Name: 病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶマウス心臓組織からのクロマチン結合タンパク質の分離法。定量ラベルフリー質量分析を用いて、心疾患における核プロテオームの動態を解析し、心臓生理学におけるタンパク質の役割を理解する。

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VondriskaラボはNIHやUCLAのLaubisch基金の国立心肺血液研究所からの助成金によってサポートされています。 EMは、UCLAの生理学のジェニファーS. Buchwaldの大学院奨学金の受取人である; HCは、アメリカ心臓協会の事前博士フェローシップの受賞者です、MPは、NIHルースキルシュシュタインポスドクフェローシップの受信者であり、SFはの受信者であるNIHのK99賞。

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<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
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<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
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特別な利害関係は宣言されません。

核の単離のための2つの主な方法は、以前に検討されている：27 1は、水性スクロース/塩溶液中で組織を均質化する非水系溶媒に凍結乾燥組織を均質化するベーレンス技術そして第二に、我々はここで使用しているかに変更、です続く差動または密度勾配遠心分離による。 組織サンプルの酸抽出による核の亜分画は、ヒストンを分析するためにある本来の目的で1960年、28日から使用されてきたクロマチンを研究するための重要なツールです。酸抽出プロトコルがコアヌクレオソームのヒストン成分を精製する、この目標のために開発されました29、これらの先行研究の限界は、クロマチンを構成および変更非ヒストンタンパク質に関する情報の欠如であり、我々は現在のプロトコルを使用して、この課題に対処してきた核とクロマチンの異なる生物学的亜分画を特徴付ける。並行して、界面活性剤抽出やクロマチンの酸抽出を使用するこのアプローチは、クロマチン調節分子の多様性を明らかにし、それによって仮説生成のための堅牢なアプローチとして、内因性制御のレベルを区別します。 <p cl...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> Dulbeco改変イーグル培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 11965 </td></tr><tr><td>プロテアーゼペレット</td><td>ロッシュ</td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100μmのストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracutミクロトーム</td><td>ライヘルト</td><td></td></tr><tr><td> 100CX透過電子 顕微鏡</td><td> JEOL USA社</td><td></td></tr><tr><td>コウライウグイス</td><td> BioRad社</td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td>ヒストンH2A抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC-8648 </td></tr><tr><td>ヌクレオポリンP62抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 610498 </td></tr><tr><td>アデニンnucleo潮トランスポーター抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC-9299 </td></tr><tr><td> BiPの抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC-1050 </td></tr><tr><td>チューブリン抗体</td><td>シグマ</td><td> T1568 </td></tr><tr><td>ヒストンH3抗体</td><td>アブカム</td><td> ab1791 </td></tr><tr><td>フィブリラリン抗体</td><td>細胞シグナリング</td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70抗体</td><td>アブカム</td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td> MS-879 </td></tr><tr><td>網膜芽細胞腫の抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 554136 </td></tr><tr><td>低酸素誘導因子-1抗体</td><td>ノーバスバイオ</td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCAタンパク質アッセイ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 23227 </td></tr><tr><td>相カラムを反転</td><td>新しいOBJective </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> BioWorksブラウザ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td></tr></tbody></table>

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

核の中でその機能が最も密接な遺伝子調節にリンクされているプロテオームを常駐しています。哺乳類成体心筋細胞核DNAの大部分はヘテロクロマチン状態、相間の永続的な状態にある成人核をレンダリングする心筋細胞の非分裂性質1、二核細胞の割合が高いのために独特である。2転写調節は、開発時とこの病気は、このオルガンでよく研究されて3月5日が、何が比較的未開拓のままでは、DNAのパッケージングおよび発現に関与する核タンパク質が果たす役割であり、どのように病気の経過中に生じる転写プログラムにおけるこれらのタンパク質制御の変更。開発した6世界では、心臓病は、男性と女性両方のため死亡原因の第1位です。核タンパク質は、この病気の進行を調節するために協力する方法について7 Insightは、現在の治療oを進めるために重要であるptions。 質量分析法は、それが病気とどのようにこれらのタンパク質の量が変化するため、核プロテオームと相対定量の公平な注釈を可能として、これらの質問に対処するための理想的なツールです。最近まで哺乳類の核タンパク質複合体、8月13日にいくつかのプロテオミクス研究がなされているものの14は、心臓核プロテオームを調べるだけで一つの研究がなされており、それはむしろ核サブコンパートメントのレベルでプロテオームを探索するのではなく、核全体を考慮15大部分では、仕事のこの不足は、心臓核を単離することが困難なためである。心臓核が筋収縮を変化させるが、その全体的な形状図16はさらに、心筋細胞は17巻までに40％ミトコンドリアである限り、彼らは小胞体からの複数の拡張子を介して接続されている硬質かつ緻密なアクチン-ミオシン装置内で発生するnecessita他の細胞小器官は別に核の濃縮をTES。ここでは、心臓の核濃縮と生物学的に関連したコンパートメントにさらに分別するためのプロトコルを記述します。さらに、代謝標識が不可能な様々な動物モデルや器官系を用いたin vivo実験で影響を受けやすいこれらの画-技法のラベルフリー定量的質量分析解離の詳細メソッド。

図4は、相対定量のこの形式の有用性を強調しています。左側のパネルに表示されているタンパク質HMGB1（データベース検索を経由して識別される）に属するものとして指定されている個々のモノペプチドのピークは（異なるマウスから重ねて）である。各ピークは、本質的に与えられたペプチドの抽出イオンクロマトグラフは、異なるマウスから来ている。 3生物学的なグループごとに複製して、基底、心肥大、心不全：グループは、3つの異なる生理状態を表す。曲線の下の面積を積分することにより、相対的な存在量を計算することができます。中央のパネルでこれらの存在量の平均値が示されています。それは、HMGB1タンパク質の存在量は、疾患の経過中に変化していることがこのタイプの分析からも明らかである。これとは対照的に、下部のパネルは、病気では変更されませんヒストンH4の一例を示す。両方の場合において、ペプチドは同じphenotの動物から来るypic状態は、サンプル調製およびLC / MS / MSの再現性を実証し、同様の溶出プロファイルと相対的な豊かさを示しています。 この手法の再現性をさ...

