Name: 電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶマウス筋芽細胞前駆細胞を用いた工学骨格筋組織の作製法。電気刺激による収縮誘導と蛍光染色を用いたサルコメア構造の解析手法を解説。再生医療や培養肉開発への応用可能性を示す。

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著者らは、培養するために図2に示す組織をYabin呉に感謝したいと思います、画像はバートバンOverbeekeによって撮影されました。仕事は財政的にSenterNovem、助成金、ISO 42022によってサポートされていました。

1。マウス筋芽細胞前駆細胞またはC2C12筋細胞の培養<ol><li>当初Sheferら10によって発行されて、後でCollins ら 11とBoonenはら 12によって適応プロトコルに従って細胞を分離し、液体窒素中でこれらを格納します。これは、C57BL / 6 例えば 、マウスを必要とします。代替方法は、 例えばLi Y らによって可視化実験誌に発表された方法では、他のラボで使用されています13。試薬や機器の入力は7ページと8ページの表を参照されます。 1マウスの筋からは、一般的に、液体窒素で約20バイアルを凍結保存するのに十分な細胞を得ることができます。次に、我々は、液体窒素貯蔵から細胞を解凍するためのプロトコルを起動します。 </li><li> 25cm 2のマトリゲル（1 mg / ml）でコーティングされた組織培養フラスコに1バイアルから細胞を入れて、から成る増殖培地（GM）（335ミリリットルDMEM高度、100ミリリットル胎児bovinを追加電子血清（FBS）、50ミリリットルのHS、5 mlのペニシリン/ストレプトマイシン、5ミリリットルのL-グルタミン、5mlのニワトリ胚エキス（CEE））。 </li></ol> 注：室温で2時間コートと吸引によってマトリゲルを削除します。 <ol start="3"><li> 3日ごとに細胞が約1:3サブカル。 これが意味する：3日目：1 75cm 2フラスコから2 150センチメートル2フラスコ（非コートフラスコでpreplating 30分付）への通路細胞：6日目に75cm 2フラスコに1 25cm 2のからの継代細胞。 1トリプル150センチメートル2フラスコに9日目の転送1 150センチメートル2フラスコに、または3 150センチメートル2フラスコ（必要に応じてpreplateが再び細胞の表現型に依存します）が利用できない場合。 12日目に細胞が筋肉構築物中に播種するための準備が整いました。 </li></ol> 注意： -トリプル150センチメートル2当たりの細胞数が約4.5×10 6個の細胞になります。 - を介して使用してください播種時の細胞の混合集団を得るためにそれらをミックスするための別のアイソレーションからのLS。 注：初代培養細胞で機能しないことを選択した場合、C2C12筋芽細胞は良い代替手段です。 2。エンジニアリング骨格筋組織<ol><li> &quot;硬化剤&quot;（10:1）を持つ &quot;エラストマー&quot;を混合することにより、シリコン接着剤を準備します。 1三角形の辺（; 図1形状の家のような）とマジックテープの5mm角のセグメント+ / -をカットします。正方形の間に約12mmのスペースで6ウェル培養プレートのウェルに接着剤ベルクロ。 </li></ol> 注： -のみベルクロのソフト面を使用し、この面を上に直面しています。 - 屋根がお互いに直面していることを確認してください。 - のみシリコン接着剤でマジックテープをカバーする、うまく全体に接着剤が広がらない。 - 後で電気刺激のためには、よくPLの垂直方向に構造物を揃えるために関連しています（長軸に沿って）食べました。 <ol start="2"><li>気泡を除去するために主に、加熱されていない、真空オーブンで一晩乾燥させるままにしておきます。 