パッチクランプ電気生理学および圧力筋運動記録法を用いた動脈平滑筋KV7カリウムチャネル機能を探る

本手順の全体的な目的は、新鮮に解離させた腸間膜動脈平滑筋細胞におけるKV7カリウムチャネルの活性を測定し、それを生理的条件下で記録した動脈径の測定値と関連付けることです。これは、まずラットから腸間膜血管弓を外科的に摘出することで行います。次のステップでは、腸間膜動脈のセグメントを解剖し、洗浄します。

次に、一部のセグメントを用いて個々の平滑筋細胞を単離し、KV7カリウム電流のパッチクランプ電気生理学的測定を行います。最終ステップでは、無傷の動脈セグメントにカニューレを挿入し、KV7カリウムチャネルの薬理学的モジュレーターに対する動脈の収縮または拡張のプレッシャーマイオグラフィ測定を行います。最終的に、パッチクランプ電気生理学とプレッシャーマイオグラフィを組み合わせることで、KV7カリウムチャネルの活性の増減が腸間膜動脈の収縮にどのように影響するかを明らかにします。

細胞株で発現させたクローンチャネルを用いる既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、チャネルを天然に発現している非培養細胞から電流を記録できること、および、同一細胞内で活性化される可能性のある他のクラスのカリウムチャネルからKV電流を分離できることです。圧力マイオグラフィーを用いることで、単離細胞の由来となる同一組織から機能的反応を記録することができ、また、動脈リングや動脈ストリップなどの他の標本よりも感度が高く、より生理的な条件下での測定が可能です。私の研究室の博士研究員であるBareth Mani博士が動脈カニュレーションおよび圧力マイオグラフィーの技術を、研究助教のLuba Brueggeman博士が細胞単離およびパッチクランプの手順を実演します。

この手順を開始するには、外科用ハサミを使用して、ラットの小腸の両端から10〜12cmのセグメントを切り出します。次に、付随する血管とともに小腸を分離します。その後、小腸のセグメントをピンで固定します。

腸間膜をチャンバーの手前側に広げ、上腸間膜動脈の一次枝が中心に位置し、それに続く次数的な分枝が中心から放射状に広がるように配置します。次に、照明付き解剖顕微鏡で観察しながら、腸管セグメントのみにピンを刺して固定します。マイクロピンセットとハサミを用いて、腸管に近い二次から四次までの動脈周囲の脂肪組織および結合組織を慎重に取り除きます。

隣接する静脈を保持することで、脂肪組織や結合組織の除去を容易にし、動脈への不必要な牽引を防ぎます。次に、腸間膜動脈のセグメントを2〜3本、2 mLの氷冷した単離液 containing 35 mmの組織培養ディッシュに移します。その後、ディッシュを氷上に置き、火炎滅菌したチップを装着したパステールピペットを用いて、腸間膜動脈のセグメントを3〜4 mmの長さに切断します。

動脈セグメントを、37 °Cに予熱した2 mLの単離液を含むガラスバイアルに移します。次に、37 °Cで30分間インキュベートします。30分後、パステールピペットを用いて37 °Cの単離液を慎重に吸引します。

温めた酵素溶液を2 mL加え、37 °Cで35分間インキュベートします。酵素溶液での35分間のインキュベーション直後、バイアルを氷上に置き、酵素溶液を吸引して、氷冷した単離溶液を2 mL加えます。この手順を4回繰り返します。

次に、1 mLの氷冷した単離溶液中で、研磨済みの後方ピペットを用いて動脈セグメントをゆっくりと10〜20回反復的にピペッティングし、個々の腸間膜動脈平滑筋細胞を遊離させます。細胞懸濁液を1滴 35 mmディッシュに滴下し、顕微鏡下で観察することで、心筋細胞の外観を定期的に確認してください。

健康なMA SMCsは、滑らかで伸長した外観を示すはずです。次に、研磨したパスチャピペットを用いて、約100〜200 µLの細胞懸濁液を記録チャンバーに移し、15分間細胞を接着させます。このステップで、パッチピペットの先端を内部溶液に浸し、アンフォテリシンBを含まない内部溶液でピペット先端を満たします。

次に、チューブで接続した10 mLシリンジを用いて反対側から吸引し、上部からpipette solutionを含むterin Bを注入します。micro loader pipette tipを使用して、ピペットの約半分まで溶液を満たしてください。ピペットを軽く叩いて、気泡を完全に取り除きます。

その後、ピペットを電極ホルダーに挿入します。マイクロマニピュレーターを使用して、ピペットを伸展した心筋細胞の表面まで降ろします。ピペットの抵抗値が6〜10 MΩに上昇したら、吸引をかけてギガシールを形成します。

