Name: ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析法。Seahorse XF 24アナライザーを用いてミトコンドリア機能を測定し、遺伝学的・薬理学的操作の効果を評価します。全生物体レベルで呼吸代謝を解析し、発生生物学と代謝研究の重要な知見を提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、優れた継続的な畜産ケアを提供するためディーキン大学ゼブラフィッシュ施設のスタッフに感謝したいと思います。 YGは、アルフレッドディーキンポスドク研究フェローシップとディーキン大学から中央研究グラントでサポートされています。 SLMはNHMRCキャリア開発フェローシップでサポートされています。 ACWはNHMRC有効にグラントでサポートされています。すべての著者は、ディーキン大学の分子医療研究戦略研究センターによりサポートされています。

パート1：ゼブラフィッシュ胚の化学処理<ol><li>受精後のゼブラフィッシュ胚を収集します。 28.5℃にて100でE3培地のC×15mmのペトリ皿を注：in situハイブリダイゼーションまたはオイルレッドO染色では、0.2mMの最終濃度で1 -フェニル-2 -チオ尿素（PTU）は、に追加されます、色素形成を阻害しますが、1タツノオトシゴ分析には必要ありません。 </li><li>薬理学的研究については、適切な車両専用コントロールと約26時間後に受精（HPF）でゼブラフィッシュ胚を開発するための適切な最終濃度で必要な化学物質を追加注：光感受性薬理学的阻害のために、胚はで発展させることができる分析前に暗い。 </li></ol>パート2：シーホースXF 24アナライザーを使用したライブ代謝プロファイル<ol><li> O 2とHを収容する各実行の前に、シーホースXF 24アナライザーカートリッジ<sアップ&gt; +蛍光体はアナライザで実行自動化されたプロセスを通して校正されています。 </li><li> 24ウェルXFの24膵島プレートの作製。以下の実験シーケンスを採用している： <ol><li>酸素消費量は温度の変動に敏感であるため、4つのウェルをプレート間で想定される温度変動を制御するために使用されます。これらの井戸は、胚が含まれていませんが、E3の培地を700μl（ 図2A）が充填されます。 </li><li>残りの20ウェルは（パート2.2を参照）、E3培地と1つの胚それぞれ（ 図2B）を700μlに満ちている。 </li><li>各実験では、10胚は車両のみ（コントロール）と10化学阻害剤（処理）で処理で処理される。対照および処理胚は（：;：処理胚：よくA4：制御胚、よくA5扱わ胚などよくA3コントロール胚ウェルA2 など ）を交互にされています。 </li><li>膵島キャプチャ画面はの上に追加され。試料がアッセイ全体の測定室（ 図2B）のままであることを保証するために、各ウェル注：化学的処理された胚は前タツノオトシゴアナライザを実行している化学物質を洗い流す必要がなく、プロシージャ全体を通して、元の化学溶液に残るプログラム。 </li><li>完了したら、プレートはタツノオトシゴアナライザーにロードされ、検定が開始されます。 </li></ol></li><li>サンプルの分析。二つの異なるアッセイは日常的に行われている。 <ol><li>基礎呼吸/最大呼吸プログラム（期間：約90分）。基底呼吸の変化は、最大呼吸が病理学的および生理学的状態の両方の番号に関連付けられ、このパラメータの総エネルギー生産能力と変化の尺度である一方で、代謝機能不全を支える。予備の呼吸能力、またはさらなるATP産生を増加させるためのシステムの能力は、また計算されます最大呼吸から基底の減算によって、このテストによる。三各ミックスの反復（2分）/待機（1分）/測定（2分）のサイクルは、まず基底呼吸を確立するために行われる。第3サイクルの終わりに、FCCPの2.5μMの（ミトコンドリアprotonophore /脱共役剤）の最終濃度は、各ウェルの最大呼吸の測定を可能に追加されます。測定サイクルは、その後、5〜8倍（ 図3）を繰り返す。 </li><li> ATPのターンオーバー/プロトンリークプログラム（持続時間約60分）。 ATPの代謝回転に起因する呼吸がATP生産の形でミトコンドリアの主要な機能を表し、プロトンリーク、または非結合呼吸による呼吸しながら、密接に基礎呼吸と活性酸素種の形成を含むミトコンドリア機能の他のパラメータと連動しています。 ATPの代謝回転に起因する呼吸は、25μMオリゴ（の阻害剤を添加した後の呼吸量の差で表されるTPシンターゼ）基底呼吸に比べて。脱共役呼吸、またはプロトンリークによる呼吸は、25μMのロテノン（複合体Iの阻害剤）を添加した後のオリゴマイシン媒介呼吸と呼吸の間の差を計算することによって決定される。測定サイクルは、それぞれのミトコンドリア阻害剤を添加した後、8回繰り返される。 </li></ol></li></ol>実行の終了時に、10個のコントロールと10化学処理された胚の平均値を算出しています。 パート3：オイルレッドO染色<ol><li> 50 HPFの胚を4℃で一晩4％PFAで細かい鉗子を用いdechorionatedと固定されています</li><li>オイルレッドO染色は、以前（ 図4を参照）2に記載されているように 、実行されます。 </li></ol>

