Name: パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 学ぶパッチクランプ電気生理学と圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能の測定法。ラット腸間膜動脈を用いて、イオンチャネル活性と血管反応の関連を解明する。

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この作品は、アメリカ心臓協会（09PRE2260209）とBKMへアーサー·J·シュミット財団からの国立心臓、肺、血液研究所（NIH R01-HL089564）からKLBと事前博士フェローシップの助成金によって賄われていた。

<ol><li>Passmore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KCNQ%2FM+Currents+in+Sensory+Neurons%3A+Significance+for+Pain+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">KCNQ/M Currents in Sensory Neurons: Significance for Pain Therapy.</a> J. Neurosci. 23, 7227-7236 (2003).</li>
<li>Falloon, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+small+artery+sensitivity+and+morphology+in+pressurized+and+wire-mounted+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of small artery sensitivity and morphology in pressurized and wire-mounted preparations.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 268, H670-H678 (1995).</li>
<li>Dunn, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+resistance+artery+sensitivity+to+agonists+under+isobaric+compared+with+isometric+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Enhanced resistance artery sensitivity to agonists under isobaric compared with isometric conditions.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 266, H147-H155 (1994).</li>
<li>Buus, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+sensitivity+of+rat+mesenteric+small+arteries+to+agonists+when+studied+as+ring+preparations+or+as+cannulated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differences in sensitivity of rat mesenteric small arteries to agonists when studied as ring preparations or as cannulated preparations.</a> Br. J. Pharmacol. 112, 579-587 (1994).</li>
<li>Abdelhalim, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+big+endothelin-1+in+comparison+with+endothelin-1+on+the+microvascular+blood+flow+velocity+and+diameter+of+rat+mesentery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc.+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of big endothelin-1 in comparison with endothelin-1 on the microvascular blood flow velocity and diameter of rat mesentery in vivo.</a> Microvasc. Res. 72, 108-112 (2006).</li>
<li>Altura, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-response+relationships+for+arginine+vasopressin+and+synthetic+analogs+on+three+types+of+rat+blood+vessels%3A+possible+evidence+for+regional+differences+in+vasopressin+receptor+sites+within+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Dose-response relationships for arginine vasopressin and synthetic analogs on three types of rat blood vessels: possible evidence for regional differences in vasopressin receptor sites within a mammal.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 193, 413-423 (1975).</li>
<li>Henderson, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin-induced+vasoconstriction%3A+two+concentration-dependent+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vasopressin-induced vasoconstriction: two concentration-dependent signaling pathways.</a> J. Appl. Physiol. 102, 1402-1409 (2007).</li>
<li>Mackie, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+KCNQ+potassium+channels+as+novel+targets+for+the+control+of+mesenteric+artery+constriction+by+vasopressin%2C+based+on+studies+in+single+cells%2C+pressurized+arteries%2C+and+in+vivo+measurements+of+mesenteric+vascular+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Vascular KCNQ potassium channels as novel targets for the control of mesenteric artery constriction by vasopressin, based on studies in single cells, pressurized arteries, and in vivo measurements of mesenteric vascular resistance.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 325, 475-483 (2008).</li>
<li>Brueggemann, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+selective+cyclooxygenase-2+inhibitors+on+vascular+smooth+muscle+ion+channels+may+account+for+differences+in+cardiovascular+risk+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential effects of selective cyclooxygenase-2 inhibitors on vascular smooth muscle ion channels may account for differences in cardiovascular risk profiles.</a> Mol. Pharmacol. 76, 1053-1061 (2009).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Patch+Clamp+Technique%22">Patch Clamp Technique</a>. Kaneez, F. S. , Intech. (2012).</li>
