ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

次のプロトコルの全体的な目標は、特定の遺伝的または生理学的変化に応答してゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイルを測定することです。これは、まず選択的な薬理学的化合物を用いて特定の遺伝的または生理学的経路を調節することによって達成されます。次に、所望の発達段階が基礎呼吸に達したときに、タツノオトシゴXF24アナライザーを使用して制御および処理された胚で測定されます。

次に、データから呼吸パラメータが計算され、その結果、発育中のゼブラフィッシュで代謝プロファイルをin vivoで研究できること、およびこれらのプロファイルは胚発生中に特定の遺伝子を標的とすることで調節できることが明らかになります。細胞ベースのアッセイや呼吸の間接測定など、すでに利用可能な技術に関するcyteの主な利点は、生物全体、つまり胚全体を扱っているため、ミトコンドリア呼吸のすべての側面を見ることができることです。この技術は、全動物の呼吸とミトコンドリア機能を測定することにより、代謝の重要な質問に答えるのに役立ちます。

治療を開始するには、受精後のゼブラフィッシュ胚を採取し、C 2 ハイブリダイゼーションまたはオイルレッド O を 0.2 ミリモル 1、PHENYL 2、テオ ウイアで染色します。色素形成を防ぐために、胚を約26時間インキュベートします。タツノオトシゴXF 24アナライザーを使用する前に、車両のみの制御で適切な最終濃度で目的の化学物質を追加し、酸素と水素のフルオロ力を収容するキャリブレーションを実行して、24ウェルXF 24アイレットプレートを準備します。

それぞれに700マイクロリットルのE 3ミディアムを追加することから始めます。次に、20個のウェルに1つの胚を加えて、標本が測定チャンバーに留まるようにします。アッセイ全体を通して、アイレットキャプチャースクリーンを各ウェルの上部に適用します。

ウェルの10は制御に使用されます Cで示される胚、ウェルの10はTで示される処理された胚に使用されます。次に、プレートをタツノオトシゴアナライザーにロードします。呼吸を測定するには、基礎呼吸最大呼吸プログラムを使用して基礎呼吸を確立します。

分間を3回測定し、各測定の間に1分間待機し、次にミトコンドリアプロトン4のカプラーFCCPで最終濃度2.5マイクロモルで測定します。基礎呼吸を確立した後、測定サイクルを5〜8回繰り返します。A TPターンオーバープロトンリークプログラムを使用して、すべてのリーガマイシンとTPシンターゼの阻害剤の25マイクロモルでのTPターンオーバーを測定し、測定サイクルを8回実行します。

次に、結果の呼吸値を使用して、リーガと媒介呼吸および基礎呼吸との差を計算します。このプロセスを繰り返して、複雑な阻害剤であるロテノンを25マイクロモル追加します。次に、プログラムが完了したときに、オリムと媒介呼吸およびロトンの追加後の呼吸の差を計算することにより、非結合呼吸を決定します。

タツノオトシゴ分析装置は、10個の対照胚と10個の化学的に処理された胚の平均値を計算して、オイルを実行します。脂質沈着を解析するための赤色o染色。治療された胚と未治療の胚が受精後50時間に達したら、細い鉗子を使用してそれらをコーティングし、摂氏4度でPBS中の4%パラホルムアルデヒドに一晩固定します。

胚をPBTで5分間1回洗浄し、次に60%Twoプロパノールで1時間インキュベートし、続いて0.3%オイルレッドOと60%Twoプロパノールで胚を短時間すすぎ、60%Twoプロパノールで2回、続いてPBTで1回、最終的に胚を30から50に移植し、次に写真撮影のために75%グリセロールに移します。特定の酵素阻害剤による胚の治療は、呼吸の約2倍の増加をもたらし、これは特に頭蓋と耳小胞の下の脂質沈着の増加と関連していました。この手順を試みる際には、同じ発生段階の胚を扱うことが重要です。

これは、対照胚と変異体または薬理学的に処理された胚との間のミトコンドリア呼吸を比較する場合に特に当てはまります。そのため、この技術の開発により、代謝分野の研究者は、ゼブラフィッシュを脊椎動物モデルとして使用して、動物全体の呼吸とミトコンドリア機能を調査することができました。