長培地を含むシリンジを装着し、マイクロチューブに灌流させ、流出液を適切な組織培養プレートに回収して培養に進みます。分離された循環腫瘍細胞は、乳がん患者および肺がん患者の血液サンプルから5日後に分離されました。培養において。これらの調製物は、上皮細胞分子であるepicanの染色に基づいてCTC捕捉能を評価し、さらに核捕捉純度を、捕捉された全細胞数に対するCTCとして同定された細胞の割合として算出した。この画像は、ドナーAおよびBから単離されたCTCの代表的な顕微鏡写真である。培養5日後、細胞をAlexa Fluor 488を用いてEPAMで蛍光染色した。核はDPI染色により可視化しました。この手順の後、生存しているCTCおよびその培養物を、薬剤感受性や細胞マーカーの発現など、患者固有の情報を得るために使用できます。ご視聴ありがとうございました。それでは、研究の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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本稿では、全血から無細胞DNAや循環腫瘍細胞などの物質を簡便かつ効率的に分離・回収するための自動化装置の適用について述べる。...

臨床検体からのがん関連物質の自動分離・回収

臨床用マイクロ流体チップは、臨床患者の血液サンプルの前処理を簡素化し、チップ上でその 場...

汎用性の高い循環腫瘍細胞を単離するための臨床用マイクロ流体チッププラットフォーム

マイクロ流体ベースのハイスループット循環腫瘍細胞選別およびシングルセルシーケンシング技術

学ぶ 生存循環腫瘍細胞の分離法。E-セレクチンと抗体を用いた機能化マイクロチューブデバイスで、患者血液から損傷なくCTCを捕捉し、個別化がん治療への応用を可能にする技術です。

患者の血液サンプルから生存循環腫瘍細胞の急速な分離

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