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト疾患のモデル。

核内には、遺伝子調節と最も密接に関連する機能を担うプロテオームが存在します。成体哺乳類心筋細胞の核は、...という点において特異的です。

この手順の全般的な目的は、マウス心臓からクロマチン結合タンパク質を単離することです。まず心臓をホモジナイズし、次にショ糖密度勾配により心筋核を単離することでこれを達成します。その後、核質をクロマチン画分から分離します。次に、クロマチンペレットからタンパク質を抽出し、DNAに緩く結合しているタンパク質を濃縮します。最後に、別のクロマチンペレットからタンパク質を抽出し、DNAに強固に結合しているタンパク質を濃縮します。最終的に、定量的ラベルフリー質量分析により、異なる生理的条件下における核プロテオームの特徴を示す結果を得ることができます。この手法は、クロマチンリモデリングが心肥大や心不全にどのように寄与しているかなど、心臓領域における重要な疑問を解決するのに役立ちます。成マウスを安楽死させて心臓を摘出した後、氷冷PBSで洗浄します。次に、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物を含む2 mLのリシスバッファーを入れたガラス容器に心臓を入れ、ホモジナイズします。ライセートを100 µmのストレーナーでろ過し、ろ液を1.5 mLチューブに回収します。特に指定がない限り、以降はサンプルを氷上で保持してください。サンプルを4 °Cで4,000 RPMにて5分間遠心分離します。細胞質を含む上清を回収し、-80 °Cで保存します。200 µLの溶解バッファーでペレットを再懸濁します。新しいチューブに1 mLのスクロースバッファーを加え、転送ピペットを用いて再懸濁したペレットをスクロースパッドの上に静かに重ねます。4 °Cで5,000 RPMにて10分間遠心分離します。最上層の薄いフィルムと、メンブレンを含むスクロースパッドを取り除きます。核を含む残りのペレットを200 µLの氷冷PBSE-DT Aで洗浄し、核を含むペレットを200 µLの界面活性剤抽出バッファーに懸濁させ、サンプルを10秒間2回ボルテックスします。サンプルを氷上で10分間静置した後、4 °Cで13,000 RPMにて5分間遠心分離します。核質タンパク質を含む上清を除去し、-80 °Cで保存します。ペレットを氷冷したPBSE-DTBAで洗浄し、300 µLのTris-SDS-EDTAバッファーに再懸濁します。サンプルを10秒間、3〜6回超音波処理します。DNAを断片化するため、超音波処理の間はサンプルを氷上に保持し、4 °Cで13,000 RPMで5分間遠心分離します。分離したタンパク質を含む上清を保持し、-80°Cで保存して、DNAに強固に結合しているヒストンなどのタンパク質を濃縮します。ラットの心臓または心筋細胞から、染色体を単離するための別の分画を行います。クロマチンペレットを400 µLの0.4 N硫酸で磨砕し、ボルテックスします。凝集塊を除去するため、サンプルを4°Cで30分間または一晩回転させ

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Medicine

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ここでは、ヒストン結合ドメインが異なるタンパク質アイソフォームのゲノムワイド位置解析のためのクロマチン免疫沈降（ChIP）の手順を提示している。我々はKDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素の標的を同定するためのChIP -...

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

クロマチン結合タンパク質のシーケンシャル塩抽出は大きい蛋白質の複合体の結合特性を決定するための便利なツールです。このメソッドは、個々...

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq...

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム...

腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

これ以降のプロテオーム解析の架橋クロマチンのシーケンス固有のキャプチャに依存する特定のターゲット遺伝子の新規 DNA...

交配の適応は哺乳類細胞プロテオミクスのクロマチン関連タンパク質の捕捉します。

我々は、三次元クロマチン相互作用を用いてゲノム全体の関連研究(GWAS)によって同定される非コード変異体の機能的影響を同定するプロトコルを提示する。...

クロマチン構成の計算解析を用いたアルツハイマー病変異体の標的遺伝子へのマッピング

このプロトコルは、スナップ凍結組織からのクロマチン調製に焦点を当てており、架橋クロマチン免疫沈降(X-ChIP)とそれに続く定量的PCR分析(X-ChIP-qPCR)または次世代シーケンシングアプローチ(X-ChIP-seq)のいずれかに適しています。...

クロマチン免疫沈降分析のための凍結キメラ肝臓組織からのクロマチン抽出

定量的PCRを用いて、我々は十分に確立されたニワトリCAMモデルは定量的に遠隔臓器へのヒト腫瘍細胞の転移を分析するために使用できる方法を示します。...

鳥類胚のモデルを使用して、がんの転移の定量的解析

学ぶマウス心臓組織からのクロマチン結合タンパク質の分離法。定量ラベルフリー質量分析を用いて、心疾患における核プロテオームの動態を解析し、心臓生理学におけるタンパク質の役割を理解する。

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

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