マウスノロウイルスのプラークアッセイ

この手順の目的は、感染性のあるニューロンノロウイルス粒子の量を定量化することです。まず、ウイルス接種液の10倍希釈系列を調製します。次に、希釈したウイルス接種液をRAW 264.7単層細胞に転移させ、プレートを揺らしながら室温で1時間インキュベートします。

次に、接種物を吸引し、C plaque agarと2XMEMを1:1の比率で混合したオーバーレイを重ね、組織培養インキュベーターで48時間培養します。最後のステップは、ニュートラルレッド染色液をオーバーレイし、組織培養インキュベーターで1〜3時間培養することです。最終的に、agarのオーバーレイを除去せずにニュートラルレッド染色液を慎重に吸引し、ライトボックスを用いてプラークを計数します。

感染性ウイルス粒子の定量を行うこの手法は、糞便中に排出される感染性粒子の量や、どの組織が感染を維持しているかなど、ノロウイルス分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな方は、アッセイ全体を通じて細胞を健康的で生存可能な状態に維持することに苦労します。マウスノロウイルスのプラークアッセイは、経験のない方には理解しにくいため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。

本アッセイを成功させるには、プラークを容易に観察するために、適切な細胞数、正確な温度管理、および精密な操作という一連の手順を積み重ねる必要があります。まず、光学顕微鏡で細胞単層を観察し、細胞の形態を確認します。ほとんどの細胞が円形に見える必要があります。

細胞が過増殖しないように注意してください。通常、過増殖するとプラークが形成されません。murn neurovirusプラークアッセイのため、ほぼコンフルエントな175 cm²組織培養フラスコ内のraw 2 6 4 0.7細胞から培地を吸引し、10 mLの新鮮なDMEM 10を細胞に加えます。次に、セルスクレーパーでフラスコ底面から細胞を剥離させ、10 mLピペットで細胞懸濁液を吸引し、フラスコ底面に向かって噴出させます。この操作を少なくとも3回繰り返し、細胞の凝集塊を分散させます。

ストックフラスコに合わせます。細胞懸濁液を1〜2 mL取り出し、33〜34 mLのDMEM 10を含む新しい175 cm²フラスコに入れます。このフラスコを組織培養インキュベーター内で37 °C、5% carbon dioxideで2〜3日間培養し、再度継代します。

アッセイ用のプレートに播種する際、細胞懸濁液の密度をDMEM 10を用いて1×10⁶ viable cells/mLに調整し、直径3.5 cmの6ウェルプレートの各ウェルにこの懸濁液を2 mLずつ分注してプレートに蓋をします。その後、直ちにプレートを手で10回揺らし、細胞をウェル内に均一に分散させます。

プレートを揺らさないでください。揺らすと、細胞がウェルの中央に凝集してしまいます。その後、細胞を接着させるために、プレートを組織培養インキュベーターに最低4時間、理想的には一晩置きます。ウイルス接種液は、MNV感染させたホモジナイズ組織またはMNV感染マウスの糞便サンプルのいずれかから得ることができます。組織サンプルを使用する場合は、滅菌シリカビーズと1 mLのDMEM 10を含む2 mLネジキャップチューブに、豆粒大の組織片を入れてホモジナイズします。

マグネタイザーを6,000 RPMで1分間使用します。糞便試料を使用する場合は、同様の方法で3個以下の糞便ペレットを均質化し、均質化した試料を−80 °Cで凍結させ、プラークアッセイ当日に接種源を融解させます。リピートピペットを用いて、24ウェルプレートの各ウェルにDMEM fiveを1.35 mLずつ分注し、その後、第3ウイルス接種源0.15 mLをプレートの最初のウェルにピペッティングします。

10⁻¹希釈液を0.15 milliliters分注し、プレートの2番目のウェルに加えて10⁻²に希釈することで、10倍段階希釈を行います。次に、2番目のウェルの希釈液を用いて同様の操作を繰り返し、10⁻³まで希釈します。なお、サンプルによっては、10⁻⁹までさらに希釈する必要がある場合があります。

