の飼育とインジェクションたばこスズメガ幼虫

この手順の全体的な目標は、マンドゥカセカをモデル生物として使用して、昆虫の幼虫に対する細菌の病原性を評価することです。これは、最初に昆虫の幼虫を滅菌卵から発生の第4段階まで育てることによって達成されます。2番目のステップでは、細菌サンプルを注射用に準備します。

次に、細菌を4番目のinstar manduka seca幼虫に注入します。最後のステップでは、昆虫の死 注射後の経時的な経過が監視されます。最終的に、昆虫が死亡するまでの時間が記録され、細菌の病原性を評価するために使用されます。

この方法は、新しい昆虫病原体の発見や、細菌種や菌株間の病原性の違いの決定など、共生分野の重要な側面に対処するのに役立ちます。最初のオートクレーブから始め、900〜1000ミリリットルの水に15グラムのオーガーを入れます。オートクレーブ直後。

オーガーを166グラムの小麦胚芽飼料と混ぜます。実験室のブレンダーで、ブレンドした昆虫食を皿に注ぎます。冷めたら、食事を皿からアルミホイルに移します。

しっかりと包み込み、摂氏4度で保管します。到着したら、M sex to eggsをガラス製のフィルターホルダーと90mmの濾紙付きの真空フラスコ装置に入れます。次に、250ミリリットルの0.6%漂白剤溶液を卵に2〜3分間注ぎ、時々かき混ぜます。

次に、真空をオンにして漂白剤溶液を排出し、滅菌した卵を250ミリリットルの滅菌蒸留水で3〜4回洗浄します。次に、新しい90mmの濾紙をペトリプレートの蓋に入れ、卵を濾紙に移して、卵がくっつかなくなるまでフローフードで乾燥させます。次に、最近準備した昆虫食をいくつかのプラスチック容器の固定ゴム栓の上に置き、約40個の卵を各容器に移し、卵を餌から分離して水分による真菌汚染を防ぎます。

卵を摂氏26度に保ち、16時間の明るい写真撮影、8時間の暗い写真撮影期間で観察します。卵は孵化前に黄白色に明るくなり、孵化が完了します。鉗子を使用して、長い黒い角で各幼虫を拾い上げ、それぞれ約25匹の幼虫を慎重に下部に食事付きの新しい容器に移します。

卵と同じ条件下で幼虫を2日間孵化させますが、この段階では幼虫の死は珍しいですが、死んだ幼虫や発育不全の可能性が高い幼虫が観察される場合があります。次に、幼虫を小さな食物片の入った個々の容器に移して、共食い行動を避け、再び孵化させます。昆虫が3回目の幼虫の脱皮を受けるまで、食物を交換し、隔日で容器から糞便を取り除きます。

3番目の幼虫の脱皮は、各プロレにかぎ針編みのような黒いフックが出現し、昆虫の体に沿った縞模様が目立つようになるのを特徴とする4番目の幼虫期です。テストする所望の細菌株を成長させた後、室温でGの17,000倍のマイクロ遠心分離機で2分間、各細菌株を500マイクロリットルずつスピンダウンします。次に、同じ条件下でペレットを1ミリリットルの滅菌PBSで洗浄します。

滅菌PBSの別の半ミリリットルで細胞を懸濁した後、各希釈のための新しいピペットチップを使用して注射を開始する前に懸濁液の光学密度を測定し、96ウェルマイクロタイタープレートで滅菌PBSの最初の細菌株の6つの連続10倍希釈を調製する。次に、希釈液をそれぞれ10マイクロリットル、10〜マイナス2〜10〜マイナス6のスポットを、適切な成長培地を含むペトリプレートの上部に沿って配置します。次に、スポットが中央に広がるようにプレートを傾けます。

次に、昆虫の餌と糞を取り除いた後、昆虫が冷めている間に昆虫容器を氷の上に約5分間置きます。シリンジ針を70〜100%エタノールの2本のチューブでそれぞれ3回すすぎ、続いて滅菌水のチューブ1本ですすいでください。.次に、ヘモサイトメーターを使用して、希釈した細胞懸濁液を顕微鏡で定量します。

所望の接種材料に応じて、適切なマイクロタイターから10マイクロリットルを引き出します。次に、注入する昆虫の表面に95%エタノールを綿棒で塗ります。注射に適した位置に昆虫を保持することは最も困難ですが、針を操作し、昆虫の腸に穴を開けないように注意します。

また、注射のために昆虫を保持している間に昆虫が温まって身もだえし始めないように、すばやく作業するように注意してください。10マイクロリットルの細胞懸濁液を、腹部のプロレッグの1つの後ろに45度未満の角度で昆虫に注入します。腸に穴を開けないように注意しながら、内容物を表皮層のすぐ下に注入します。

各昆虫に最初の細菌株を注入した後、もう一度、10〜マイナス2〜10〜マイナス6の希釈液をプレートの中央にプレートします。それらをプレートの底に向かって流します。次に、プレートを適切な温度でインキュベートし、コロニーを数えて接種物を列挙します。

菌株ごとに希釈、めっき、注入の工程を繰り返した後、ネガティブコントロール群に対して3〜5匹の昆虫に滅菌PBSを注入します。次に、摂氏26度ですべての昆虫を孵化させ、16時間の明るい8時間の暗い写真撮影期間にします。最後に、昆虫の生存を経時的に監視します 注射後、昆虫はしばしば食欲不振、水様、黄色の下痢、排泄物、および/または水分の損失を示します 感染中に死亡する前に。

昆虫の死は、刺激による随意運動の欠如として特徴付けられます。このアッセイでは、昆虫に、野生型またはXer Haus NLAのうめき声の中期までの弱毒変異株のいずれかの約50コロニー形成ユニットを注入しました。昆虫は約72時間観察され、各時点でまだ生きていた注射された昆虫の割合が記録されました。

この実験では、弱毒化株は昆虫の殺傷に明らかな遅延を示しましたが、野生型株は、変異株に感染した幼虫のいずれかが死亡する前の注射後30時間以内に6匹の幼虫すべてを殺しました。この手順に従うと、データは統計的に異なります。RNA抽出や定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応などの他の方法を実行して、細菌が昆虫の免疫応答を操作できるかどうかを決定するなどの追加の質問に答えることができます。