Name: 内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ内耳有毛細胞のパッチクランプ記録法。聴覚・平衡覚器官から健康な細胞を単離し、電位依存性イオンチャネルの生物理学的特性を解析する手法です。遺伝学的操作が可能なモデル生物を用い、神経伝達物質放出機構の理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

NSF（0854551）から研究助成を受けた。

1。予備実験の準備<ol><li> 100ミリリットルNZR（通常ゼブラリンゲル）の（a）、（b）50ミリリットルNZR + Tricaine（MS222）、（c）は10ミリリットルNZR + BSAと、（d）100ミリリットルのLoCaS：6溶液（組成は表1を参照）を準備（低Ca 2 +の溶液）、（e）の10ミリリットルLoCaS +パパイン、（f）は、100ミリリットルK +内部 ​​溶液。ソリューションの（a）、（b）、（d）及び（f）4℃で最長1ヶ月まで保存することができるソリューション（c）及び（e）実験の日を準備する必要があります。すべてのソリューションは、実験を開始する前に、室温でなければなりません。 </li><li>ラベルとのほぼ中間ソリューション（）、（C）、（D）と、および（e）4 35ミリメートルペトリ皿を埋める。 </li><li>シルガード（ダウコーニング、ミッドランド、ミシガン州）で60ミリメートルペトリ皿を充填してから、魚が転倒することなく、背筋を伸ばして座るようになり、その中に空洞を切断することによって、解剖皿を作る。 </li><li>ガラスの端に犬の毛の接着卵胞年末までに少なくとも二つの細胞の分離ツールを準備瞬間接着剤とパスツールピペットは、髪は約0.5cmでピペットの末尾を超えて拡張することができます。ラブラドール·レトリバーとWeimaraners風ソフト毛皮の犬の毛はうまくいく。 </li></ol> 2。聴覚と前庭迷路の分離<ol><li> NZR + Tricaineを入れたビーカー中に浸漬することにより1成体ゼブラフィッシュを生け贄に捧げる。すべての鰓蓋の動きが止まるまで、視覚的に鰓を監視します。魚を除去し、新鮮なNZRでリンスする前に追加の10分待ちます。これらの手順は、インスティテューショナルアニマルケアによって承認されていると利用ペパーダイン大学の委員会（動物実験委員会）が、承認があなた自身の機関から入手する必要があります。 </li><li> 1それぞれの目のソケットを介して標準縫製ストレートピン（約2.5センチ）とヘッドからの距離の半分に約3分の1背腹軸を介して第3のピンを挿入することにより、最大解剖皿の背側に魚をピンに示すように尾へ図1A。 </li><li>ズーム（0.62-5x）を10倍接眼レンズを装着ステレオ解剖顕微鏡下では、約点から頭蓋骨の屋根を削除することで、脳や脊髄の短い部分を露出させるために、春のはさみ（ファイン科学ツールカタログ番号15000から02）を使用前方の魚の鼻に鰓のレベルまで尾0.5センチメートル。脊髄を切断し、脊髄神経やその他の添付ファイルをカットしながら微鉗子（ファイン科学ツールカタログ番号11251から30）で脳を持ち上げ脳を削除した（ 図1B）捨てる。 </li><li>残っている頭蓋骨カプセルの腹側半分が内耳器官を含む &quot;ボウル&quot;を形成する。もっと吻方各内耳の尾側に対称に配置lagenasと球形嚢の著名な、白、不透明な耳と横方向に配置卵形嚢の耳石を観察する（ 図1Cおよび図4A）。 </li><li>すべての腹と横attachmenを切断することによって、骨のボウルを取り外しtsは優しく微鉗子で頭からそれを持ち上げながら。 LoCaS（ 図1Dおよび図4B）を含むペトリ皿に入れます。 </li><li>細かい鉗子の2ペアを使用して、中央に鉗子のポイントを挿入し、半分をこじ開け右半分と左半分を分離し、どちらかの骨の側縁をつかんで離しあるいは、それらを引っ張って、正中線でボウルをバラバラに割れる離れて。細かい鉗子（ 図2）を用いて骨から2迷路を削除します。 </li><li>三半規管、utricles、球形嚢とlagenas（ 図4C）：聴覚と前庭エンドの臓器を特定するために迷路を点検します。各耳の下のピンクがかった領域が有毛細胞を含む斑です。同様に、半規管の膨大部内側にピンクのストリップは、有毛細胞が配置されている頂を識別します。 </li><li>慎重に細かい鉗子を使用つぼや卵形嚢から耳石を取り外します（ <stronグラム&gt;図2と図4C）。それはそうすることが嚢状有毛細胞に損傷を与える可能性がある球形嚢から耳石を取り外す必要はありません。 </li></ol> 3。有毛細胞の単離<ol><li>プラスチックホールピペット（Fisher Scientific社のカタログ番号13-711-9AM）を使用して、LoCaS +パパインは、転送される流体の体積を最小限に含まれている皿に終わり器官を動かす。 </li><li>室温で30分間この溶液中に、これらの構造体を培養する。 </li><li>潜伏期間の終了時に、NZR + BSAを含む皿に構造体を動かすと、少なくとも30分間この溶液中でインキュベートする。有毛細胞は最大4時間、この溶液中に健康を維持しますが、（次の手順を参照してください）​​分離後1-2時間後に劣化します。 </li><li>細胞単離のための準備として、NZRを含む皿にエンド器官の一つを移動します。 </li><li> lagenasとutriclesは、優しくピンク色がかった上皮tiの斑-シートをリフトオフする犬の毛を使用有毛細胞（図3A）が含まれてssue。斑はえぐらでき球形嚢の耳石の下から（犬の毛を使用）、半規管の膨大部内側にその場所から頂。 </li><li>ステップ1.4で調製した2細胞単離·ツールを使用して、有毛細胞（図3B）が含まれている残骸フィールドを生成するために黄斑または頂をひいて粉にする。細胞は、少なくとも5分はそれを移動する前に、皿の底に沈ませます。 </li><li>位相コントラスト光学系を備えた倒立顕微鏡のステージに皿を再配置します。 40X倍率で細胞を観察し、形態の多様性に注意してください。他は長く、薄いながら、多くの細胞はアボカドの形をしている。根尖毛束の存在は有毛細胞としてそれらを識別し、位相の明るさは、自分の健康を保証します。隔離された有毛細胞の顕微鏡写真を図5に示します。 </li></ol> 4。ゼブラフィッシュの有毛細胞をパッチクランプ<ol><li> perfoの準備のために場所5mgのアムホテリシンB（シグマA4888）を1.5 mlマイクロチューブに100μlのDMSOで埋める：定格パッチ録音5,6は 、次のようにアンホテリシン含有の内部溶液を調製します。アムホテリシンのすべてが溶解するまで10〜20秒のために直ちにボルテックスこのソリューション。次に、ピペット625第二マイクロ遠心チューブに液K +内部 ​​溶液。上記のようにK +内部 ​​溶液と渦にアムホテリシン溶液10μlを追加します。在庫アムホテリシンソリューションは、数時間が、1時間後の最終的な解決策を破棄します。 </li><li>多段階プラー（サターP-1000）を使用して、BF 150-86-10ホウケイ酸ガラス（サターインスツルメンツ）からパッチピペットを作製。ピペットは、約2μmの先端径を有するべきであり、表1のソリューションとMΩ1-3の抵抗値を持つことになります。次のように仕事がうまくあることをプラーの設定：熱=ランプminus10は、= 0の場合、速度を引き出し= 18、遅延= 1、圧力= 600。の形状良いピペットの先端は、図5の挿入図cの写真からも明らかである。彼らは電気生理学的記録の間に、少なくともアクセス抵抗を提供するように鈍い &quot;砲弾型&quot;ピペットが好ましい。 </li><li>アンホテリシン含有のK +内部 ​​液で中途半端に記録電極を埋めるために、28ゲージMicrofilの注射針（世界の精密機器MF28G-5）を使用してください。 </li><li>パッチクランプアンプのヘッドステージに貼って電極を形成する。 -10 mVの、10Hzで10msの電圧ステップを適用し、それが上下のセルの近くに録音皿の底に空気/溶液界面を介して操作されるように電極に正圧を維持します。 </li><li>健康的な細胞に直角に電極を配置します。電極はそれが出て流動ソリューションから脱却始まるように細胞に十分近いとき、迅速にその上にセルの &quot;ジャンプ&quot;まで、電極にわずかな真空を適用し、圧力を逆にしてください。すぐに目の上の吸引をやめるeは、電極と電極の内側に70mVの保持電位を適用します。数秒以内にgigaohmシールが形成されます。 </li><li>シール形成直後に表示される電圧ステップの開始と終了時の過渡電流容量を守ってください。トランジェントが（約10分）、その最大サイズまでの大きさに成長するように見てアムホテリシンによって電極下膜の穿孔を継続的に監視します。 </li><li>健康な細胞で細胞全体（穴あき）の構成の確立を確認するには、過分極と電圧のステップを脱分極を適用することによって、外向きK +電流を誘発する。ほとんどの有毛細胞は顕著な外向き電流（ 図6を参照）。 </li></ol> 5。代表的な結果 図4は、細胞単離のステップの間に撮影した画像を示しています。