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aN%C3%BCsslein-Volhard%2C+C+%22Zebrafish%22">Zebrafish</a>. , Oxford University Press. (2002).</li>
<li>Schlombs, K., Wagner, T., Scheel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-1+protease+is+required+for+cartilage+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Site-1 protease is required for cartilage development in zebrafish.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 14024-14029 (2003).</li>
<li>Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+power+of+the+zebrafish+for+disease+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">The power of the zebrafish for disease analysis.</a> Hum. Mol. Genet. 18, R107-R112 (2009).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26, 216-220 (2000).</li>
<li>Stackley, K. D., Beeson, C. C., Rahn, J. J., Chan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profiling+of+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profiling of zebrafish embryonic development.</a> Plos One. 6, e25652(2011).</li>
<li>McGee, S. L., Sadli, N., Morrison, S., Swinton, C., Suphioglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+protects+against+zinc+mediated+alterations+in+neuronal+cellular+bioenergetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Physiol.+Biochem%22%5BJournal%5D)">DHA protects against zinc mediated alterations in neuronal cellular bioenergetics.</a> Cell Physiol. Biochem. 28, 157-162 (2011).</li>
<li>Sivitz, W. I., Yorek, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+diabetes%3A+from+molecular+mechanisms+to+functional+significance+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in diabetes: from molecular mechanisms to functional significance and therapeutic opportunities.</a> Antioxid. Redox Signal. 12, 537-577 (2010).</li>
<li>Bournat, J. C., Brown, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Endocrinol.+Diabetes+Obes%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in obesity.</a> Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17, 446-452 (2010).</li>
<li>Ghafourifar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in multiple sclerosis.</a> Front Biosci. 13, 3116-3126 (2008).</li>
<li>Winklhofer, K. F., Haass, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 29-44 (2010).</li>
<li>Maruszak, A., Zekanowski, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neuropsychopharmacol.+Biol.+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and Alzheimer's disease.</a> Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 35, 320-330 (2011).</li>
<li>de Moura, M. B., dos Santos, L. S., S, L., Van Houten, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurodegenerative+diseases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Mol.+Mutagen%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and cancer.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51, 391-405 (2010).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ゼブラフィッシュ胚における遺伝子機能も簡単にブロックされたり、アクティブにすることができながら、ゼブラフィッシュは、前方（ENU誘発）とリバース（耕耘、ジンクフィンガーヌクレアーゼ標的ノックアウト、モルホリノノックダウン）遺伝的アプローチ3,4両方のための十分に確立された遺伝的モデルである符号化された製品の特定の選択的な薬理学的化合物を使用して。彼らの外部の開発と小型のため、ゼブラフィッシュ胚は、代謝解析のために特に適している。しかし、代謝プロフィールとゼブラフィッシュ胚における in vivoでのミトコンドリア機能の堅牢な計測は1つだけ予備説明と共に、達成5報告されていない。タツノオトシゴの分析は、もともと細胞ベースの代謝研究用に設計されており、正確で信頼性の高い結果6を与えることが実証されている。ゼブラフィッシュ胚には、この新しい方法論の適用が重要、と代謝研究のために、このモデルのより広い使用を増強する可能性があります。そこで本研究では、基底呼吸、最大呼吸、呼吸予備容量は、ATPの代謝回転とプロトンリーク電流を含むタツノオトシゴアナライザーを用いて、ゼブラフィッシュ胚の呼吸パラメータの範囲の測定値を示しています。我々はまた、このような測定は、この場合の脂質の蓄積であり、このアッセイ系における薬理学的阻害剤の使用の他の生理的パラメータと相関させることができる方法の例を提供します。遺伝子組み換え胚の使用と組み合わせることで、これが代謝に影響を与える要因を理解するための強力な実験的なプラットフォームを提供します。 ミトコンドリアの機能不全は、糖尿病7、肥満8、多発性硬化症9、パーキンソン病10、アルツハイマー病11とがん12のいくつかのタイプなど、多くのヒト疾患に関与していると、この新しい方法論のための様々なアプリケーションがあります。重要なことは、Oそれによって生体の呼吸および代謝プロファイルで生理学的に関連するビューを提供する、アクティブになっている-そのようなサイトカイン、開発関連の成長などなど-ウルの仕事はすべての環境の影響は 、in vivo で行われます。などの化学画面も日常的に野生型と変異型の背景ゼブラフィッシュ胚（ 図1）、影響呼吸、ミトコンドリア機能や代謝を簡単にタツノオトシゴ·アナライザを使用して識別することができることを小説医薬品で実行されます。タツノオトシゴ·アナライザを使用して生成された結果は、追加情報を提供するために、他のアッセイと組み合わせて使用​​することができる。これは、例えばcebpαなどの特定の脂肪細胞のマーカーのためのin situハイブリダイゼーションなどのオイルレッド染色、または分子解析、PPARα、PPARγ、FASなどの生理的な分析を含むことができ、 この方法にはいくつかの制限が残っている。我々と他の人はMEASにオリゴマイシンを使用することができたものの、60 HPFオリゴマイシンの治療よりも古い胚の若い胚5（ 図3を参照）上のURE ATP生産とプロトンリークは、非効率的です。我々は古い胚でオリゴマイシンは、同じように簡単に解釈する結果は不可能若い胚に比べて拡散することができないと信じています。オリゴマイシンの結果は、ATPの代謝回転と切り離さ呼吸による呼吸の測定のための必須であるので、我々は現在、年上の胚のオリゴマイシンの高い濃度を調査している。しかし、アンチマイシン治療法は、このような基礎呼吸、最大呼吸とスペア呼吸容量、古いゼブラフィッシュ胚で行うことができ、最大68 HPF（図示せず）などの他の測定と、より長い有効のままです。 現在のタツノオトシゴアナライザーのセットアップを使用してのもう一つの制限は、ゼブラフィッシュ胚および若齢幼虫にのみ適していることなどを各ウェル膵島捕捉プレート内の物理的な空間です。したがって、metabolを行う成魚における食餌誘導性肥満のICの研究は、例えば、まだ技術的に実現不可能である。しかし、この研究では、ことが可能な分析の範囲を拡張し、特に少年又は成魚用に設計されたプレートの開発を促すことができる。