<li>Berra-Romani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TTX-sensitive+voltage-gated+Na%2B+channels+are+expressed+in+mesenteric+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">TTX-sensitive voltage-gated Na+ channels are expressed in mesenteric artery smooth muscle cells.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 289, H137-H145 (2005).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここに記載される方法および実験的アプローチが非常に強固であり、細部にまで細心の注意を払って適用されたときに明確かつ再現性のある結果を生成することができます。良い電気生理学的記録及び狭窄/動脈セグメントの拡張は、それぞれ細胞と動脈セグメントの健康に依存しています。細胞調製も同じプロトコルを使用して、日ごとに変化することができる。アイソレーションソリューションは2週間までに使用することができますが、細胞調製の質が2後件日に低ければ新しいアイソレーション·ソリューションを用意する必要があります。我々は、酵素活性が酵素のそれぞれの新しいバッチで最適化を必要とするバッチ間、したがって分離条件（インキュベーションの時間や酵素の濃度）に変わることを発見した。我々はまた、ラット腸間膜動脈のためにここで説明細胞単離プロトコルが異なるミックスや歯を持っているかもしれない他の血管床や他の種のために最適ではないことを発見した細胞外マトリックス成分のITY。各血管の準備が健康的な細胞を作り出す条件を識別するために、独自の最適化を必要とします。私たちは健康な細胞を同定する際に最も役に立ちする基準は次のとおりである：1）細胞形態：2に転送するとき+、</s...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td>注釈</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S5886 </td><td>解剖ソリューション：145 電気生理学のための浴溶液*：140 電気生理学のための内部溶液：10 筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：140 圧力筋運動記録法のための浴溶液：145 圧力筋運動記録法のルーメン液：145 </td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td> P5405 </td><td>解剖ソリューション：4.7 電気生理学のための浴溶液*：5.36 電気生理学のための内部溶液：135 筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：5.36 圧力筋運動記録法のための浴溶液：4.7 圧力筋運動記録法のルーメン液：4.7 </td></tr><tr><td>カリウムのEGTA </td><td>シグマ</td><td> E4378 </td><td>電気生理学のための内部溶液：0.05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td>シグマ</td><td> H9136 </td><td>電気生理学のための浴溶液*：10 電気生理学のための内部溶液：10 筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：10 </td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>シグマ</td><td> S5136 </td><td>筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：0.34 </td></tr><tr><td>リン酸水素カリウム</td><td>シグマ</td><td> P5655 </td><td>筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：0.44 </td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シグマ</td><td> M2393 </td><td>電気生理学のための浴溶液*：1.2 電気生理学のための内部溶液：1 筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：1.2 </td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><tD&gt; C7902 </td><td>電気生理学のための浴溶液*：2 筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：0.05 </td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP331-1 </td><td>解剖ソリューション：1.2 圧力筋運動記録法のための浴溶液：1.2 圧力筋運動記録法のルーメン液：1.2 </td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>シグマ</td><td> M2643 </td><td>解剖ソリューション：1.17 圧力筋運動記録法のための浴溶液：1.17 圧力筋運動記録法のルーメン液：1.17 </td></tr><tr><td> MOPS </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP308 </td><td>解剖ソリューション：3 圧力筋運動記録法のための浴溶液：3 圧力筋運動記録法のルーメン液：3 </td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>シグマ</td><td> P4562 </td><td> 2：ソリューションを解剖する 用浴溶液圧力筋運動記録法：2 圧力筋運動記録法のルーメン液：2 </td></tr><tr><td> EDTA二水和物</td><td>リサーチ·オーガニック</td><td> 9572E </td><td>解剖ソリューション：0.02 圧力筋運動記録法のための浴溶液：0.02 圧力筋運動記録法のルーメン液：0.02 </td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td>シグマ</td><td> G7021 </td><td>解剖ソリューション：5 電気生理学のための浴溶液*：10 電気生理学のための内部溶液：20 筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：10 圧力筋運動記録法のための浴溶液：5 圧力筋運動記録法のルーメン液：5 </td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td> A3912 </td><td>解剖解決策：1％ 圧力筋運動記録法のルーメン液：1％ </td></tr><tr><td> pHは</td><td></td><td></td><td> Solutioを解剖するN：7.4 電気生理学のための浴溶液*：7.3 電気生理学用の内部液：7.2 筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：7.2 圧力筋運動記録法のための浴溶液：7.4 圧力筋運動記録法のルーメン液：7.4 </td></tr><tr><td>オスモル濃度</td><td></td><td></td><td>解剖ソリューション：300 電気生理学のための浴溶液*：298 電気生理学用の内部液：298 筋細胞用アイソレーション·ソリューション*：298 圧力筋運動記録法のための浴溶液：300 圧力筋運動記録法のルーメン液：300 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 11 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1実験に用いたソリューションのコンポーネント。 </td></tr></tbody></table>

