Name: の飼育とインジェクションたばこスズメガ幼虫 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 学ぶManduca sexta幼虫の飼育と細菌直接注入法による病原性評価。昆虫モデルを用いて細菌の毒力を測定し、宿主と病原体の相互作用を解析する実験手法を解説します。

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このプロトコルの開発への貢献のためにサマンサオーチャード、キンバリーコールズ、エリンハーバート·チャン、グレッグ·リチャーズ、ミーガンメナード、とヨンジンパーク：筆者らはグッドリッチ·ブレアラボの過去のメンバーに感謝したいと思います。この作品は、全米科学財団の助成金、IOS-0950873と健康NRSAフェローシップFAI084441Zの国立研究所によって資金を供給された。

1。虫卵の殺菌と飼育<ol><li> 900-1,000 mlのH 2 Oで提供寒天の最初のオートクレーブ15グラムで食事を準備します直後によく研究室ブレンダーで166グラムの小麦胚芽食とブレンドしたオートクレーブ、ミックス。 4でアルミ箔にダイエットを転送し、冷却するための皿（または皿）に注ぎ、しっかりとラップし、℃で保存</li><li>到着時には、Mを殺菌する時々かき混ぜながら90ミリメートルろ紙ガラスフィルターホルダー及び真空フラスコ装置では、2〜3分間0.6％漂白剤溶液の250mlでsextaの卵。 </li><li>洗浄あたり250ミリリットル滅菌蒸留H 2 Oで3-4回漂白剤溶液を排出し、卵を洗うために真空をオンにします。 </li><li>ペトリ皿のふたに入れ新鮮な90ミリメートルろ紙に卵を移し、それらを一緒に彼らはもはや棒になるまで乾燥させます（約20〜30分）。 </li><li>各コンテナに約40個の卵を置いて、昆虫食とプラスチック容器の底に卵を移す（ 図1A）。卵は湿気によって真菌汚染を防ぐために食事から分離されています。 8時間暗の光周期：16時間明、26で卵℃を維持する。卵が孵化する前に、黄白色に明るくなります。 </li><li>孵化が完了したら、慎重に底のダイエット（ 図1B）を使用して新しい容器にそれぞれ約25幼虫を移す。その壊れやすい初期の発達段階の間にそれらを傷つけることを避けるためにピンセットを使用して、長い黒のホーンによって各幼虫をピックアップすることが重要です。上記のように2日間インキュベートする。幼虫の死は、この段階では珍しいですが、いくつか死んでいるか、可能性が高く、発達発育を妨げられた幼虫が観察されることがあります。このような昆虫は、さらなる研究から除外され、凍結によって犠牲にされるべきである。 </li><li>共食い行動を回避するために、食品の小さな断片（ 図1C）を使用して個々の容器に幼虫を移し、上記のようにインキュベートする。昆虫の開発を監視し、食品を交換し、洗浄糞は、OUコンテナのトン隔日彼らは第三幼虫の脱皮を（通常は孵化後6-9日）を受けるまで。これは昆虫の体（ 図1D）に沿って各腹脚とストライプの増加目立つ上に黒いフック状crochetsの外観が特徴、 第 4齢幼虫の段階である。幼虫は大きさにかなりばらつきがあるが、典型的には、 第 4齢期に入ったときに0.15〜0.4グラムの重量を量ることができる。同様の大きさの幼虫が注射のために選択されるべきである。 </li></ol> 2。注射用細菌の調製<ol><li>テストしたい成長期に標準的な手順に従って、テストする細菌株（s）を育てる。 </li><li>各菌株のペレットを500μlの室温で13,000 rpmで遠心機で2分間回転させて試験する。 </li><li> 1ミリリットル滅菌1Xリンに再懸濁した細胞は、上記のように、再び緩衝生理食塩水（PBS）とペレット。 </li><li> 0.5ミリリットル滅菌1×PBSおよびMEAで細胞を再懸濁懸濁液の光学密度（OD）を確認してください。必要であれば、同じODにすべての懸濁液を希釈します。必要に応じて滅菌増殖培地はまた、1X PBSの代わりにセルの再懸濁および希釈に使用することができる。 </li></ol> 3。 第 4齢幼虫の注入<ol><li>各希釈のための新鮮なピペットチップ（ 図2A）を使用して滅菌1X PBSで96ウェルマイクロタイタープレートの6ウェルの最初の菌株の連続10倍希釈液を準備します。各ウェル中の細胞懸濁液の最終容量は注入（昆虫あたり10μl）を加えたプレートに20μlの接種（ステップ3.2および3.7を参照）に必要な量を超えている必要があります。 </li><li>適切な増殖培地を含むペトリプレートの上部に沿ってスポット10μlを各5段階希釈（10 -6 10〜-2）用。スポットが中心（ 図2B）に広がるように、板を傾けてください。 </li><li>氷の上の容器における昆虫食と糞便や場所の昆虫を削除約5分。 </li><li>滅菌H 2 O（ 図2C）の1管に続いて70から100パーセントのエタノールの2管で3回ずつ洗浄することによって注射針を消毒する。液体の体積は水没針に十分でなければならない。 </li><li>血球計数器を用いて顕微鏡下で希釈細胞懸濁液を定量する。接種希望に応じて、適切なマイクロタイターウェル（ 図2D）から10μlを描く。 </li><li>綿棒は、昆虫の95％エタノールで表面、および腹部prolegsの一つ後ろに角度（45°未満）で昆虫に10mlの細胞懸濁液を注入します。穿刺腸をしないように注意するとちょうど表皮層（ 図2E）の下に内容を注入します。体液の一部喪失（透明、緑、青の液体）が正常であるが、注射部位から出現する粒子状物質と黄色の液体が腸内穿刺の指標である。この問題が発生した場合は、昆虫を犠牲にして再新しい幼虫を得るそれを置く。 </li><li>最初の注射グループ内の残りの各昆虫のためのステップ3.6を繰り返します。針の滅菌は、汚染が発生しない限り、細菌の同じ希釈率とひずみを注入し、各昆虫の間で必要ではありません。あるいは、繰り返しディスペンサーはサンプル間の注入量でより一貫性のために使用することができる。 </li><li>細菌の最初の株でそれぞれ昆虫を注入した後、今回はプレートの中央に細胞懸濁液をスポッティングし、それらの底部（ 図2F）に向かって流れさせる、ステップ3.2を繰り返します。適切な温度でプレートをインキュベートし、接種を列挙するためにコロニーをカウントします。この第二のめっき工程では、これが第一及び第二のめっきの間に異種のコロニー数をもたらすような試料は、注入工程中に汚染されていないことを確認するために使用されます。 </li><li>繰り返し実験における細菌の各株の3.8を通じて3.1を繰り返します。最後に、マスターを使用して滅菌した1×PBSで3月5日虫を注入陰性対照群としてのILE針。 8時間暗の光周期：16時間明、26℃で昆虫をインキュベートする。 </li><li>注入後の時間をかけて昆虫の生存を監視します。昆虫死が刺激されると随意運動の欠如として特徴付けられる。昆虫はしばしば死亡前に感染中の食欲不振、下痢（水様、黄色の排泄物）、および/または水の損失を（ &quot;発汗&quot;）を示すが、これらの特性は、同様に注目に値するかもしれません。 </li></ol>

