Name: 全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: 学ぶ全血表現型アッセイによる多施設臨床試験での主要末梢血白血球集団の列挙法。フローサイトメトリーと蛍光抗体を用いて、免疫応答を正確に追跡する標準化手法を確立する。

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我々は、この方法では、原稿やビデオの開発における彼らの支援のためのジェシカ·ジョーンズ、エリカ·クラーク、コンスタンスDucar、ドナ·スミス、ロイ·ルイス、リリーApedaile、ジョアンウィーズナー、デヴィン·アダムス、コーリー·マクベインとスティーブンVoghtに感謝します。 この作品は、ビル·アンド·メリンダ·ゲイツ財団の助成金CAVD 38645（MJM）と健康の補助金の国立研究所UM1 AI068618とAI069481 U01（MJM）によってサポートされていました。 EA-N。 NIHグラントT32 AI007140によってサポートされています。我々は彼らの寛大な機器の寄付のためにジェームズ·B·ペンドルトン公益信託に感謝します。

注：光から蛍光色素標識抗体を保護するために、光をオフにしてバイオ安全キャビネット内のすべての手順を実行します。 1。抗体染色パネルの準備<ol><li>抗体染色パネルが表1に記載されています。抗体濃度は全血で滴定することにより定​​義され、染色された表現型のサンプルを取得するために使用されるのと同じフローサイトメトリー機器および手順を使用する必要があります。 </li><li>適切な染色力価が決定されると、ロックキャップチューブ内の単一の混合物の中にすべての抗体を結合します。 100μlに総量をもたらすために、フローの洗浄バッファー（2％熱不活性化ウシ胎児血清を含むダルベッコPBS）を追加します。染色されたサンプル数の混合物を拡大縮小します。この混合物を、最大8週間まで4℃で保存することができます。 </li></ol> 2。染色<ol><li>採取した血液は、広告内に他の目的に使用する場合もっと時間に敏感な手続きが残っている血液に行っている間、このアッセイにditionはさておき、アリコートを設定します。アリコートは有意な細胞を損失することなく静脈穿刺後4時間まで室温で保存することができます。 </li><li>無傷ビーズTrucountチューブの底にペレットとラベルが染色されたサンプルを識別するためのチューブがあることを確認します。 HVTN臨床試験では、実験室データマネジメントシステム（フロンティア科学技術研究財団、アマースト、ニューヨーク州）は、染色したサンプルにラベルを付けて追跡するために使用されます。 </li><li>すべての試薬のロット番号と有効期限を記録します。チューブの袋の上にメーカーから提供されTrucountチューブビーズカウント数を記録し、袋の上にロット番号がチューブにロット番号と一致していることを確認してください。 </li><li>正確にちょうど金属リテーナの上、Trucount管に全血100μlをピペットにピペット逆に使用します。チューブの側面に塗沫血を避けてください。 </li><li&gt; Trucount管に通常の（前方）ペッティング技術、混合抗体染色パネルの各々 100μL添加します（ 表1を参照）を使用する。混ぜて約15秒間低速でチューブと渦をキャップ。視覚的にビーズペレットが完全に溶解していることを確認するためにチューブを点検してください。 </li><li>暗所で室温（15-30℃）で15分間Trucountチューブをインキュベートする。 </li><li>必要に応じて、DIH 2 Oを用いて1Xに10のアリコート×FACS溶解溶液を希釈900μlの1×チューブにFACS溶解溶液を追加します。 </li><li>混ぜて約15秒間低速で徹底的に管と渦をキャップ。実験室でのフィルムでチューブおよびシールの位置をロックにしっかりとキャップを押し下げます。 </li><li> -65℃チューブを-95℃で保存°Cのサンプルは、中央分析室への出荷のためか、家の中で分析のための準備が整うまで。サンプルは、少なくとも4週間は、この段階では安定しています。直ちにを出荷またはアッセイする場合diately、この工程を省略することができる。 </li></ol> 3。出荷 注：以下の手順は、特に国際航空及び運送協会（IATA）の規則に従って船積みカテゴリB免除生物学的物質用に設計されたSAF-T-Pakは、（株）から絶縁された出荷システムを利用しています。染色が発生した場所と同じ場所にサンプルを分析する場合は、セクション4に進みます。 <ol><li>サンプルは直ちに染色後出荷することができるか、一度それらが-65℃に凍結さ℃〜-95℃まで染色標本ボックスに箔と場所で完全に各チューブを巻き付けます。吸収物質で漏れ防止ポリ袋の中に染色標本ボックスを配置します。 </li><li>袋の中でできるだけ少ない空気のようにタイベックの袋とシールに漏れ防止ポリ袋と中身を置きます。 </li><li>内側の茶色のボックス内の標本パッケージ（二次包装内部の標本）を配置します。 </li><li>インナーブラウンBを配置シフトを防ぐために、インデントにそれを固定している発泡スチロールの胸部内の牛、。 </li><li>ドライアイス（約8キロ）で発泡スチロールの箱を記入し、胸にしっかりと蓋を置く。 </li><li>適切なドライアイス（UN1845）のマーキングとしっかりとテープ生物由来物質として梱包箱や船、カテゴリBを（UN3373）のIATA PI-650の指示に従ってください。 </li><li>受信すると、サンプルは-65℃で保存するC -95°Cまで、彼らが分析されるまで。 </li></ol> 4。解凍およびフローサイトメトリー分析<ol><li>フローサイトメーターで収集する前に、暗闇の中で、室温で解凍し、冷凍庫から染色されたサンプルを削除します。複数のサンプルについてのデータを収集する場合は、チューブが1時間以上各室温で座ってされないように解凍ずらすことによって、すべてのチューブのためのプロセスを標準化しています。 </li><li>サンプルは、例えばBD LSRとして適切なフィルターを装備して4つのレーザーフローサイトメーターを用いて取得しておく必要がありますⅡ。データ収集のための標準的な4メーターのキャリブレーションおよび蛍光補正メソッドを使用します。 </li></ol> 注意：コレクション5時に前方散乱または側方散乱のしきい値を設定しないでください。 Trucountビーズは、分析中に計上されないように、ビーズのサブセットを引き起こし、これらのパラメータの可能な限り低いしきい値の設定値を下回ることができます。しきい値を設定する機器によって必要な場合は、可能な限り低いアムシアンチャネルのしきい値を設定します。パネルで染色し、CD45 +白血球もアムシアンチャンネルで蛍光を発するアムシアン陽性、Trucountビーズとなりますので、これは適切に収集することができるため、関連するすべてのデータを考慮するべきです。 <ol start="3"><li>フローサイトメーター上でロードする前に、5秒間ボルテックスサンプルチューブを。 Trucountビーズは多くのチャンネルで高い蛍光を発する。ゲートPE Cy5およびAPC（2 coloのために非常に重陽性である人口を見つけることによって、収集時にビーズ最も容易に細胞からビーズを区別するRS）は、インスツルメンテーションによって異なります。少なくとも20,000ビーズが取得されるまで、停止ゲートとしてビーズゲートを選択し、レコードデータ。 </li><li>そのようなFlowJo（Treestar;オレゴン州アッシュランド）のような適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。 図1は代表的な制御採血異なる白血球集団の分析のために利用ゲーティング方式を示しています。 </li></ol> 5。 Trucount計算<ol><li>各Trucount管は蛍光ビーズの凍結乾燥ペレットを含んでいます。チューブに液を添加し、ボルテックスした後、ビーズが均等にサンプル全体に分散になる必要があります。ペレットのビーズの数はロット番号により若干異なりますが、チューブ用の収納袋で見つけることができます。 </li><li>ゲートTrucountビーズと細胞集団を各集団のイベントカウントを決定するために、図1に示すように。イベントiの数を比較するn個のチューブ内に元々ビーズの総数にビーズゲートでは、各人口の絶対濃度（ すなわち 、細胞/μl）を決定するために使用できるサンプル回収し、の比率を決定することができます。細胞濃度（＃細胞/μlの全血）= [/＃人口イベント（＃ビーズイベント/＃ペレットの総ビーズ）] /100μlの次の式は、この目的のために使用することができます。 </li></ol> 6。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> 図1ゲーティング方式は、健康なボランティアからの代表的なデータを示す主要な白血球集団の分析のために利用した。 A）はTrucountビーズは、（i）gatedおよび細胞から排除されています。顆粒球（ii）が線引きされており、lympohcytesと単球は3 popluationsに分かれています：CD14負のリンパ球（iii）では、すべてのCD14陰性細胞（IV）、および非リンパ球​​（v）である。 B）は、CD14陰性のリンパ球は、CD4 + T細胞（VI）、CD8 + T細胞（VII）、B細胞（ⅷ）、CD56明るいNK細胞（IX）、CD56薄暗いNK細胞（x）、およびCD56陰性NK細胞を区別するためにゲートさ（XI）。 c）すべてのCD14陰性細胞は、骨髄（XII）と形質（XIII）樹状細胞を区別するゲートさ。 d）非lympocytesは非古典（XIV）、中間（XV）、古典（XVI）の単球を区別するためにゲートされる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 （ 例えば 、NKT細胞または好中球）、図1に示されていない、より具体的な細胞サブセットはまた、我々が提示するパネルを使用して区別することができ、かつゲーティング方式は展開したり、特定の研究ニーズに合わせて変更することができます。示される特定のゲーティングの手順では、このメソッドに固有のものです。特に注目すべきは、インクルージョンのゲートと除外ゲートがTrucountビーズの周りに描かれ、互いに、カウントするためのゲートビーズを1つ、および細胞分析（ 図1A）からビーズを除外する1つの上に置かれています。また、（ 図1A）CD45発現および側方散乱を用いて、これらの細胞はしばしば必要であるゲー、彼らは前方散乱および側方散乱による末梢血単核細胞にあるようにリンパ球、単球、顆粒球は、同じように簡単に全血中で区別されていないためです。 CD45および側方散乱を用いたリンパ球と単球から分離することができませんでした汚染顆粒球（円内）が高いCD16発現（ 図1Cおよび図1D）によっていくつかのプロットで区別することができる。汚染顆粒球の数は通常小さく、それらは単球とNK細胞ゲーティングを妨げることはありません。