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋kv7カリウムチャネル機能を探る

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

抵抗動脈の壁内の平滑筋細胞の収縮や弛緩が動脈径を決定して、それによって血管を通る血液の流れを制御し、全身血圧に貢献しています。収縮過程は主に順番にイオントランスポーターやチャネルの多様によって制御され細胞質カルシウム濃度（[Ca 2 +] cytの）によって規制されています。イオンチャネルは、血管収縮または血管拡張をもたらすために血管作動性ホルモンによって活性化されるシグナル伝達経路における共通の中間体である。とイオンチャネルはしばしば故意治療薬または意図せずに（不要な心血管系の副作用を誘発するなど ）（ 例えば 、カルシウムチャネル遮断薬は血管拡張と低血圧を誘発するために使用）が対象とされています。 KV7（KCNQ）電圧活性化カリウムチャネルは、最近の重要な生理学的および治療ターグとして関与している平滑筋収縮を調節するためのETS。両方の生理学的信号伝達において、治療薬の作用でKV7チャネルの特定の役割を解明するために、我々は、彼らの活動をそのまま動脈のコンテキストでの貢献を評価するだけでなく、細胞レベルで変調されているかを研究する必要があります。 ラット腸間膜動脈は、有用なモデル系を提供する。動脈は簡単に、解剖し、結合組織を除去し、パッチクランプ電気生理学のために隔離動脈筋細胞を調製するために使用される、またはカニューレを挿入し、相対的に生理的条件下での血管収縮剤/血管拡張反応の測定に加圧することができる。ここでは、測定値の両方のタイプのために使用するメソッドを記述し、実験的なデザインは血管緊張の調節におけるこれらのイオンチャネルの役割の明確な理解を提供するために統合することができる方法のいくつかの例を提供します。

収縮/拡張器応答の測定と並行して孤立した動脈筋細胞（電気生理学的手法をクランプするパッチを使用）（圧力筋運動記録法を用いて）でKV7（KCNQ）カリウムチャネル活性の測定は、血管平滑筋生理学でKV7チャネルの役割に関する重要な情報を明らかにすることができますし、薬理学。

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

抵抗動脈の壁内にある平滑筋細胞の収縮または弛緩が、動脈径を決定し、それによって...の流れを制御する。

本手順の全体的な目的は、新鮮に解離させた腸間膜動脈平滑筋細胞におけるKV7カリウムチャネルの活性を測定し、それを生理的条件下で記録した動脈径の測定値と関連付けることです。これは、まずラットから腸間膜血管弓を外科的に摘出することで行います。次のステップでは、腸間膜動脈のセグメントを解剖し、洗浄します。次に、一部のセグメントを用いて個々の平滑筋細胞を単離し、KV7カリウム電流のパッチクランプ電気生理学的測定を行います。最終ステップでは、無傷の動脈セグメントにカニューレを挿入し、KV7カリウムチャネルの薬理学的モジュレーターに対する動脈の収縮または拡張のプレッシャーマイオグラフィ測定を行います。最終的に、パッチクランプ電気生理学とプレッシャーマイオグラフィを組み合わせることで、KV7カリウムチャネルの活性の増減が腸間膜動脈の収縮にどのように影響するかを明らかにします。細胞株で発現させたクローンチャネルを用いる既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、チャネルを天然に発現している非培養細胞から電流を記録できること、および、同一細胞内で活性化される可能性のある他のクラスのカリウムチャネルからKV電流を分離できることです。圧力マイオグラフィーを用いることで、単離細胞の由来となる同一組織から機能的反応を記録することができ、また、動脈リングや動脈ストリップなどの他の標本よりも感度が高く、より生理的な条件下での測定が可能です。私の研究室の博士研究員であるBareth Mani博士が動脈カニュレーションおよび圧力マイオグラフィーの技術を、研究助教のLuba Brueggeman博士が細胞単離およびパッチクランプの手順を実演します。この手順を開始するには、外科用ハサミを使用して、ラットの小腸の両端から10〜12cmのセグメントを切り出します。次に、付随する血管とともに小腸を分離します。その後、小腸のセグメントをピンで固定します。腸間膜をチャンバーの手前側に広げ、上腸間膜動脈の一次枝が中心に位置し、それに続く次数的な分枝が中心から放射状に広がるように配置します。次に、照明付き解剖顕微鏡で観察しながら、腸管セグメントのみにピンを刺して固定します。マイクロピンセットとハサミを用いて、腸管に近い二次から四次までの動脈周囲の脂肪組織および結合組織を慎重に取り除きます。隣接する静脈を保持することで、脂肪組織や結合組織の除去を容易にし、動脈への不必要な牽引を防ぎます。次に、腸間膜動脈のセグメントを2〜3本、2 mLの氷冷した単離液 containing 35 mmの組織培養ディッシュに移します。その後、ディッシュを氷上に置き、火炎滅菌したチップを装着したパステールピペットを用いて、腸間膜動脈のセグメントを3〜4 mmの長さに切断します。動脈セグメントを、37 °Cに予熱した2 mLの単離液を含