<html><table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> XFの24細胞外フラックスアナライザー</td><td>バイオサイエンスタツノオトシゴ</td><td> 100737-101 </td><td> 24ウェルフォーマット</td></tr><tr><td>膵島キャプチャーマイクロプレート</td><td>バイオサイエンスタツノオトシゴ</td><td> 101122-100 </td><td> 24ウェルフォーマット</td></tr><tr><td> XFのキャリブレーション·ソリューション</td><td>バイオサイエンスタツノオトシゴ</td><td> 100840-000 </td><td></td></tr><tr><td> XFのアッセイ培地</td><td>バイオサイエンスタツノオトシゴ</td><td> 101022-100 </td><td></td></tr><tr><td>オイルレッドO </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> O0625 </td><td></td></tr><tr><td> 1 - フェニル-2 - チオ尿素（PTU） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P7629 </td><td>/ zfbook/chapt10.html＃wptohtml51 &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html＃wptohtml51 </td></tr><tr><td> E3（胚培地） </td><td>自分で作った</td><td> - </td><td> <a href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml16" target="_blank">http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html＃wptohtml16</a> </td></tr><tr><td> 100X15ミリメートルペトリ皿</td><td>ファルコン</td><td> 35から1029 </td><td></td></tr><tr><td> FCCP </td><td>シグマ</td><td> C2920 </td><td></td></tr><tr><td>オリゴマイシン</td><td>シグマ</td><td> 75351 </td><td></td></tr><tr><td>アンチマイシンA </td><td>シグマ</td><td> A8674 </td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