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<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

本稿では、フローサイトメトリーによって新鮮全血中の白血球集団を列挙するためのビーズをベースにした方法を提示し、一元的なサンプル分析による多施設臨床試験での使用に必要なパラメータをカバーしています。この方法は、上に構築し、BD Trucountプロトコルを最適化し、多施設臨床試験の設定で、その信頼性の高い使用を可能にします。染色アッセイはシンプルであり、それは血液処理検査技師のための実現可能なことを実行するために、分析のために中央のアッセイラボにサンプルを凍結し、出荷すること、実行するために約45分かかります。アッセイは、時間とコストのかかる処理PBMCの必要性を排除し、標準的な表現型アッセイよりもはるかに少ない量を使用した全血の唯一の100μlを、必要とします。また、新鮮な全血を使用することによって、このアッセイは、より正確に細胞の in vivo の状態で描いていると、いくつかの細胞型で観察された凍結保存の有害な影響を排除の1-3。この染色法では、細胞濃度の正確な測定値を生成しますが、CBCと他のカウントの方法よりもはるかに多くの種類の細胞を区別する利点と。正...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>絶対計数管をTrucount </td><td> BD Biosciences社</td><td> 340334 </td></tr><tr><td> Solutionを溶解10X FACS </td><td> BD Biosciences社</td><td> 349202 </td></tr><tr><td>カテゴリーB＆免除配送システム、絶縁</td><td> SAF-T-Pakの</td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45モノクローナル抗体AmCyan </td><td> BD Biosciences社</td><td> 339192 </td></tr><tr><td> CD3 FITCモノクローナル抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 349201 </td></tr><tr><td> CD8も、PerCP-Cyは5.5モノクローナル抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4のAlexa Fluor 700モノクローナルantiboDY </td><td> BD Biosciences社</td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DRのECDのモノクローナル抗体</td><td>ベックマン·コールター</td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14モノクローナル抗体V450 </td><td> BD Biosciences社</td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19モノクローナル抗体、PE </td><td> BD Biosciences社</td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7型モノクローナル抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7モノクローナル抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11cはAPCのモノクローナル抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123、PE-Cy5のモノクローナル抗体</td><td> BD Biosciences社</td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