15分間インキュベートしたウェルに70％エタノールを添加することにより滅菌する。 PBSで3回リンスし、15分間UV下で置く。ウェルと使用するまでインキュベーター内ベルクロと場所からすべてのPBSを除去。 </li><li>冷蔵庫にマトリゲルソリューションを解凍し、まもなく3D構造物を作る前に所望の濃度にコラーゲン溶液を調製します。無菌の0.02パーセント酢酸（最終濃度3.2 mg / ml）を持つ株式コラーゲンを希釈します。 </li></ol> 注：氷の上のすべてのものを残す。 <ol start="4"><li> GMとカウントに再懸濁した細胞を、トリプシン処理。インキュベーター内で遠心分離チューブに細胞を残す。 </li><li>淡いピンクのcoloまで、このコラーゲン溶液に0.5M NaOHを加えるには、チューブ（ 表1によると）にしたい構造物の番号については、コラーゲン原液の所望量を追加rは7.5のpHを示す情報である。とを上下にピペッティングにより穏やかに混合し、バブルが形成されるのを防ぐ。その後、マトリゲルを追加し、優しく、しかし、非常に徹底的に混ぜる。最後に、コラーゲン/マトリゲル混合物（適切な量については表1を参照）にGMを追加します。 </li></ol> 注意： -氷の上に各ステップを実行します！マトリゲルおよびコラーゲンは温度の上昇で容易にゲルだろう。 - 色は確かにピンクであることを覚えて！ pHの上昇はまた急激なゲル化を誘導する。 - コラーゲンの最終濃度：1.6 mg / mlである。 <ol start="6"><li> 5分間1,000 rpmで細胞の所望量を遠心し、上清を除去する。 </li></ol> 注 -構築あたりの細胞数を調整する必要がある細胞の活性に応じて。一般的に、細胞数は、構築物75万の間と125万細胞に位置しています。 <ol start="7"><li>細胞ペレットを再懸濁するためにゲル混合物の一部を使用そして、残りの混合物中に細胞を移し、よく混ぜますが、気泡を導入することなく。 </li><li>インキュベーターとピペットベルクロ第一に、セルゲル混合物の0.35 -0.4 mlの予熱ウェルプレートを取り出します。次に、結合部位間の中心から混合物をピペットとベルクロに拡張し始める。最後に、ベルクロ部分の周りに2つのベルクロアンカーとピペットとの間のギャップを埋めるためにゲルの残りの部分を使用しています。 </li><li>ゲルが転送されるのに十分な固体であれば慎重に5〜10分後にチェック、 すなわち優しく料理をタップして、ゲルが剛体であれば視覚的に検査する。もしそうであれば、慎重にインキュベーターに皿を置きます。通常、それらは10分後にピックアップすることができます。その後、1〜2時間後に、優しく温かみのあるGMの4mlで各ゲルを重ねます。 </li></ol> 注：-DOプレートを取り扱う際には、任意の活発な動きをしない。 <ol start="10"><li> （増殖培地分化培地でGMを置き換える24時間後）ニワトリ胚エキスを伴うものではなく、2〜3日毎に新鮮な培地と交換してください。 7日目には、溶融筋線維に横紋開発のための染色を評価することができるように、成熟した指向の筋繊維を取得している必要があります。 </li></ol> 3。電気的な刺激<ol><li>安全キャビネット内の紫外線の下で、70％エタノール、続いて乾いた、使用前（試薬や機器の表を参照）ionoptixプレートから電極を滅菌する。コンストラクトを培養プレート上に電極とプレートを置き、培養プレートインキュベーターへの転送から蓋で覆う。適切なケーブルを使用して、C-Ionoptixペーサーを接続します。 </li></ol> 注：電極は筋肉コンストラクト（ 図2）と一緒に平行に配置されている。 <ol start="2"><li>予想通り刺激プロトコルを適用します。 </li></ol> 注：我々は、一般的に、4 V / CMを使用する2Hzの周波数で6msのパルス。刺激中に培地ごとに24時間を変更します。