同時に、膜穿孔を待つ間、保持電位を0 millivoltsに設定します。次に、+10 millivoltsおよび-10 millivoltsへの100 millisecondの電位ステップを適用します。アンプを使用して、ホールセル容量の出現と同時に生じる高速なピペット容量過渡応答を補正します。

2から10 pAの持続的な過渡的正電流が検出され、その振幅が示された場合、機能的なKV7チャネルが存在することを意味します。アンフォテリシンBによる穿孔が成功すると、アクセス抵抗は35 MΩ以下まで低下します。KV7電流の電圧・電流関係を記録するため、KV7チャネルの開口確率が最小となる-84 mVから、開口確率がプラトーに達する+16 mVまでの範囲で、5秒間の電圧ステップを適用します。各テスト電圧での5秒間の後、保持電圧である-4 mVに戻して10秒間保持します。

この手順では、あらかじめ準備した細いナイロン縫合糸2本を両側に緩く吊り下げます。解剖室から圧力筋移植チャンバーへ、マイクロピンセットで腸間膜動脈セグメントの一端を保持しながら、ガラスカニューレに沿って慎重に移動させます。次に、照明付き解剖顕微鏡で視認しながら、動脈セグメントの一端を保持し、左側のガラスカニューレ上へゆっくりとスライドさせます。

ナイロン縫合糸を使用して末端を固定します。次に、装着した血管内に緩やかに液体を流し込み、血液や残渣を除去します。その後、左側のシリンジへのバルブを閉じ、この側が静止液柱となるようにします。これにより、右側から圧力を調整することが可能になります。マイクロマニピュレーターを使用して、可動式の右側ガラスカニューレを動脈セグメントに近づけ、セグメントの右端をその上に引き寄せます。

最後に、ナイロン縫合糸で動脈セグメントを固定し、余分な縫合糸をクリップで切り取ります。次に、圧力マイクログラフ顕微鏡上のステージに圧力グラフユニットを設置します。圧力カラムをグラフチャンバーの右側に接続し、チャンバーにカバーを被せます。

10 mLシリンジを15分かけて徐々に上昇させ、P1圧力トランスデューサーが80 mmHgを示すまで、血管に漏れがないかを確認します。必要に応じてカニューレ間の距離を調整してください。この際、加圧された動脈セグメントがほぼ直線状になり、結紮部位でショルダーのような形状になるように調整します。60 mM塩化カリウムを30秒間一時的に灌流し、固定した血管の生存能を確認します。生存している血管は、塩化カリウムの添加により速やかに収縮し、洗浄後すぐに拡張します。

次に、濃縮した試験物質をバス溶液に添加します。チャンバーの端付近でピペットを用いて緩やかに吸い出しと注入を繰り返して試験物質をバス溶液に混ぜ合わせ、10 milliliterのチャンバー内で適切な最終濃度にします。試験物質の添加に伴う容器径の体積変化は、ライブビデオ画像でモニターできるほか、実験中に画像解析ウィンドウでチャート化することも可能です。この図は、単一の腸間膜動脈心筋細胞において、処理前の電圧ステップに対する一連の電流トレース（黒色）と、100 nanomolarのzinc perion存在下で安定化した後の電流トレース（赤色）を示しています。これらは、コントロールと100 nanomolarのzinc perionにおける代表的な電流値です。

グレーのバーは、平均電流振幅を測定した時間間隔を示しています。電流-電圧プロットにおいて、ステップ電圧は右側の矢印で示されています。これは、-20 mVの連続電位固定法で測定した、100 nMの亜鉛イオンによるKV7電流の増強の時間経過を示しています。ここでは、100 nMの亜鉛イオンによる処理前、処理中、および10 µMのKV7チャネル遮断薬XC 991による処理中に記録されたKV7電流密度から得られた平均電流-電圧曲線を示しています。100 pMのアルギニン・バソプレシンで事前収縮させた腸間膜動脈の、亜鉛イオン誘発性の弛緩を示しています。

この図は、100 pMのアルギニンバソプレシンを投与し、続いて100 nMの亜鉛イオンを投与した際の、血管外径の変化の経時的経過を示しています。このビデオを視聴することで、単一細胞の分離や、動脈収縮および拡張反応の圧力ミオグラフィー測定に向けた動脈の調製方法について、十分に理解できるはずです。さらに、新鮮に分離した動脈筋細胞において、他の電流から独立してKV 7電流を記録する方法についても習得できるでしょう。