パネルで、lagenas、saccluliとutriclesに関連付けられている耳石がthrouを見ることができますGHそれらの上に横たわることを骨の薄い層。これらの不透明な構造は解剖の後続のステップの間に動物から終わり臓器の安全な取り外しを助けるために便利な観光スポットを提供します。パネルBは、無傷の迷路とutricles、lagenasと球形嚢の著名な耳石が含まれている骨の &quot;ボウル&quot;を示しています。パネルCは、骨から削除された迷路を示しています。つぼでスカラップ縁で大きな耳、卵形嚢で球形嚢と豆の形をした耳石でつらら状の耳石に注意してください。つぼから単離された細胞で見られる大きさと形態の多様性の一部は、 図5に示されている。健康な細胞は容易に鋭い境界を持つ明るい相として識別される。セル形状は、大きく2つのクラスに分割することができます：アボカド状（AVO）と長くて細い（THN）各グループ内のセルのサイズが著しく異なることがありますが（例：AVO 1とAVO 3の比較）。はめ込みのクラスタを示しています互いに完全に分離されなかった3セル。挿入図bのセルの黒い色と粒状の外観は容易に死んだとして、このセルを識別します。挿入図cは 、これらの細胞から記録するための適切な形状と寸法を示すパッチピペットの先端を示しています。 図6に示すように、現在のトレースは、 図5に示すAVO 2に類似つぼセルに課せられた可能性の段階を過分極と脱分極に応答して得られた。異なるサイズと形状の細胞内での電流応答は、広く電位依存性チャネルの補数の多様性を示唆して変えることができます。 図1-3：有毛細胞の単離の工程を示す漫画。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> 図1頭蓋骨capsuの除去ゼブラから内耳迷路を含むル。皿を解剖するゼブラフィッシュの背側を犠牲にピン。Bは 。オープン頭蓋骨、脳を取り外して廃棄します。Cは 。 utricles、lagenasと球形嚢。Dの耳石を観察します。迷路を含む頭蓋骨カプセルの腹の部分を削除します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> 図2：頭蓋骨カプセルから迷路の除去。その正中線で頭蓋骨カプセルを離れて取り締まる。B。骨から迷路を削除します。Cは 。ピンセットを用いてlagenasとutriclesから耳石を取り出します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> 図3：迷路から有毛細胞の単離。優しくミリアンペアを持ち上げ犬の毛とculaeますb。 2犬の毛に斑をひいて粉にする。 C.は、パッチクランプ用の分離有毛細胞を使用してください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> 図4：個々の細胞の単離のステップの間に撮影した画像は、脳を除去した後にAを 、2 lagenasと球形嚢（矢印）に関連付けられている耳石とutriclesが（矢頭）可視化することができる。腹を除去した後、Bの動物から内耳器官が含まれている頭蓋骨のカプセルの一部。 Bの右半分の漫画は左卵形嚢、つぼと球形嚢の位置を識別します。破線は左の迷路のおおよその位置を示します。C。右の迷宮（中央図）、D：C言語で迷路の主要部分を説明する漫画を描いてきた。 ：前半円形運河、B：水平の運河は、c：後部運河は、d：小嚢の耳石、E：嚢状耳石、F：lagenal耳石。 Dの中のスケールバーは1 mmでAとB、CとDは0.5mmを表し<img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> 図5の形態の多様性を説明するためのつぼから隔離された、健康な細胞; AVO：アボカド状細胞; THN：長い、薄いセル。挿入図：3不完全に単離された細胞のクラスター;はめ込みB：死んだ細胞、はめ込みがc：ゼブラフィッシュの有毛細胞から電気生理学的記録に使用されるパッチ電極の先端。スケールバー=20μmでは、メインの人物と、そのすべてのインセットに適用されます。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> パッチに記録図6電流は、有毛細胞をクランプされます。セル内の平均化された応答（類似トン図5のO AVO 2）70mVの保持電位から-140 mVから70 mVから10 mV刻みで印加された電圧ステップの3つのプレゼンテーションへ。より脱分極電位で表示され、現在の不活化に注意してください。電圧ステップの大きさは、一部のトレースの隣に表示されます。