代謝の分野で成長している目標は、ミトコンドリア機能のさまざまな側面に遺伝の影響を判断することです。これらの関係を理解することは、糖尿病や肥満などのミトコンドリア機能不全と連動疾患の範囲のための基礎にある病因を理解するのに役立ちます。計装における最近の進歩は、細胞株や組織外植片のミトコンドリア機能の異なるパラメータの監視を可能にしました。ここでは、シーホースXFバイオサイエンス24細胞外フラックスアナライザーを用いてゼブラフィッシュ胚の発生過程で生体内でのミトコンドリア機能パラメータの迅速かつ高感度な分析のための方法を提示する。このプロトコルは、膵島キャプチャは単一胚を各ウェルに配置されている場合には、生体エネルギーの測定を可能にする、マイクロプレートを含む利用：基礎呼吸（i）を、ATPの代謝回転に起因する（ii）の基底ミトコンドリア呼吸（iii）のミトコンドリアの呼吸をし、（iv）ミトコンドリア切り離さ呼吸やPRoton漏れ及び（i​​v）の最大呼吸。このアプローチ胚ゼブラフィッシュの呼吸パラメータを使用すると、野生型および遺伝的に改変された胚（変異、遺伝子の過剰発現や遺伝子ノックダウン）またはその薬理学的に操作され、それらの間で比較することができます。それは、このプロトコルの普及はこの関連脊椎動物動物モデルにおける in vivoでの代謝性疾患の遺伝的基礎を分析するための新しいツールを研究者に提供することが予想されます。

<html>我々は、特に代謝、呼吸速度および脂質代謝に役割の特定の遺伝子を理解することに興味を持っています。したがって、我々はこれらの遺伝子の1つによってコードされる酵素の特異的な薬理学的阻害剤を用いたHPF 26年から野生型ゼブラフィッシュ胚を処理した。残りの半分を4％で固定している間50 HPFで、車両及び阻害剤で処理した胚の半分は、ミトコンドリア機能のためのタツノオトシゴを用いて分析したPFAの一晩4℃で、その後、オイルレッドOで脂質沈着のために染色。特定の酵素阻害剤による治療は特に終脳と耳胞（ 図4B、C）の下に脂質沈着の増加と関連していた基底呼吸で約2倍に増加し（ 図4A）、つながった。 pload/4300/4300fig1highres.jpg &quot;/&gt; 図1。ゼブラフィッシュ胚の化学的処理の概略図。野生型、遺伝的に操作され、またはその薬理学的に処理されたゼブラフィッシュ胚は背景です。 <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2.jpg" alt="図2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig2highres.jpg"/> 図2。 XF24膵島プレートが設定します。（）4つのウェルは、温度コントロールとしてのみ胚性媒体を含む（Xでマークされている）と他の人がよく1つの胚を含む/。 （B）は膵島キャプチャー画面（矢じり）で覆わ車両スルホキシド（DMSO）で処理された50 HPF野生型胚を示すだけでなく1（C6）のクローズアップ。 <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4300/4300fig3highres.jpg"/> 図3。 Respirat野生型50 HPFのゼブラフィッシュ胚のイオンパラメータは、（A）各測定では、20個の胚の平均が表示されます。基底呼吸（平均：299.7、SD：75.7; SEM：16.9）、最大呼吸（平均：387.4、SD：93.3; SEM：20.9）、スペア呼吸容量（平均：87.7、SD：72.0​​; SEM：16.1）。 （B）の各測定では、20個々の結果の平均値が提示される。基底ミトコンドリア呼吸、ATPの代謝回転に起因するミトコンドリア呼吸、ミトコンドリアの脱共役呼吸および非ミトコンドリア呼吸。 MT：ミトコンドリア、SRC：スペア呼吸容量、SD：標準偏差、SEM：平均値の標準誤差。結果は/分/胚消費O 2のpmolに提示されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4300/4300fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するにはここをクリック</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/4300/4300fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。 REPRE基底呼吸と脂質沈着に及ぼす化学物質の曝露のsentative結果（A、B）は側面図でオイルレッドOで染色した50のHPF胚。選択的阻害剤と共にインキュベート胚（B）は、終脳における多くのオイルレッドO染色（矢印）が表示され、ビヒクル処置対照胚と比較して、耳胞（矢印）の下。 （C）の基底呼吸は化学的に処理された胚（群あたりn = 10胚）で約2倍の増加を示しています。結果は、O 2 /分/胚のpmolに示されている。

ゼブラフィッシュは、代謝の研究のために十分に利用されている強力な脊椎動物のモデルを表しています。ここでは、測定するための迅速な方法を記述<em生体内で&gt;</emそれによって、この生物の適用性を増加させる、遺伝的または薬理学的に操作された胚の間の異なるミトコンドリア機能パラメータの比較を可能にゼブラフィッシュを開発する&gt;代謝プロファイル。

代謝分野において、ミトコンドリア機能のさまざまな側面に対する遺伝学的影響を明らかにすることが、ますます重要な目標となっています。これらの...