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
<li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li>
<li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells%3A+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li>
<li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+der+Schaft%2C+D+%22Tissue+Eng.+Part+A%22">Tissue Eng. Part A</a>. , (2011).</li>
<li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li>
<li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche%3A+optimizing+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li>
<li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol%3A+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li>
<li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li>
<li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , In revision (2013).</li>
<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もない。

筋肉組織のエンジニアリングは、疾患モデルとして、薬剤スクリーニングのために、再生医療及び食肉生産のために使用するための大きな可能性を秘めている。ただし、これらのアプリケーションのための要件は異なります。コラーゲンは、細胞整列を可能にするため、および以前の2Dの研究12で決定された筋芽細胞の前駆細胞が基底膜由来タンパク質の存在を必要とするため、我々は、コラーゲンやマトリゲルの組み合わせを利用することを選んだ。また、フィブリンゲルは、我々の研究室でテストされ、コラーゲンやマトリゲル™の混合物がないと、特にティッシュコンパクション14につながらないようにしたC2C12筋芽細胞と前駆細胞をサポートしていないように思われてきた。セルライン15を使用している間、ここに説明されているようにモデルが褥瘡の損傷の研究ですでに使用されています。再生医療のアプリケーションでは、人間の衛星細胞への変換は最近6,16を行われている。加えて、肉の消費のための代替ソースとして技術は大きな可能性1を持って<...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>マトリゲル-成長因子低減</td><td>ベクトン·ディッキンソンと</td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM（高グルコース）* </td><td>ギブコ</td><td> 42430 </td><td></td></tr><tr><td>アドバンストDMEM </td><td>ギブコ</td><td> 12491 </td><td></td></tr><tr><td>ウマ血清</td><td>ギブコ</td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>グライナー</td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0.45及び0.22μmのシリンジフィルター* </td><td>ワットマン（シュライヒャーとScheull） </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>ギブコ</td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tR&gt; <td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td>アンフォテリシン</td><td>ギブコ</td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td>培養プラスチック</td><td>グライナー</td><td></td><td>培養フラスコとピペットを含む</td></tr><tr><td>ニワトリ胚エキス</td><td>米国生物</td><td> C3500から</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット* </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> - 1,1ミリメートル0,9の先端径は230ミリメートル：綿、開口先端Lとくびれのあるパスツールピペット、、 </td></tr><tr><td>パスツールピペット* </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td>綿、開口先端Lとくびれとパスツールピペット、、：1,4の先端直径が230ミリメートル - 1.6ミリメートル</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型* </td><td>シグマ</td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> 40μmのセルストレーナー* </td><td> BDファルコン</td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 19G針</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>エラストマー</td><td>ダウコーニングコーポレーション</td><td> 3097358-1004 </td><td>シラスティックMDXの＃4から4210 </td></tr><tr><td>硬化剤</td><td>ダウコーニングコーポレーション</td><td></td><td>シラスティックMDXの＃4から4210 </td></tr><tr><td>ベルクロ</td><td>正規店</td><td></td><td>あなただけのソフト面を使用し、正規の店でこれを購入することができます</td></tr><tr><td> I型コラーゲン、ラットの尾</td><td> BD Biosciences社</td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> C-PACE EP文化ペーサー</td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気刺激のための6ウェル培養皿</td><td>ベックktonディッキンソン·ファルコン</td><td> BDファルコン＃353846 </td><td></td></tr><tr><td> C-ディッシュ培養皿電極</td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> *細胞の単離（1.1ポイント）のために必要 ＃一緒に一つのキットで</td></tr></tbody></table>

電気刺激のマウス筋芽細胞前駆細胞およびアプリケーションからの工学骨格筋組織

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

仕組まれた筋肉組織は、褥瘡を勉強するなど、in vitroでの疾患モデルとして、再生医療用や肉代替の1として使用するための組織の生産を含む、いくつかの異なる目的に使用できます。最初に報告された3D筋肉構築物は、何年も前に作られ、分野の先駆者はVandenburghや同僚2,3アールされています。筋肉組織工学の進歩は、生化学的要因、幹細胞や前駆細胞の知識の広大なゲインから結果だけではありませんが、特に、物理的な要因が細胞挙動の制御において重要な役割を果たし、その研究によって得られた洞察に基づいている組織開発。最先端の人工筋肉は、現在セル人口ヒドロゲル構造物で構成されて構築されます。私たちの研究室では、これらは一般的に、C2C12、マイルマウス後肢の筋肉から単離されたマウス筋芽細胞の前駆細胞、又はマウス筋芽細胞株で構成されコラーゲン/マトリゲルの混合物でXEDと2アンカーポイントの間で播種し、筋肉の靭帯を模倣する。他のセルは、同様にそのようなL6ラット筋芽細胞4、新生児筋由来前駆細胞は5、そのような人間の6あるいは誘導多能性幹細胞（iPS細胞）7などの他の種由来の成体筋組織由来の細胞として例えば代替細胞株を考慮することができる。細胞収縮は、構築物8,9と文化の約1週間後の筋前駆細胞の分化の長軸に沿った細胞のアラインメントを引き起こします。また、電気刺激の適用はある程度8への分化のプロセスを向上させることができます。その限られたサイズ（8×2×0.5ミリメートル）のために完全な組織は、 例えば生存、分化、細胞アライメントを監視するために、共焦点顕微鏡を用いて分析することができる。特定のアプリケーションにengineeの要件に応じて赤い筋肉組織は変化するであろう、他の種への肉の代替の翻訳が必要であるとして機能するようにしながら再生医療用など使用は、組織の大きさと血管新生のアップスケーリングが必要になります。

