内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

この手順の目的は、成魚の聴覚および前庭末端器官から健康で無傷の有毛細胞を取得し、パッチクランプで使用できるようにする方法を実証することです。それらの電位依存性チャネルの生物物理学的特性を特徴付けることを目的とした研究。これは、最初に魚から脳を取り出し、次に迷路を含む脳ケースの腹側部分を取り出すことによって達成されます。

2番目のステップは、末端器官、Sレガ、卵形嚢、および半規管を含む迷路を分離するために、骨のボウルをバラバラにすることです。次に、犬の毛を使用して、有毛細胞を含む上皮のシートである端器官から持ち上げます。最後のステップは、2本の犬の毛で上皮シートを三重にキュレーションすることにより、個々の有毛細胞を単離することです。

最終的には、単離された有毛細胞にパッチランプの録音を行い、電位依存性チャネルの特性を特徴付けることができます。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、遺伝的に扱いやすいゼブラフィッシュモデル生物から生存可能な有毛細胞を得る方法を示していることです。この方法は、聴覚とバランスを媒介する細胞からの神経伝達物質の放出を制御するメカニズムを理解しようとするものなど、聴覚および前庭生理学の分野における重要な質問に答えるために使用できます。

この手順は、添付の原稿に従って6つの異なる溶液を準備することから始めます。次に、4つの35ミリメートルシャーレにラベルを付け、添付の原稿に示されている溶液を約半分まで充填します。その後、硬化したシルガードを充填した60mmのシャーレに魚の形をした空洞をカットして解剖皿を準備します。

これにより、解剖中に動物が転倒するのを防ぐことができます。犬の毛包の端をガラスのパスタピペットの端に瞬間接着剤で接着し、毛がピペットの端から約0.5cm伸びるようにして、少なくとも2つの細胞分離ツールを準備します。次に、1匹の成魚を通常のゼブラフィッシュリンガーまたはNZRとトリカが入ったビーカーに浸して犠牲にします。

すべての耳介の動きが止まるまで、鰓を視覚的に監視します。少なくともさらに10分待ってから、魚を取り出し、新鮮なNZRですすいでください。その後。魚を背側を上にして解剖皿に入れます。

各眼窩に1本の標準縫製ストレートピンを挿入し、背側腹軸に3本目のピンを挿入します。ズームステレオ解剖顕微鏡の下で頭から尾までの距離の約3分の1から半分を露出させ、頭蓋骨の屋根を魚の鼻までの鰓の高さまで約0.5センチメートルの点から取り外して、脳と脊髄の短い部分を露出させます。次に、脊髄を切断し、神経やその他の付着物を切断しながら、細かい鉗子で脳を持ち上げます。

その後、脳を取り出して廃棄します。頭蓋骨嚢の残りの腹側部分は、内耳器官を含むボウルを形成します。各内耳の四分の一端に対称的に配置されたレギナとスカリーの目立つ白い不透明なOTA耳石と、横方向に配置された卵形耳石を観察します。

もっと集計します。これらの構造は、細い鉗子とスプリングハサミのペアで迷路を無傷で除去するのに役立つランドマークです。骨のボウルを取り外し、腹側と外側のアタッチメントをすべて切断し、頭からそっと持ち上げます。

次に、低カルシウム溶液または低casを含むシャーレに入れます。ボウルの正中線で割れ、細かい鉗子の先端を中央に挿入し、半分をこじ開けて左右の半分を分離します。次に、骨から2つの迷路を取り除きます。

迷路を検査し、聴覚および前庭の末端器官を特定します。半規管、尿道、スカリー、およびレギナ。細い鉗子を使用して、レギナと卵形嚢から臭いの浮き上がりを慎重に取り除きます。

この手順では、終末器官をロカスとプロパンを含む皿に移します。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、これらの構造体を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション期間の終わりに、構造をNZRとBSAを含む皿に移し、少なくとも30分間インキュベー

細胞単離の準備をさらに進めます。末端器官の1つ、例えばレギナをNZRを含む皿に移します。次に、この皿をステレオズーム解剖顕微鏡のステージに置きます。

犬の毛を使用して、有毛細胞を含むピンクがかった上皮組織のシートを黄斑からそっと持ち上げます。メイスはスカリーとウラシルから取り外すこともでき、カエは半規管内の位置から分離できます。以前に準備した2つの細胞単離ツールを使用して、黄斑をテートして、有毛細胞を含むデブリフィールドを生成します。