本プロトコルの全体的な目的は、特定の遺伝的または生理的な変化に対するゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイルを測定することです。まず、選択的な薬理学的化合物を用いて特定の遺伝的または生理学的経路を調節します。次に、目的の発達段階に達した際、seahorse XF 24 analyzerを用いて、対照群および処理群の胚における基礎呼吸量を測定します。次に、呼吸パラメータを算出します。得られたデータの結果から、発達中のゼブラフィッシュにおいてin vivoで代謝プロファイルを研究できること、また、胚発生期間中に特定の遺伝子を標的とすることでこれらのプロファイルを調節できることが明らかになります。細胞ベースのアッセイや呼吸の間接的測定などの既存の技術に対するcyteの主な利点は、個体全体、すなわち胚全体を扱うため、ミトコンドリア呼吸のあらゆる側面を観察できることです。この手法は、個体全体の呼吸とミトコンドリア機能を測定することで、代謝に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。処置を開始するために、in situ ハイブリダイゼーションまたはオイルレッドO染色用に、受精後のゼブラフィッシュ胚を回収し、0.2 mMのPHENYL-theo-uiaに浸します。色素形成を防ぐため、胚を約26時間インキュベートします。目的の化学物質を適切な最終濃度で添加し、あわせて溶媒のみのコントロール群を用意します。Seahorse XF24アナライザーを使用する前に、酸素および水素センサーを搭載したキャリブレーションを実行し、24ウェルのXF24アイレットプレートを準備します。まず、各ウェルに700 µLのE3培地を加えます。次に、検体が測定チャンバー内に留まるように、20個のウェルに胚を1つずつ加えます。アッセイの間、各ウェルの上部にアイレットキャプチャスクリーンを装着してください。Cと表示された10個のウェルをコントロール胚に、Tと表示された10個のウェルを処理済み胚に使用します。黒いボックスは胚が入っていないウェルを示しており、プレート全体の温度変動を制御するために使用されます。次に、プレートをSeahorseアナライザーにロードします。呼吸能を測定するには、basal respiration maximum respirationプログラムを使用して基礎呼吸を確立してください。ミトコンドリアプロトンフォアオンカプラーであるFCCPを最終濃度2.5 µMで添加し、1分間の待機時間を挟んで2分間の測定を3回行います。基礎呼吸を確認した後、この測定サイクルを5〜8回繰り返します。次に、ATP合成酵素阻害剤であるオリゴマイシンを25 µMで添加し、ATP turnover Proton leakプログラムを用いてATP turnoverを測定し、測定サイクルを8回実行します。次に、得られた呼吸値を用いて、オリゴマイシン介在性呼吸と基礎呼吸の差を算出します。このプロセスを、複合体I阻害剤である25 µMのロテノンを添加して繰り返します。プログラム完了後、オリゴマイシン介在性呼吸とロテノン添加後の呼吸の差を算出することで、脱共役呼吸を決定します。Seahorseアナライザーを用いて、10個のコントロール群と10個の化学処理済み胚の平均値を算出し、脂質蓄積を分析するためにオイルレッドO染色を行います。処理済みおよび未処理の胚が受精後50時間に達した時点で、微細ピンセットで回収し、4%パラホルムアルデヒド含有PBS中で4°Cで一晩固定します。胚をPBTで5分間1回洗浄し、次に60% 2-プロパノールで1時間インキュベートします。続いて、0.3% Oil Red Oおよび60% 2-プロパノールの混合液中で2時間インキュベートします。胚を60% 2-プロパノールで2回短時間すすぎ、最後にPBTで1回洗浄します。その後、ここに示すように、撮影のために胚を30%、50%、そして75% Glycerolへと順次移します。特定の酵素阻害剤で胚を処理すると、呼吸が約2倍に増加し、それに伴い、特に頭部および耳胞の下方で脂質蓄積の増加が認められました。この手順を行う際は、同一の発達段階にある胚を使用することが重要です。これは、対照群の胚と、変異体や薬物処理を施した胚との間でミトコンドリア呼吸を比較する場合に特に当てはまります。後者の胚は、発生がわずかに遅れている可能性があるためです。したがって、この手法の開発により、代謝研究分野の研究者が、脊椎動物モデルとしてゼブラフィッシュを用い、個体全体の呼吸およびミトコンドリア機能を探索することが可能になりました。