<ol><li>Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+solitary+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells.</a> Nature. 304, 538-5341 (1983).</li>
<li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> J. Physiol. 385, 207-242 (1987).</li>
<li>Sugihara, I., Furukawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+aspects+of+two+different+types+of+hair+cells+in+the+goldfish+sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus.</a> J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).</li>
<li>Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+inactivation+of+calcium+channels+in+cochlear+hair+cells+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken.</a> J. Physiol. 583, 909-922 (2007).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+access+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Low access perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Ca2%2B+entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).</li>
<li>Liang, J., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+and+fine+dissection+of+inner+ear+sensory+epithelia+in+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio).</a> J. Vis Exp. 27, e1211(2009).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 275-297 (1988).</li>
<li>Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-triggered+exocytosis+in+an+isolated+presynaptic+cell%3A+capacitance+measurements+in+saccular+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells.</a> Neuron. 13, 875-883 (1994).</li>
<li>Kim, M. -H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2%2B+imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis Exp. 59, e3345(2012).</li>
<li>Housley, G. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li>
<li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

エンド臓器や細胞の穏やかな治療法を慎重に切開は、健康、無傷と生理活性有毛細胞の単離に成功するために重要です。次のヒントに従うことにより、成功を保証します： <ol><li>それはより小さい魚（長さ2〜2.5センチメートル）から健康な細胞を得ることが容易である。大きい魚は解剖プロセス中にその曖昧な視覚化、より多くの脂肪滴を持つ。 </li><li>有毛細胞を覆っている耳石を、削除する場合は、注意が必要。鉗子で耳石を掴ん時にセルには触れないでください。 </li><li>斑と頂がシートや上皮から粉砕細胞としてリフトオフされるときに最良の結果が得られる。 </li><li>我々は、人間のまつげのようにテーパーが少なく柔軟ではありません7を使用することを含め、他の方法より優れていることが細胞をひいて粉にするために犬の毛の使用を見つける。 </li><li>パッチクランプ法、tに正圧印加時それは先端を清潔に保つことが重要である空気/溶液界面を通過する際に、彼は電極。電極上に &quot;ジャンプ&quot;するには、セルを有効にするには、正圧のリリースも重要である。この方法は、このようにセルとgigaohmシールを形成する可能性を高める、アウェイチップからアンホテリシン含有の少量の溶液をクリアします。私たちの実験では、代わりに、より伝統的な細胞全体の構成のために、細胞の脆弱性の穿孔パッチ記録法を使用しています。 gigaohmシールの損失でしばしば結果 &quot;全細胞を行く&quot;しようとしています。 </li></ol>ここで説明する方法は、動物ごとに健康な髪の細胞の何百ものをもたらすでしょう。技術は室温で行い、解剖顕微鏡を超えて、特別な機器を必要とすることはできません。 JOVEにおける前回の報告書では、腹側アプローチ8を使用したゼブラフィッシュ内耳の解剖について説明します。これらの著者はdisseを実証全体的には、パラホルムアルデヒド固定内耳器官のction。私達は私達の方法との比較のためにこの動画を視聴するには、読者を奨励しています。ここで紹介する方法の利点の一つは、生理的な調査のための有用な生細胞の取得です。これらの細胞の使用は容量測定を11,12にすることによって、細胞共鳴9,10、モニターの神経伝達物質の放出を検討するように拡張することができます（ここに示されているように）電位依存性チャネルを研究するためのパッチクランプ実験に使うだけでなく、によって誘導される神経調節を調べるリガンド依存性チャネル13の活性化だけでなく、聴覚やバランス14の両方に影響を及ぼす変異体を用いたから収集することができ、豊富な情報を活用する。