最終製品は、 図3に示されている筋肉の構成要素となります。組織の大きさは長さ約8ミリメートル、幅2mm、厚さ0.5mmとなります。分化中の電気刺激は、ミオシン重鎖アイソフォームの発現を変更しますが、分化培地8によって誘導されるように大きく分化過程を強化しませんが、電気刺激は、筋肉の機能性をチェックするために、プロセスの終了時に適用することができますなぜなら、完全に発達した筋肉はサルコメアと電気パルスにより収縮することができるようになります。 分化と成熟はまた、筋肉の成熟マーカーまたは組織またはホールマウント染色された組織サンプルから作られたいずれかのセクションに横紋開発（αアクチニン用など染色）の遺伝子発現の評価と染色のために定量的PCRを用いて解析することができます。筋肉の成熟と分化相対TEDの遺伝子とミオシン重鎖の発現は、 例えば MyoDの、ミオゲニン、MFR4とMLP、およびMYH = 1、2、4、8 8が含まれています。実際に形成されている筋肉組織は、電気刺激...

仕組まれた筋肉組織は、疾患モデルとして、また肉の代替源として、再生医療における大きな可能性を秘めている。ここでは、マウス筋芽細胞の前駆細胞、及び電気パルスによる刺激からこのケースでは、筋肉の構造物の工学を記述します。

人工筋肉組織は、いくつかの異なる目的で使用することができ、それにはin vitroでの疾患モデルとして使用するための組織の作製などが含まれます。例えば、...