metabolic-profile-analysis-of-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、マルチウェルプレートのゼブラフィッシュ遺伝子導入胚の自動化された画像と解析のためのシステムの開発について報告する。これは、線維芽細胞成長因子のレポーター遺伝子の発現に低分子化合物、BCI、の用量依存性の効果を測定し、高スループットのゼブラフィッシュの化学物質の画面を確立するための技術を提供する能力を示しています。...

ゼブラフィッシュの化学スクリーンのための自動化された画像と解析の開発。

このビデオでは、ゼブラフィッシュの胚のエタノール濃度を測定するためのヘッドスペースガスクロマトグラフィーの使用を実演しています。この方法は、揮発性有機化合物の定性的および定量的分析に有用なツールを提供します。...

ヘッドスペースガスクロマトグラフィー:ゼブラフィッシュ胚のエタノール濃度を評価する技術

ここでは、生きているゼブラフィッシュの胚の酸化ストレスを測定するためのプロトコルを報告します。この手順により、全胚組織と単一細胞集団の両方で活性酸素種(ROS)を検出できます。このプロトコルは、定性的分析と定量的分析の両方を実現します。...

ゼブラフィッシュ胚における酸化ストレスの分析

ゼブラフィッシュは、エネルギー恒常性の研究にとって重要なモデル生物です。 NADH2感受性酸化還元インジケーターであるalamar Blueを利用することで、ゼブラフィッシュの幼生の代謝率を96ウェルプレート形式で測定するアッセイを開発し、薬物や遺伝子の発見に適用することができます。...

高スループット<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;エネルギー消費アッセイ

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚は、幼虫から全体のトランスクリプトーム解析手法を提案またはセルを並べ替えられます。我々 には、RNA の隔離、RNASeq データの経路解析と遺伝子発現変動の qRT PCR...

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

ゼブラフィッシュは、開発中に DNA 複製タイミングを勉強する体内モデル システムとして最近使用されました。ここでは、プロファイル レプリケーション タイミングにゼブラフィッシュ胚を使用してのためのプロトコルの詳細。このプロトコルは、変異体、個々 の細胞の種類、病モデル、および他の種にレプリケーション...

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

この研究は、適切な暴露方法から胚処理およびエタノール分析へのヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノールレベルを定量化するプロトコルを記述する。...

ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたゼブラフィッシュ胚におけるエタノール濃度の定量

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。...

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

このプロトコルは、受精後3〜7日のゼブラフィッシュの幼生における薬物スクリーニング手順と、それに続く形態学的評価を説明しています。...

初期ゼブラフィッシュ幼生における低分子スクリーニングと毒性試験

RASopathyiesは、RAS-MAPK経路の過剰活性化によって引き起こされる多系統遺伝性症候群です。検証を待っている潜在的に病原性の多様体が次々と出現する一方で、前臨床のエビデンスが乏しいため治療が制限されています。ここでは、Teen-reporter ZebrafishのライブFRETイメージングにより、RASopathy関連ERK活性化レベルとその薬理学的調節を胚発生時に試験および交差検証するためのin...

ライブFRET顕微鏡法および免疫蛍光法による初期ゼブラフィッシュヌーナン症候群モデルにおけるERK活性調節を評価するための効率的なプロトコール

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の心臓形態と機能を評価するための低コストの光学顕微鏡法を説明しており、高度なイメージングシステムを必要とせずに発生性心毒性の再現性評価を可能にします。...

標準顕微鏡とビデオ分析を使用したゼブラフィッシュ胚の機能的心臓イメージング: 環境および生物医学研究への応用

学ぶゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析法。Seahorse XF 24アナライザーを用いてミトコンドリア機能を測定し、遺伝学的・薬理学的操作の効果を評価します。全生物体レベルで呼吸代謝を解析し、発生生物学と代謝研究の重要な知見を提供します。

ゼブラフィッシュ胚の代謝プロファイル解析

さらに動画を探す