Name: 病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: 学ぶマウス心臓組織からのクロマチン結合タンパク質の分離法。定量ラベルフリー質量分析を用いて、心疾患における核プロテオームの動態を解析し、心臓生理学におけるタンパク質の役割を理解する。

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VondriskaラボはNIHやUCLAのLaubisch基金の国立心肺血液研究所からの助成金によってサポートされています。 EMは、UCLAの生理学のジェニファーS. Buchwaldの大学院奨学金の受取人である; HCは、アメリカ心臓協会の事前博士フェローシップの受賞者です、MPは、NIHルースキルシュシュタインポスドクフェローシップの受信者であり、SFはの受信者であるNIHのK99賞。

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<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
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<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
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特別な利害関係は宣言されません。

核の単離のための2つの主な方法は、以前に検討されている：27 1は、水性スクロース/塩溶液中で組織を均質化する非水系溶媒に凍結乾燥組織を均質化するベーレンス技術そして第二に、我々はここで使用しているかに変更、です続く差動または密度勾配遠心分離による。 組織サンプルの酸抽出による核の亜分画は、ヒストンを分析するためにある本来の目的で1960年、28日から使用されてきたクロマチンを研究するための重要なツールです。酸抽出プロトコルがコアヌクレオソームのヒストン成分を精製する、この目標のために開発されました29、これらの先行研究の限界は、クロマチンを構成および変更非ヒストンタンパク質に関する情報の欠如であり、我々は現在のプロトコルを使用して、この課題に対処してきた核とクロマチンの異なる生物学的亜分画を特徴付ける。並行して、界面活性剤抽出やクロマチンの酸抽出を使用するこのアプローチは、クロマチン調節分子の多様性を明らかにし、それによって仮説生成のための堅牢なアプローチとして、内因性制御のレベルを区別します。 <p cl...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> Dulbeco改変イーグル培地</td><td>インビトロジェン</td><td> 11965 </td></tr><tr><td>プロテアーゼペレット</td><td>ロッシュ</td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100μmのストレーナー</td><td> BDファルコン</td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracutミクロトーム</td><td>ライヘルト</td><td></td></tr><tr><td> 100CX透過電子 顕微鏡</td><td> JEOL USA社</td><td></td></tr><tr><td>コウライウグイス</td><td> BioRad社</td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td>ヒストンH2A抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC-8648 </td></tr><tr><td>ヌクレオポリンP62抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 610498 </td></tr><tr><td>アデニンnucleo潮トランスポーター抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC-9299 </td></tr><tr><td> BiPの抗体</td><td>サンタクルス</td><td> SC-1050 </td></tr><tr><td>チューブリン抗体</td><td>シグマ</td><td> T1568 </td></tr><tr><td>ヒストンH3抗体</td><td>アブカム</td><td> ab1791 </td></tr><tr><td>フィブリラリン抗体</td><td>細胞シグナリング</td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70抗体</td><td>アブカム</td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1抗体</td><td>サーモフィッシャー</td><td> MS-879 </td></tr><tr><td>網膜芽細胞腫の抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 554136 </td></tr><tr><td>低酸素誘導因子-1抗体</td><td>ノーバスバイオ</td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCAタンパク質アッセイ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 23227 </td></tr><tr><td>相カラムを反転</td><td>新しいOBJective </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> BioWorksブラウザ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td></tr></tbody></table>