<table border="1"><tbody><tr><td> ソリューション名 </td><td> レシピ </td></tr><tr><td> （a）はNZR（ノーマルゼブラリンゲル）（mMで） </td><td> 116のNaCl、2のKCl、CaCl 2の 2、3グルコース、5のNa + - HEPES、pHは7.35。 </td></tr><tr><td> （b）はNZR + Tricaine </td><td> NZR +0.02％3 - アミノ安息香酸エチルエステルメタンスルホン酸（シグマA5040）。 </td></tr><tr><td> （c）はNZR + BSA </td><td> NZR + 0.4％ウシ血清アルブミン（シグマA2153）。 </td></tr><tr><td> （d）はLoCaS（低Ca 2 +溶液）（mMで） </td><td> 100のNaCl、2のKCl、0.05のCaCl 2、0.05のMgCl 2、3、グルコース、30 Na +非 HEPES、pHは7.35。 </td></tr><tr><td> （e）のLoCaS +パパイン</td><td> LoCaS +0.05％L-システイン（シグマC1276）+ 0.2％パパイン（シグマP3375）。 </td></tr><tr><td> （f）はK +内部 ​​液（mMで） </td><td> 52 K 2 SO 4、38のKCl、1 K +-EGTA、5 K +-HEPES、pHは7.3。 </td></tr></tbody></table> 表1。ソリューション。

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

種々の種から単離された感覚有毛細胞の電位依存性チャネルのパッチクランプ解析は、1月4日以前に説明したが、この動画はゼブラフィッシュから有毛細胞へのそれらの技術の最初のアプリケーションを表してきた。球形嚢、つぼ、卵形嚢と三半規管：ここでは、内耳のエンド臓器すべてから健康な無傷の有毛細胞を単離するための方法を示しています。さらに、私たちは、有毛細胞のサイズと形態の多様性を発揮し得ることができるパッチクランプ記録の種類の例を与える。他のものに比べて、このゼブラフィッシュモデルシステムを使用することの利点は、聴覚とバランスの両方に影響を及ぼすゼブラフィッシュ突然変異体の利用に起因しています。トランスジェニック系統と遺伝的解析と操作、細胞単離および電気生理学的手法を利用する他の技術の使用との組み合わせでロール有毛細胞pに大きな洞察を促進しなければならないここで紹介これらの感覚モダリティを媒介することに横たわっていた。

このビデオの目的は、成人のゼブラフィッシュの内耳器官から健康な無傷の有毛細胞を取得した後、それらの電位依存性チャネルの生物物理学的特性を特徴付けることを目的としたパッチクランプ研究のためにそれらを使用するための手順を示すことである。

さまざまな種から単離された感覚有毛細胞における電位依存性チャネルのパッチクランプ解析については、これまでにも報告されているが1-4、本...