<ol><li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

Mの直接注入ここで説明するように昆虫病原細菌とsextaの幼虫は、細菌の病原性を解析するためのシンプルで効果的な手段として機能します。この方法はまた、別の実験対象および/または条件に合わせて高度に適応可能である。細菌は、注射前に、種々の方法で調製する​​ことができる。 Xの場合にはnematophila、中間対数期に栄養豊富なルリア-ベルターニ（LB）培地で増殖させた野生型細胞は注入後に30時間以内にほとんどまたはすべての虫を殺して、通常は最も病原性があります。静止期の細胞はしばしば幼虫を殺すために5月10日より長い時間がかかる。成長期は、病原性に影響を与えていますが、注入された細胞の総数は20から20,000 CFUに至る典型的な接種で、16あまり重要でないように思われる。実際には、XenorhabdusとPhotorhabdus種の場合には、5 CFU限り少ないが昆虫宿主17を殺すのに十分である。病原propeを評価するために、エタノール消毒（ 例えばバチルス種）...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 90ミリメートルろ紙</td><td>ワットマン</td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td>ガラスフィルターホルダー</td><td>ミリポア</td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> たばこスズメガ卵</td><td>カロライナ生物サプライ</td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td>マイマイガダイエット+寒天</td><td> MPバイオメディカル</td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5.5オンスプラスチック容器と蓋</td><td>ソロカップカンパニー</td><td> URC55-0090 PL4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1オンスプラスチック容器と蓋</td><td> DARTコンテナ株式会社</td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137mMのNaCl、2.7mMのKCl、8mMののNa 2 HPO 4、1.46 mMのKH 2 PO 4、pH7.4の</td></tr><tr><td>注射器</td><td>ハミルトン</td><td> 80208 </td><td> 30ゲージ、0.375 &quot;長さ、ポイントスタイル2 </td></tr></tbody></table>

の飼育とインジェクション<em&gt;たばこスズメガ</em細菌毒性を評価するための&gt;幼虫

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

一般的にタバコイモムシとして知られているたばこスズメガは 、タバコやトマトなど、ナス科の植物を食べ、重要な農業害虫と見なされます。 Mの感受性昆虫病原性細菌種の多様1-5、ならびに昆虫の免疫系6から8に関して入手可能な情報の富、および保留中のゲノム配列9〜sextaの幼虫は宿主-微生物相互作用を研究に使用するための優れたモデル生物作る発病時。さらに、M. sextaの幼虫は他の感受性の昆虫種に実験室での相対的に操作し、維持するために比較的大きいと簡単です。それらの大きなサイズも、感染に対する宿主応答の解析のための効率的な組織/体液抽出が容易になります。 ここで紹介する方法は、Mの血体腔内細菌の直接注入（血液空洞）を記述するsextaの幼虫。このアプローチ単に注射後に昆虫の死までの時間を監視することによって、様々な細菌種、株、または変異体の毒性の特性を分析し、比較するために使用できます。このメソッドは、通常、昆虫へのエントリを取得するための手段として、線虫ベクトルと関連付けるXenorhabdusとPhotorhabdus種の病原性を研究するために開発されました。昆虫病原性線虫は、通常、天然の消化器や呼吸器の開口部を介して幼虫に感染し、昆虫の体液（血液）、その後すぐに10にその共生細菌の内容物を放出する。ここで説明した注入法は、このように昆虫に細菌や線虫の影響を脱共役、線虫のベクトルの必要を回避します。この方法は、ニッキング11と経口毒性アッセイ12を含むentomopathogenesisを分析するための他の既存の方法を使用しては不可能である種菌内感染性物質の正確な列挙型（細胞やタンパク質）を可能に<e直接噴射方式は全細胞接種の病原性に対処する一方で、mは&gt;また、経口毒性アッセイは、幼虫の消化器系に導入され、分泌された毒素の病原性に対処します。 ここで説明したように直接注入法の有用性は、昆虫死亡率を監視することにより、細菌の病原性を解析することである。しかし、この方法は簡単にMに感染の影響を研究に使用するために拡張することができますsexta免疫システム。昆虫は体液性および細胞性応答の両方を介して感染に応答します。体液性応答は細菌関連パターンの認識や各種抗菌ペプチドのその後の生産7を含み、これらのペプチドをコードする遺伝子の発現をRNA抽出と定量PCR 13を介して直接感染後に監視することができます。感染に対する細胞応答は根粒形成、カプセル化、および血球6による感染性病原体の食作用を伴う</sup&gt;。これらの応答を解析するために、注入された昆虫を切開し、顕微鏡13,14により可視化することができます。