病におけるクロマチンプロテオームの定量的解析

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

核の中でその機能が最も密接な遺伝子調節にリンクされているプロテオームを常駐しています。哺乳類成体心筋細胞核DNAの大部分はヘテロクロマチン状態、相間の永続的な状態にある成人核をレンダリングする心筋細胞の非分裂性質1、二核細胞の割合が高いのために独特である。2転写調節は、開発時とこの病気は、このオルガンでよく研究されて3月5日が、何が比較的未開拓のままでは、DNAのパッケージングおよび発現に関与する核タンパク質が果たす役割であり、どのように病気の経過中に生じる転写プログラムにおけるこれらのタンパク質制御の変更。開発した6世界では、心臓病は、男性と女性両方のため死亡原因の第1位です。核タンパク質は、この病気の進行を調節するために協力する方法について7 Insightは、現在の治療oを進めるために重要であるptions。 質量分析法は、それが病気とどのようにこれらのタンパク質の量が変化するため、核プロテオームと相対定量の公平な注釈を可能として、これらの質問に対処するための理想的なツールです。最近まで哺乳類の核タンパク質複合体、8月13日にいくつかのプロテオミクス研究がなされているものの14は、心臓核プロテオームを調べるだけで一つの研究がなされており、それはむしろ核サブコンパートメントのレベルでプロテオームを探索するのではなく、核全体を考慮15大部分では、仕事のこの不足は、心臓核を単離することが困難なためである。心臓核が筋収縮を変化させるが、その全体的な形状図16はさらに、心筋細胞は17巻までに40％ミトコンドリアである限り、彼らは小胞体からの複数の拡張子を介して接続されている硬質かつ緻密なアクチン-ミオシン装置内で発生するnecessita他の細胞小器官は別に核の濃縮をTES。ここでは、心臓の核濃縮と生物学的に関連したコンパートメントにさらに分別するためのプロトコルを記述します。さらに、代謝標識が不可能な様々な動物モデルや器官系を用いたin vivo実験で影響を受けやすいこれらの画-技法のラベルフリー定量的質量分析解離の詳細メソッド。

図4は、相対定量のこの形式の有用性を強調しています。左側のパネルに表示されているタンパク質HMGB1（データベース検索を経由して識別される）に属するものとして指定されている個々のモノペプチドのピークは（異なるマウスから重ねて）である。各ピークは、本質的に与えられたペプチドの抽出イオンクロマトグラフは、異なるマウスから来ている。 3生物学的なグループごとに複製して、基底、心肥大、心不全：グループは、3つの異なる生理状態を表す。曲線の下の面積を積分することにより、相対的な存在量を計算することができます。中央のパネルでこれらの存在量の平均値が示されています。それは、HMGB1タンパク質の存在量は、疾患の経過中に変化していることがこのタイプの分析からも明らかである。これとは対照的に、下部のパネルは、病気では変更されませんヒストンH4の一例を示す。両方の場合において、ペプチドは同じphenotの動物から来るypic状態は、サンプル調製およびLC / MS / MSの再現性を実証し、同様の溶出プロファイルと相対的な豊かさを示しています。 この手法の再現性をさ...

質量分析法の進歩により、組織の宿主におけるタンパク質発現および変更のハイスループット解析を可能にした。細胞下分画と疾患モデルと組み合わせることで、定量的質量分析法とバイオインフォマティクス、生物学的システムに新しい特性を明らかにすることができます。本明細書に記載される方法は、心臓病の設定でクロマチン関連タンパク質を解析し、他に容易に適用可能である<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト疾患のモデル。