exploring-arterial-smooth-muscle-kv7-potassium-channel-function-using

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JoVE Journal

Biology

生物学

BKチャネルのイオン電流をパッチクランプ技術を使用して記録されます。...

イオンチャネル研究のためのパッチクランプおよび灌流のテクニックで表さアフリカツメガエル卵母細胞

KVチャネル機能不全は、心臓不整脈に関連付けられています。我々はKvをチャネルの補助サブユニットのノックアウトマウスからの心房と心室の心筋細胞を単離するための体系的なプロトコルを利用するような不整脈を引き起こす分子メカニズムを研究するために。隔離された心筋細胞は、その後すぐに携帯電気生理学的研究、生化学的または免疫蛍光法（IF）のアッセイのために使用することができます。...

マウス心房と心室の心筋細胞における分離とKvチャンネル録音

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

圧力筋運動記録法は、加圧されたときに、持続収縮を開発する小動脈の血管作用を評価するために使用されます。この原稿は、ラット、血管作用と血管径の管腔内圧力の影響から小腸間膜動脈の単離されたセグメントに評価するための詳細なプロトコルを提供します。...

圧力筋運動記録法を用いた抵抗腸間膜動脈における筋原性応答および血管作用を評価します

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。...

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

本稿では、電気生理学的、カルシウム...

Ex Vivo細胞生理学研究のため網膜細動脈の隔離

この記事の主な目的は、マイクロ電極衝撃法を用いて中大脳動脈から膜電位(V...

中大脳動脈から膜電位を記録する微小電極浸入法

本プロトコルは、マウス大動脈内皮機能の実験的 ex vivo...

テンソメトリック小容量チャンバーミオグラフィを用いたマウス胸部大動脈の内皮依存性血管弛緩の測定

本プロトコルは、全細胞パッチクランプ技術を使用して、H9c2心筋細胞における電位依存性カリウム(Kv)チャネル電流をリアルタイムかつ動的に取得するための効率的な方法を記載しています。...

全細胞パッチクランプ法 による H9c2心筋細胞の電位依存性カリウム電流記録

このプロトコルは、ラット脳底動脈から平滑筋細胞を分離し、全細胞パッチクランプ技術を使用してこれらの細胞の内部整流カリウムチャネル電流を記録するための迅速かつ効率的な方法を説明しています。これは、脳底動脈とイオンチャネルを研究する研究者に新しいアプローチを提供します。...

パッチクランプ法による新たに分離された脳底動脈平滑筋細胞における内向き整流K + 電流の記録

学ぶパッチクランプ電気生理学と圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能の測定法。ラット腸間膜動脈を用いて、イオンチャネル活性と血管反応の関連を解明する。

パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

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