昆虫死亡率アッセイの代表例を図3に示します。この実験では、昆虫は野生型（ATCC19061）または中間対数期（株当たりn = 6虫）まで成長Xenorhabdus nematophilaの弱毒変異株（LRP 13）のいずれかの約50コロニー形成単位（CFU）を注射した。昆虫は約72時間観察し、各時点でまだ生きて注入された昆虫のパーセントを記録した。このケースでは、弱毒株は、昆虫殺害でクリア遅延を示し、野生型株は前に変異感染幼虫の死に、30時間後に注射内のすべての6幼虫を殺した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4295/4295fig1.jpg" /> 図1注射の準備のために昆虫飼育。 a）約40表面殺菌した卵は、5オンスのカップの底に配置されている不妊虫食はゴム栓の上で休憩。 B）は二十孵化したばかりの昆虫は、下部の不妊虫食と5...

ここで説明する方法は、血体腔に昆虫病原細菌の直接注入を利用<em&gt;たばこスズメガ</em&gt;昆虫の幼虫。<em&gt; M sexta</em&gt;市販されており、よく研究された昆虫です。したがって、この方法は、1つまたは両方のパートナーの視点からホスト細菌の相互作用を分析する簡単な方法を表しています。

タバコガ（学名：Manduca sexta）は、タバコなどのナス科植物を食害するため、重要な農業害虫とみなされています。

この手順の全体的な目的は、モデル生物として manduka seca を用い、昆虫幼虫に対する細菌の病原性を評価することです。まず、滅菌卵から昆虫幼虫を飼育し、発生の第4齢まで成長させます。次に、注射用の細菌サンプルを調製します。次に、細菌を*Manduka seca*の4齢幼虫に注入します。最終ステップとして、注入後、時間の経過に伴う昆虫の死滅をモニタリングします。最終的に、昆虫が死に至るまでの時間を記録し、細菌の毒性を評価します。この手法は、新規の昆虫病原体の発見や、細菌の種または株間における毒性の違いの特定など、共生分野における重要な課題の解決に寄与します。まず、15 gのオーガーを900～1000 mLの水とともにオートクレーブで滅菌します。オートクレーブ処理の直後に、オーガーを用いて、166 gの小麦胚芽ダイエット（wheat germ diet）を混合します。実験用ブレンダーを使用し、混合した昆虫用ダイエットをディッシュに注ぎます。冷却後、ダイエットをディッシュからアルミホイルの上に移動させます。しっかりと包み、4°Cで保存します。届いたら、M sex to eggsを90 mmのフィルターペーパーを入れたガラスフィルターホルダーと真空フラスコの装置に入れます。次に、0.6%漂白剤溶液250 mLを卵に注ぎ、時々撹拌しながら2〜3分間処理します。次に、真空ポンプを作動させて漂白溶液を排出し、滅菌した卵を1回につき250 millilitersの滅菌蒸留水で3～4回洗浄します。次に、新しい90 millimeterのフィルターペーパーをペトリ皿の蓋に置き、卵をそのフィルターペーパーに移して、卵同士がくっつかなくなるまでクリーンベンチ内で乾燥させます。これで、いくつかのプラスチック容器内の固定されたゴム栓の上に、調製したばかりの昆虫飼料を置き、各容器に約40個の卵を移します。この際、水分による真菌汚染を防ぐため、卵を飼料から離して配置してください。卵を26°Cで、明期16時間、暗期8時間の光周期で維持します。孵化が完了すると、卵は孵化前に黄色がかった白色に変化します。ピンセットで各幼虫の長い黒い角を挟み、新しい容器に約25匹ずつ慎重に移します。なお、容器の底には餌を入れておきます。卵と同様の条件下で幼虫を2日間培養します。この段階での幼虫の死亡は稀ですが、死死体や、あるいはより可能性の高いケースとして、発育が遅れた幼虫が観察されることがあります。