核内には、遺伝子調節と最も密接に関連する機能を担うプロテオームが存在します。成体哺乳類心筋細胞の核は、...という点において特異的です。

この手順の全般的な目的は、マウス心臓からクロマチン結合タンパク質を単離することです。まず心臓をホモジナイズし、次にショ糖密度勾配により心筋核を単離することでこれを達成します。その後、核質をクロマチン画分から分離します。次に、クロマチンペレットからタンパク質を抽出し、DNAに緩く結合しているタンパク質を濃縮します。最後に、別のクロマチンペレットからタンパク質を抽出し、DNAに強固に結合しているタンパク質を濃縮します。最終的に、定量的ラベルフリー質量分析により、異なる生理的条件下における核プロテオームの特徴を示す結果を得ることができます。この手法は、クロマチンリモデリングが心肥大や心不全にどのように寄与しているかなど、心臓領域における重要な疑問を解決するのに役立ちます。成マウスを安楽死させて心臓を摘出した後、氷冷PBSで洗浄します。次に、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤混合物を含む2 mLのリシスバッファーを入れたガラス容器に心臓を入れ、ホモジナイズします。ライセートを100 µmのストレーナーでろ過し、ろ液を1.5 mLチューブに回収します。特に指定がない限り、以降はサンプルを氷上で保持してください。サンプルを4 °Cで4,000 RPMにて5分間遠心分離します。細胞質を含む上清を回収し、-80 °Cで保存します。200 µLの溶解バッファーでペレットを再懸濁します。新しいチューブに1 mLのスクロースバッファーを加え、転送ピペットを用いて再懸濁したペレットをスクロースパッドの上に静かに重ねます。4 °Cで5,000 RPMにて10分間遠心分離します。最上層の薄いフィルムと、メンブレンを含むスクロースパッドを取り除きます。核を含む残りのペレットを200 µLの氷冷PBSE-DT Aで洗浄し、核を含むペレットを200 µLの界面活性剤抽出バッファーに懸濁させ、サンプルを10秒間2回ボルテックスします。サンプルを氷上で10分間静置した後、4 °Cで13,000 RPMにて5分間遠心分離します。核質タンパク質を含む上清を除去し、-80 °Cで保存します。ペレットを氷冷したPBSE-DTBAで洗浄し、300 µLのTris-SDS-EDTAバッファーに再懸濁します。サンプルを10秒間、3〜6回超音波処理します。DNAを断片化するため、超音波処理の間はサンプルを氷上に保持し、4 °Cで13,000 RPMで5分間遠心分離します。分離したタンパク質を含む上清を保持し、-80°Cで保存して、DNAに強固に結合しているヒストンなどのタンパク質を濃縮します。ラットの心臓または心筋細胞から、染色体を単離するための別の分画を行います。クロマチンペレットを400 µLの0.4 N硫酸で磨砕し、ボルテックスします。凝集塊を除去するため、サンプルを4°Cで30分間または一晩回転させます。インキュベーション後、4°Cで16,000 Gで10分間遠心分離し、核のデブリを除去します。上清を新しいチューブに移し、132 µLのトリクロロ酢酸をサンプルに滴下します。チューブを数回反転させ、氷上で30分間インキュベートします。遠心分離後、上清を廃棄し、氷冷アセトンを用いてヒストンを含むペレットを優しく洗浄し、再び遠心分離を行います。再び、アセトンでの洗浄を繰り返し、ペレットを風乾させた後、100 µLのTris-SDS-EDTA緩衝液で再懸濁します。1 M Trisを用いてpHを8に調整してください。サンプルをウォーターバスで15分間超音波処理します。サンプルを-80°Cで保存します。質量分析を用いて分析を行い、純度の決定およびここに示したタンパク質の同定を行います。HMGB1タンパク質にマッピングされた単一ペプチドの、抽出イオンクロマトグラムの重ね合わせ。各クロマトグラムは異なるクロマチンサンプルから得られたものであり、サンプル採取時のマウスの生理学的状態を表すように色分けされています。基底状態、心肥大、および心不全の各生理学的条件について3つの生物学的レプリケートを解析し、各サンプルを2回ずつ解析したため、計18本のクロマトグラムが得られました。曲線下の面積を積分することで、各レプリケートの相対的な存在量を決定できます。このパネルでは、3つの生理学的条件それぞれについて6つのレプリケートの平均値を算出し、全体の存在量を示しています。この解析から、ここに見られるように、疾患の経過中にHGB oneの存在量が変化することが明確に分かります。このペプチドのフラグメンテーションスペクトルにより、そのアミノ酸配列が確認され、H MG B one タンパク質へのマッピングが可能になります。対照的に、ヒストン H four タンパク質由来の別のペプチドを定量したところ、その存在量は疾患に伴い変化しないことが示されました。異なる生理的状態の間で観察されるペプチド存在量の変化の再現性は、統計解析を用いて分析することができます。まず、各レプリケートで同定されたすべてのペプチドの量について分散分析（ANOVA）を行い、続いて主成分分析（PCA）を実施します。このプロットにおいて技術的レプリケートと生物学的レプリケートの両方がクラスターを形成していることは、質量分析によって検出された量の変化が、異なる疾患状態で一貫しており、再現性があることを裏付けています。基底状態を青、肥大状態を赤、心不全状態を緑で示しています。結果の定量性と再現性と同様に重要なのが、核サブフラクショネーションによって可能となった核プロテオームのカバレッジ向上です。この図は、核全体のみを解析した場合、各コンパートメントを個別に解析して組み合わせた際に同定される核タンパク質の過半数さえも明らかにできないことを示しています。さらに、異なる画分間の適度な重複は、核機能や遺伝子調節に関するさらなる知見を得るために、これらのコンパートメントを個別に検討することの生物学的な妥当性を証明しています。最後に、酸抽出または界面活性剤抽出による染色体の特異的な分画を行うことで、ヒストンなどの主要なクロマチン構造タンパク質を濃縮できます。これにより、各バリアントやアイソフォームに対する特異的な抗体を必要とせずに、特定のタンパク質群に焦点を絞った質量分析が可能になります。この手順を実施する際は、質量分析計で解析するすべてのサンプルにおいて、ケラチンの混入を防ぐことが重要です。これは、タンパク質単離後の後続のステップにおいて特に重要です。

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