皿を動かす前に、セルが底に落ち着くまで少なくとも5分待ちます。次に、皿を面コントラスト光学系を備えた倒立顕微鏡のステージに移します。40倍の拡大で細胞を観察します。

細胞形態の多様性に注目してください。アボカドの形をした細胞もあれば、長くて細い細胞もあります。頂端の毛束の存在は有毛細胞を示し、位相の明るさはそれらの健康を保証します。

穿孔パッチ記録の場合は、まず5ミリグラムのアンホテリシンBを1.5ミリリットルの遠心チューブに入れて、アンホテリシン含有溶液を調製します。次に、100マイクロリットルのDMSOを追加し、すべてのアンホテリシンが溶解するまで、すぐにチューブを10〜20秒間ボルテックスします。次に、625マイクロリットルのカリウムイオン内部溶液を2番目のマイクロ遠心チューブにピペット

次に、10マイクロリットルのアムホテリシン溶液をカリウムイオン内部溶液に加え、さらに10〜20秒間ボルテックスします。ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを含むフィラメントからパッチピペットを作製します。多段プーラーを使用する場合、ピペットの先端直径は約2ミクロン、抵抗は1〜3メガオームである必要があります。

鈍い弾丸型のピペットは、電気生理学的記録中のアクセス抵抗が最も少ないため、好まれます。その後、28ゲージのマイクロフィルシリンジニードルを使用して、パッチピペットの半分までカリウムイオン含有アンホテリシン内部溶液を充填します。このピペットをパッチクランプアンプのヘッドステージに取り付けて、パッチクランプ録音を可能にします。

まず、電極が空気溶液界面を通って細胞近くの記録皿の底まで下降するときに、電極に正圧を加えます。次に、電極を健康そうな細胞に直交して配置します。電極が十分に近くなり、セルが流出する溶液から離れ始めたら、圧力をすばやく逆にして、セルが電極に飛び乗るまで電極にわずかな真空を作り出します。

電極への吸引を直ちに停止して、セルとギガオームシールを形成できるようにします。電極に10mVの過分極電圧ステップを繰り返し印加し、容量性電流の過渡性を観察します。アンホテリシンによって誘発される膜穿孔を、一過性の大きさが最大サイズまで大きくなるにつれて監視し続けます。

健康な細胞における穿孔パッチ配置の確立を確認するには、電位の過分極および脱分極ステップを適用することにより、電圧依存電流を引き出します。ほとんどの有毛細胞は、脱分極が維持されている間に急速に不活性化する顕著な外向きの電流を持っています。この図は、脳を摘出した後の脳ケースの腹側部分を示しています。

トゥロ、属、スカリーに関連する耳石、および2つの卵形嚢に関連する耳石は、骨のボウルを取り除いた後、それらを覆う細い骨を通して見ることができます。耳石の存在は、迷路の位置を特定するのに役立ちます。漫画の破線は、左の迷宮のおおよその周囲を示しています。

迷路が隔離されると、s、legina、卵形嚢、半規管などの聴覚および前庭の末端器官を特定できます。この漫画は、これらの構造、A、B、およびCの半規管の位置を示しています。Dは卵管、Eはs、fはレガです。

有毛細胞の形態の多様性は、レガから単離された細胞のこの図で明らかです。細胞は、薄い細胞とアボカド型の2つのクラスに大別されます。健康な細胞は、対照的にシャープな輪郭とはっきりとした毛束で明るく段階的に進行します。

挿入図Bに示されている死細胞は、粒状の黒い外観をしています。この図は、マイナス 140 ミリボルトからプラス 70 ミリボルトまでの 10 ミリボルト刻みで印加され、保持電位がマイナス 70 ミリボルトの 3 つのプレゼンテーションに対するセル内の平均応答を示しています。不活性化電流は、より脱分極した電位で現れることに注意してください。

一度習得すると、処置開始から90分後に電気生理学的録音を行うことができます。さらに、トライステップを延期し、終末器官をBSという溶液に保管すれば、解剖開始から最大4時間後まで健康な細胞を得ることができます。この調製物は、広く利用可能なゼブラフィッシュの遺伝子変異と組み合わせて使用することで、聴覚の不均衡のメカニズムの根底にある分子因子を調査するためのユニークなモデルシステムを提供します。