本手順の目的は、パッチクランプ法を用いて電圧依存性チャネルの生物物理学的特性を評価する研究に利用するため、成体ゼブラフィッシュの聴覚および前庭終末器官から、健全で完全な有毛細胞を回収する方法を実演することです。まず魚から脳を取り除き、次に迷路を含む脳頭蓋の腹側部分を摘出することでこれを達成します。第2ステップは、終末器官（卵形嚢、球形嚢、および半規管）を含む迷路を単離するために、骨の殻を砕くことです。次に、犬の毛を用いて、有毛細胞を含む上皮シートを終末器官から剥離します。最後のステップは、2本の犬の毛で上皮シートを細かく切り分けることにより、個々の有毛細胞を単離することです。最終的に、パッチクランプ法を用いて単離した有毛細胞から記録を行うことで、電位依存性チャネルの特性を明らかにすることができます。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、遺伝的な操作が容易なモデル生物であるゼブラフィッシュから、生存した有毛細胞を得る方法を提示している点にあります。本手法は、聴覚および前庭生理学の分野における重要な疑問、例えば、聴覚と平衡感覚を媒介する細胞からの神経伝達物質放出を制御するメカニズムの解明などに役立てることができます。付属の原稿に従って6種類の溶液を調製し、本手順を開始します。次に、4枚の35 mmペトリ皿にラベルを貼り、付属の原稿に記載された溶液を約半分まで満たします。その後、硬化させたSylgardを満たした60 mmペトリ皿に魚の形の空洞を切り抜き、解剖皿を準備します。これにより、解剖中に動物が転倒するのを防ぎます。犬の毛の毛包端を瞬間接着剤でガラス製パスタピペットの端に接着し、毛がピペットの端から約0.5 centimeters突き出るようにして、細胞分離ツールを少なくとも2本準備します。次に、ゼブラフィッシュ用標準リンゲル液（NZR）およびトリカ containing 溶液を入れたビーカーに浸し、成体ゼブラフィッシュ1匹を安楽死させます。耳状の動きが完全に止まるまで、鰓を視覚的に観察します。その後、さらに少なくとも10分待ってから、魚を取り出し、新鮮なNZRで洗浄します。その後、魚を解剖皿に背側を上にして置きます。標準的な裁縫用ストレートピンを各眼窩に1本ずつ、そして3本目のピンを背腹軸に挿入します。ズーム実体顕微鏡下で、頭部から尾部までの距離の約3分の1から2分の1の範囲において、スプリングシザーを用いて、鰓のレベルから頭側へ約0.5 cmの地点から魚の鼻まで頭蓋頂を除去し、脳と脊髄の短いセグメントを露出させます。その後、脊髄を切断し、神経やその他の付着部を切断しながら、微細ピンセットで脳を持ち上げます。その後、脳を取り除いて廃棄します。頭蓋骨カプセルの残りの腹側部分が、内耳器官を収めるボウル状の構造となります。各内耳の末端4分の1の位置に対称的に存在する、leginaおよびsculli内の顕著な白色不透明のOTA耳石と、側方に位置する卵形嚢耳石を観察してください。さらに計数します。これらの構造は、微細鉗子とスプリング鋏を用いて迷路を損傷なく摘出する際の有用な指標となります。腹側および外側の付着部をすべて切断し、頭部から慎重に持ち上げながら、骨のボウル状の部分を取り除きます。次に、低カルシウム溶液（low cas）を含むペトリ皿に置きます。ボウルの正中線を割り、微小鑷子の先端を中心に入れて左右にこじ開けることで、右半分と左半分を分離します。その後、骨から2つの迷路を取り出します。迷路を観察し、聴覚および前庭の終末器官を特定します。半規管、卵形嚢、球嚢、および耳石器を確認してください。微細鉗子を用いて、球嚢と卵形嚢から耳石を慎重に除去します。この手順では、末端器官をlocasとpropaneを含むディッシュに移します。プラスチック製転移ピペットを用いて、これらの構造体を室温で30分間インキュベートします。インキュベーション期間の終了後、構造体をNZRとBSAを含むディッシュに移し、少なくとも30分間インキュベートします。細胞分離に向けたさらなる準備を行います。脚などの末端器官を1つ、NZRを含むディッシュに移します。このディッシュを実体顕微鏡のステージ上に置きます。犬の毛を用いて、有毛細胞を含むピンク色の上皮組織のシートである斑点をそっと持ち上げます。斑点は耳石嚢および球形嚢からも取り除くことができ、また、半規管内の各部位からクリスタを単離することも可能です。あらかじめ準備した2つの細胞単離ツールを用いて、斑点を切り出し、有毛細胞を含むデブリフィールドを作成します。