連続希釈液を調製後、60～80%にコンフルエントになったプレートに、サンプル名と使用する希釈倍率を記載します。次に、プレートの1つから、吸引または振り落としによってすべての培地を除去し、ウェルに0.5 millilitersの希釈サンプルを加えます。これを重複ウェルでも繰り返し、その後、さらに低い希釈倍率へと進みます。

3種類の希釈液をすべて1枚のプレートに重複して添加したら、プレートを前後に傾けて、すべての細胞が完全に覆われていることを確認します。次の細胞プレートでも同様の手順を繰り返します。すべてのプレートの処理が完了したら、プレートを1分間に約18回の振動に設定したロッキング装置に置き、室温で1時間保持します。その間に、あらかじめ準備し、またはオートクレーブ済みのアガロースボトルを電子レンジで加熱し、溶かします。

次に、溶融したアガロースを42 °Cのウォーターバスに入れ、温度を等しくします。続いて、溶融アガロースと滅菌済みの2倍 XMEM培地を、滅菌ボトル内で1:1の比率で混合します。このオーバーレイ溶液を入れたボトルを、使用するまで37 °Cのウォーターバスに保持します。

1時間のインキュベーション後、各ウェルから接種物を吸引し、ピペットチップを各ウェルの壁面に沿わせて、オーバーレイ溶液2 mLをゆっくりと各ウェルに加えます。細胞が剥がれるのを防ぐため、プレートに蓋をして、室温で約10分間オーバーレイを凝固させます。その後、プレートを組織培養インキュベーターに移し、48時間静置します。

インキュベーション期間後、プレートにプラークが出現しているかを確認します。プラークが見られない場合は、プレートをインキュベーターに戻し、4時間後に再度確認してください。必要に応じてこの手順を繰り返しますが、インキュベーションは72時間を超えないようにしてください。

まず、ニュートラルレッド染色液を調製します。次に、各ウェルにニュートラルレッド溶液を2 mLずつ加えます。このプロトコルでは、アロスプラグを 제거する必要はありません。プレートを37 °Cで1時間インキュベートします。

インキュベーション時間が経過した後、ウェルにニュートラルレッド溶液を入れたまま、プレートにプラークが存在するかを確認します。染まりが見られない場合は、最大3時間まで、さらに1時間ずつプレートをインキュベートしてください。プラークが確認できたら、アローズプラグを乱さないように注意してニュートラルレッド溶液を吸引し、プラークのカウントに進みます。

プレートを確認し、プラークが明確に分離している希釈段階を探します。プレートをライトボックス上に置き、カウント済みのプラークに点を打ちながら、プラークの数を数えます。これは二重カウントを避けるためです。

次に、異なる希釈倍率のウイルスを用いたウェルでカウントを繰り返し、1ミリリットルあたりのプラーク形成単位（PFU/mL）としてウイルス力価を算出します。書面プロトコルの指示に従い、この代表的な画像は感染前の単層細胞を示しています。生の 2 6 4 0.7 細胞を一晩培養し、光学顕微鏡の20倍の倍率で撮影しました。

この画像は、プラーク形成後の同一の単層細胞を示しています。感染から48時間後に0.01%中性赤溶液で細胞を染色し、4倍の光学顕微鏡下で観察しました。ローマ数字のI、II、IIIは、視認できる3つのプラークを示しています。

この画像は、プラークアッセイプロトコルの終了時のプレートを示しており、3つの10倍希釈ウェルが2連（デュプリケート）で配置され、ローマ数字でラベル付けされています。1と4は10⁻¹希釈、2と5は10⁻²希釈、そして3と6は10⁻³希釈に対応しています。

サンプルのウイルス力価を以下に示します。この手順を行う際は、サンプル間のクロスコンタミネーションを防ぐために希釈ごとにピペットチップを交換すること、溶液を適切な温度に平衡化させること、そして細胞単層を乾燥させないことが重要です。このビデオを視聴することで、プラークアッセイの実施方法およびmi neurovirus感染性粒子の定量方法について十分に理解できるはずです。

バイオセーフティキャビネット内でMira Norovirusを取り扱う際は、本手順の実施中に常に手袋やガウンを着用するなどの予防策を講じること、および地域のバイオセーフティ委員会のガイドラインに従って廃棄物を適切に処理することを忘れないでください。