この手順の全体的な目的は、エンジニアリングされた筋肉組織を作製することです。これは、まずサテライト細胞または筋芽細胞株を培養して必要な細胞数を確保することで達成されます。次のステップは、アンカリングポイント（固定点）を作製することです。次に、細胞をゲルと混合し、得られた混合物をアンカリングポイントの間にキャストします。最終ステップは、細胞を筋肉組織へと分化させることです。最終的に、電気刺激を用いて細胞の収縮を誘導することができ、また蛍光染色および蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いることで、分化した筋細胞における細胞骨格のサルコメア構造を検出することが可能です。この手法の既存の方法に対する主な利点は、これらの組織内で筋細胞が一方向に整列することです。また、この手法は筋喪失に苦しむ患者にとっても意義があります。例えば、将来的に患者自身の細胞を用いてこれらの組織を作製すれば、移植目的で利用することが可能です。この手法は、筋肉の発達および筋損傷に関する知見を提供するだけでなく、再生医療やin vitro培養肉のような新しい応用分野への知見も提供します。本手順の実演では、筋芽細胞前駆細胞の単離および凍結保存のための手法を提示します。これらの手法は別途報告されています。詳細な参考文献については、書面によるプロトコルを参照してください。液体窒素からマウス筋芽細胞前駆細胞のバイアルを取り出した後、バイアルを37 °Cのウォーターバスに入れ、融解させます。次に、25 cm²のMatrigelコーティング済み組織培養フラスコに、加温した増殖培地を10 mL加えます。細胞が解凍されたら直ちに、バイアルの内容物を培地に加えてください。組織培養フラスコを用い、細胞を37 °C、5% CO2でインキュベートします。培養3日目に、トリプシン処理、中和、および遠心分離によって細胞を回収します。1000 RPMで遠心分離した後、細胞を75 cm²のMatrigelコート組織培養フラスコに継代します。3日ごとに細胞を継代し、6日目に細胞を150 cm²のMatrigelコート組織培養フラスコに継代します。9日目に、150 cm²のMatrigelコート組織培養フラスコから、150 cm²のMatrigelコート組織培養フラスコ3本、または150 cm²フラスコ3本に細胞を移します。培養12日目に、細胞を筋肉構築物に播種する準備が整います。まず、この概略図に示すように、一方の端を三角形にした約5 mm²のベルクロを切り出します。ベルクロはソフト面のみを使用してください。次に、エラストマーと硬化剤を10:1の比率で混合し、シリコン接着剤を調製します。次に、6ウェル培養プレートの各ウェルに、2枚のベルクロを約12 mmの間隔を空けて接着し、一晩乾燥させます。翌日、ウェルに70% ethanolを加え、15分間インキュベートして、ウェルとベルクロを滅菌します。続いて、ウェルをPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄液をウェルに残したまま、プレートを15分間UVライトに曝露させます。その後、PBSを吸引し、使用するまでプレートを組織培養インキュベーターに移します。3.2 mg/mLのコラーゲンと滅菌済み0.02%酢酸の溶液を調製します。コラーゲン溶液を、あらかじめ冷蔵庫で解凍しておいたマトリゲル溶液とともに氷上に置きます。次に、トリプシン処理と遠心分離により細胞を回収します。その後、細胞ペレットを成長培地で再懸濁し、標準的な手順に従って細胞数をカウントします。細胞の計数が完了したら、細胞が入ったチューブを組織培養インキュベーターに入れます。マトリックス溶液は、氷上で以下の割合で各溶液を混合して調製します：51.3%のCollagen solution 0.2% 0.5 molar sodium hydroxide、8.6%のマトリックスゲル、および39.9%の増殖培地。pHが上昇すると急速な凝固が起こる可能性があるため、最終溶液の色がピンク色であることを確認してください。最終的な容量は、播種するウェル数によって異なります。この表は10個の筋肉における容量を示しています。細胞が完全に再懸濁されていることを確認し、1つのコンストラクトあたり750,000から1,250,000個の細胞を新しい遠心チューブに移し、1000 RPMで5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットをマトリックス混合液の少量かつ十分な量で再懸濁します。ペレットを完全に再懸濁させた後、細胞をマトリックス混合物の残りの容量に加えます。次に、インキュベーターから予熱したプレートを取り出し、各ベルクロに細胞マトリックス混合物を0.35〜0.4 mLずつピペッティングします。その後、付着部位間の中心からピペッティングを開始し、ベルクロまで広げます。最後に、残りのゲルで2つのベルクロアンカー間の隙間を埋め、ベルクロ片の周囲にピペットで注入します。プレートに蓋をし、室温で5～10分間放置します。その後、ディッシュを軽く叩き、ゲルが凝固しているか目視で確認します。その場合は、ディッシュを慎重に組織培養インキュベーターに移します。インキュベーター内で1～2時間経過した後、各ゲルに4 mLの予熱した増殖培地を静かに重層します。その後、プレートを組織培養インキュベーターに戻します。24時間後、増殖培地を分化培地に交換します。2〜3日ごとに培地交換を繰り返します。培養7日目には、配向した成熟筋線維が認められるはずです。この時点で、繊維に電気刺激を与えることができます。まず、イオン光学プレートの電極を70% ethanolで15分間滅菌し、UVライトの下で30分間乾燥させます。次に、滅菌した電極を培養プレート上に配置します。このプレート底面を示す写真にあるように、電極が筋肉構築物と平行に配置されていることを確認し、白い矢印で示されたようにプレートに蓋をして、組織培養インキュベーターに移します。イオン光学Cペーサーを適切なケーブルで接続し、ここに刺激プロトコルを適用します。4 V/cm、パルス幅 6 ms、周波数 2 Hzを使用します。電気刺激は通常48時間にわたって行います。刺激中は24時間ごとに培養液を交換してください。この画像は、成熟した筋肉構築物の典型的な例を示しています。組織のサイズは、長さ約8 mm、幅2 mm、厚さ0.5 mmです。この画像は、工学的に作製された骨格筋組織における筋前駆細胞の典型的な例を示しています。非刺激のミラーリング生体人工筋肉（M bm）の凍結切片です。分化8日目に、サルコメアα-アクチニン（赤色）、サルコメアミオシン（緑色）、および核（青色）で染色しました。右側のパネルは、枠で囲まれた領域の拡大図です。このプロトコルはC2C12細胞にも適用可能です。この画像は、最後の画像と同じ方法で染色した分化C2C12細胞を示しています。サルコメアα-アクチニンを赤色で、サルコメアミオシンを緑色で、そして核を青色で示しています。繰り返しになりますが、右側のパネルは枠で囲まれた領域を拡大したものです。この手順を行う際は、すべてを氷上で保持することが重要です。この手順の後、定量PCRなどの他の手法を用いて、作製後の遺伝子発現レベルの変化を実証するなど、追加の疑問を検討することが可能です。この手法は、組織形態形成における力学的役割を研究するための道を切り開きました。また、工学的な心筋モデルの設計にも寄与しました。このビデオを視聴することで、ハイドロゲルベースのスキャフォールドを用いて工学的な筋肉組織を作製する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

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Bioengineering

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