ディッシュを移動させる前に、細胞が底面に沈殿するまで少なくとも5分間待機します。次に、位相差光学系を備えた倒立顕微鏡のステージにディッシュを載せます。40倍の倍率で細胞を観察してください。細胞形態の多様性に注目してください。アボカド状の細胞もあれば、細長い細胞もあります。頂端に毛束が存在することは有毛細胞であることを示しており、位相差顕微鏡での輝度はそれらが健全であることを保証しています。穿孔パッチ記録（perforated patch recording）用に、まず5 mgのamphotericin Bを1.5 mLの遠心チューブに入れます。次に100 µLのDMSOを加え、amphotericinが完全に溶解するまで、直ちにチューブを10～20秒間ボルテックスします。続いて、別のマイクロ遠心チューブに625 µLのカリウムイオン内部溶液をピペットで分注します。次に、10 µLのアムホテリシン溶液をカリウムイオン内部液に加え、さらに10〜20秒間ボルテックスミキサーで攪拌します。ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブを含むフィラメントからパッチピペットを作製します。マルチステージ・プラーを使用し、ピペットの先端径が約2 µm、抵抗値が1〜3 MΩとなるように調整してください。電生理学的記録においてアクセス抵抗を最小限に抑えられるため、鈍端の弾丸状のピペットが好まれます。次に、28ゲージのマイクロフィルシリンジ針を用いて、パッチピペットの半分までアンフォテリシン含有カリウムイオン内部液を満たします。パッチクランプ記録を可能にするため、このピペットをパッチクランプアンプリファイアのヘッドステージに固定します。まず、電極を空気・溶液界面から通過させて、細胞付近の記録皿の底部まで降ろしながら、正圧をかけます。次に、電極を状態の良い細胞に対して垂直に配置します。電極が十分に近づき、流出する溶液によって細胞が遠ざかり始めたら、すぐに圧力を反転させ、電極内にわずかな真空状態を作り出し、細胞が電極に吸い寄せられるようにします。電極の吸引を直ちに停止し、細胞との間にギガオームシールを形成させます。電極に10 millivoltsの反復的な過分極電圧ステップを印加し、容量性電流の過渡応答を観察します。過渡応答の大きさが最大になるまで、アンフォテリシンによって誘導される膜穿孔のモニタリングを継続します。健康な細胞において穿孔パッチ構成が確立されたことを確認するため、過分極および脱分極の電位ステップを適用して、電位依存性電流を誘発させます。ほとんどの有毛細胞は、持続的な脱分極中に急速に不活性化する顕著な外向き電流を持っています。この図は、脳を除去した後の脳ケースの腹側部分を示しています。骨のボウル状の部分を除去した後、tulo、genus、sculliに関連する耳石、および2つの卵形嚢に関連する耳石が、それらを覆う薄い骨を通して確認できます。耳石が存在することで、迷路の位置を特定するのに役立ちます。図の破線は、左迷路のおおよその外周を示しています。迷路が単離されると、嚢囊、球囊、および半円管などの聴覚および前庭末端器官を識別することができます。図はこれらの構造の位置を示しており、A、B、Cは半円管です。Dは球囊、Eは嚢囊、fはleginaです。毛細胞の形態の多様性は、この耳嚢（lega）から単離された細胞の図に顕著に表れています。細胞はおおよそ、細長い形状かアボカドのような形状の2つのクラスに分類されます。対照的に、健全な細胞は位相差で明るく見え、輪郭が鮮明で、毛束がはっきりと確認できます。挿入図Bに示されている死細胞は、顆粒状の黒い外観を呈しています。この図は、保持電位を-70 millivoltsとし、-140 millivoltsから+70 millivoltsまで10 millivolt刻みで印加した3回の電位ステップに対する細胞の平均応答を示しています。不活性化電流がより脱分極した電位で現れていることに注目してください。習得すれば、処法の開始からわずか 90 分後には電気生理学的記録を開始することができます。さらに、3段階目のステップを遅らせ、終末器官をBS溶液中で保持すれば、解剖開始から最大 4 時間後まで健全な細胞を得ることが可能です。この調製法を、広く利用可能なゼブラフィッシュの遺伝的変異と組み合わせることで、聴覚不均衡のメカニズムの根底にある分子要因を調査するためのユニークなモデルシステムを提供します。