次に、共食い行動を避けるため、幼虫を少量の餌と共に個別の容器に移し、再び培養します。昆虫が3回目の脱皮を行うまで、1日おきに餌を交換し、容器内の糞を取り除いて清掃してください。3回目の幼虫脱皮後の4齢幼虫期は、各前脚に黒い鉤状のクロシェ（鉤爪）が出現し、虫体の側線がより顕著になることが特徴です。テストしたい目的の細菌株を培養した後、各細菌株500 µLを、室温のマイクロ遠心機にて17,000 ×gで2分間遠心分離します。次に、同じ条件下で、ペレットを1 mLの滅菌PBSで洗浄します。細胞をさらに0.5 mLの滅菌PBSに再懸濁した後、注入を開始する前に懸濁液の吸光度を測定します。希釈ごとに新しいピペットチップを使用し、96ウェルマイクロタイタープレート内で、滅菌PBSを用いて最初の細菌株の10倍段階希釈を6段階作成します。次に、適切な増殖培体を含むペトリ皿の上部に、10⁻²から10⁻⁶までの各希釈液を10 µLずつスポットします。その後、スポットが中心に広がるようにプレートを傾けます。次に、昆虫の餌と糞を除去した後、昆虫を冷却させるため、昆虫容器を約5分間氷上に置きます。注射針を70～100%エタノールが入った2本のチューブでそれぞれ3回ずつすすぎ、その後、滅菌水が入った1本のチューブですすぎます。次に、ヘモサイトメーターを用いて、顕微鏡下で希釈した細胞懸濁液を定量します。目的の接種量に応じて、適切なマイクロタイターウェルから10 µLを吸い取ります。次に、注射する昆虫の表面を95% ethanolで拭き取ります。昆虫を注射に適した位置に保持しながら、針を操作し、かつ昆虫の消化管を穿刺しないように注意することが最も困難な操作となります。また、昆虫を保持して注入している間に、昆虫が温まって身をよじり始めないよう、迅速に作業してください。10 µLの細胞懸濁液を、腹部の後脚の一つ後方から45度未満の角度で昆虫に注入します。腸を穿刺しないように注意しながら、表皮層の直下に内容物を注入してください。各昆虫に1種類目の細菌株を注入した後、再度、10⁻²から10⁻⁶までの希釈液をプレートの中央に播種します。液をプレートの底部に向かって流してください。次に、プレートを適切な温度で培養し、コロニー数を計数して接種菌数を算出します。各細菌株について希釈、播種、および注入の工程を繰り返した後、陰性対照群として3〜5匹の昆虫に滅菌PBSを注入します。次に、すべての昆虫を26 °C、16時間明期・8時間暗期の光周期でインキュベートします。最後に、注入後の昆虫の生存率を経時的にモニタリングします。感染した昆虫は、死亡する前に食欲不振、水様で黄色の下痢、排泄物、および／または水分喪失を示すことがよくあります。昆虫の死は、刺激に対する随意運動の消失として定義されます。本アッセイでは、対数増殖期中期まで培養した野生型または弱毒化変異株のXer Haus NLA groanを、約50 colony forming units注入しました。昆虫を約72時間観察し、各時点における注入昆虫の生存率を記録しました。本実験において、弱毒化株では昆虫の致死に明らかな遅延が見られた一方で、野生型株では、変異株を接種した幼虫が1匹も死に至る前に、接種後30時間以内に6匹すべての幼虫が死滅した。この手順に従った結果、データに統計的な有意差が認められた。細菌が昆虫の免疫応答を操作できるか否かを判断するなど、さらなる疑問を解決するために、RNA抽出や定量リアルタイムPCRなどの他の手法を実施することができる。

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Research

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の飼育とインジェクション

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