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

幼虫ゼブラフィッシュは、脊髄運動ニューロンとターゲット骨格筋からの同時パッチクランプ記録を可能にした最初の脊椎動物のモデルシステムを表す。このビデオでは、分節キャップ運動ニューロンと標的筋細胞と同様に各セルのタイプから録音するための方法論を識別するために使用される微細な方法を示しています。...

モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

哺乳類の蝸牛の内有毛細胞のリボンシナプスにおける聴覚神経線維の樹状突起からのホールセルパッチクランプ記録。...

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚におけるマウトナーニューロンおよび他の細網脊髄細胞の電気的特性を研究する方法である、全細胞パッチクランプ電気生理学と呼ばれる技術を説明しています。...

全細胞パッチクランプ電気生理学:ニューロンの電気的特性を研究する方法

このビデオは、麻痺したゼブラフィッシュの幼生の求心性ニューロンからの電気信号の記録を、側線神経節の近くにマイクロピペットを配置し、信号捕捉のための緩いシールを形成する方法を示しています。細胞外溶液は、この過程でニューロンの生存率を維持します。...

動けなくなったゼブラフィッシュ幼生における求心性ニューロンからの電気信号のモニタリング

このビデオでは、内耳感覚ニューロン細胞体のイオン電流を測定するためのパッチクランプ技術を示しています。アムホテリシンBを含む内部溶液を充填した研磨パッチクランプピペットの調製と使用について詳しく説明します。このピペットは、メンブレンに穴を開けて、細胞内状態を維持しながらイオンを移動できるようにします。電圧パルスは、イオンチャネルの活動をトリガーおよび記録するために印加され、その特性と挙動に関する洞察を提供します。...

穿孔パッチクランプによる内耳感覚ニューロン細胞体の記録

出典: Lukasz, D., et al.ゼブラフィッシュ幼生における側線有毛細胞のin vivoカルシウムイメージングJ. Vis.

ゼブラフィッシュ幼生の側線有毛細胞におけるカルシウム動態のイメージング

ゼブラフィッシュ幼生前脳における細胞外電場電位を記録するためのシンプルな方法が記載されている。方法は、堅牢を提供...

ゼブラフィッシュ幼生における前脳電気生理学的記録

私たちは、ゼブラフィッシュ胚におけるマウスナーニューロンや他の網様体細胞からパッチクランプ記録を経由して電気的活動を記録し、監視するための完全な脳脊髄準備を開発しました。従って、我々は、発生中の胚における主要ニューロンから興奮性と抑制性シナプス電流、電位依存性チャネル活性および活動電位を記録することができる。...

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

この原稿は、ゼブラフィッシュの胚および幼生の脊髄神経細胞からの電気生理学的記録のための方法を説明します。準備は、 その場で神経細胞を維持し、多くの場合、最小の切開を必要とします。これらのメソッドは、最初の電気的興奮の買収からの早期の幼虫の段階を経て、脊髄神経細胞の様々な電気生理学的研究が可能になります。...

ゼブラフィッシュ<em&gt;その場での</em&gt;脊髄脊髄感覚運動ニューロンからの電気生理学的記録のための準備

このプロトコルは、生後ラットの聴性脳幹反応を記録する方法を説明します。外有毛細胞の機能の発達を調べると、全細胞パッチク ランプ分離外有毛細胞内記録の実験の手順がステップバイ...

聴性脳幹反応と生後ラットの外有毛細胞細胞パッチ ・ クランプ記録

ゼブラフィッシュは、光学的透明度、急速な外部の開発を含む多くの貴重な機能を持ち、聴力と平衡感覚のフィールドに、特定の重要な感覚の有毛細胞に位置する外部モデル システムです。この資料について説明どのようにトランスジェニックゼブラフィッシュ...

ゼブラフィッシュ稚魚における側線有毛細胞の生体内カルシウム イメージング

学ぶゼブラフィッシュ内耳有毛細胞のパッチクランプ記録法。聴覚・平衡覚器官から健康な細胞を単離し、電位依存性イオンチャネルの生物理学的特性を解析する手法です。遺伝学的操作が可能なモデル生物を用い、神経伝達物質放出機構の理解に貢献します。

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

さらに動画を探す