末梢血白血球の凍結保存は、広く臨床試験において免疫応答評価のための細胞を保持するために使用され、免疫学的な評価のしやすさと標準化のための多くの利点を提供していますが、このプロセスの有害な影響は、顆粒球、B細胞などの一部の細胞サブセットで観察されているされている、および樹状細胞1-3。新鮮な白血球をアッセイする細胞の in vivo の状態でのより正確な画像が得られますが、大規模臨床試験のコンテキストで実行することはしばしば困難である。新鮮な細胞アッセイは、時間がかかる場合には、それらのアプリケーションが原因で検査室の職員に求められる労働時間に非現実的なことができ、ボランティアのコミットメントと時間枠に依存していると。また、治験が複数の施設で実施された場合、アッセイを行うために必要なリソースと訓練研究所は臨床現場に十分に近接して配置されていない可能性があります。これらの問題に対処するために、我々は持っている開発表現型と末梢血内に主要な白血球集団を列挙するなど、アッセイよりも堅牢な細胞型に特異的な情報を得る工程; Trucountチューブ（サンノゼ、カリフォルニア州Becton Dickinson）を用いて使用することができる11色の抗体染色パネルをOPED全血球算定（CBC）または少数の細胞型のため染色Trucountチューブ用に設計された市販のパネルとアッセイ。染色手順は簡単ですが、新鮮な全血のみを100μlを必要とし、約45分かかり、それが実現可能な標準的な血液処理ラボが行うようにすること。それは、BD Trucount管技術データシート（から適合さ<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">バージョン2010分の8</a> ）。染色抗体カクテルは、中央アッセイ研究室で一括して事前に準備し、現場での加工ラボに出荷することができます。ステンドチューブを固定することができと多色フローサイトメトリー分析のための中央検査所への出荷のために凍結した。この染色パネルから生成されたデータは、介入との関係で時間をかけて白血球濃度の変化を追跡するために使用することができ、簡単にさらに関心のある特定の種類の細胞の活性化状態を評価するために開発される可能性がある。本稿では、新鮮な全血と多施設臨床試験を支える中心的なアッセイ研究室でこれらの染色されたサンプルを分析するための手順に染色を実行するために血液処理ラボの技術者が使用するプロシージャを示しています。それがHIVワクチン治験ネットワーク（HVTN）における臨床試験採血のコンテキストで実行されるビデオの詳細手順。

本稿では、大規模な自然免疫と適応白血球集団を列挙するために新鮮な全血で行わ表現型アッセイの染色と分析の手順を紹介します。我々は、多施設臨床試験のコンテキストでこれらの手順を実行する際の考慮事項を強調している。

末梢血白血球の凍結保存は、臨床試験における免疫応答評価のために細胞を保存する方法として広く用いられており、多くの利点をもたらします...

このビデオでは、中央研究所で分析するために、多施設共同臨床試験において新鮮全血を染色するために、フレッド・ハッチンソンがん研究センターのHIVワクチン試験ネットワークによって開発された手順について説明します。この手順では、Becton Dickinson Biosciences社製のTruCountチューブを使用します。各チューブには凍結乾燥ペレットが含まれており、サンプル調製中に溶解して既知数の蛍光ビーズを放出します。蛍光抗体を用いて、異なる細胞集団に特異的な表面マーカーを染色します。フローサイトメトリー解析において、これらの異なる細胞集団の数を蛍光ビーズの数と比較することで、全血中のさまざまな白血球集団の絶対濃度を、介入に関連して経時的に追跡することが可能です。こんにちは、私はErica Anderson Nissanです。HIV Vaccine Trials Networkのスタッフサイエンティストを務めています。これからご覧いただく手順は、私たちの多施設共同臨床試験で使用するために開発したものです。これらの試験では、血液処理のラボ技術者が新鮮な全血検体を受け取り、蛍光標識抗体で染色した後、フローサイトメーターによる分析が可能な中央ラボに検体を配送します。臨床試験の環境において、新鮮全血はコストや実現可能性の問題から分析されないことが多いですが、本研究では末梢血中の主要な白血球集団を同定できるシングル抗体染色パネルを開発しました。これらの集団の染色は45分以内に完了するため、臨床試験での使用が可能です。HVTNでは、このパネルを用いて、HIVワクチン候補の接種後に起こる初期イベントを解明しています。なお、このPIパネルは、個々の研究者が関心を持つ細胞型に焦点を当てるよう、さらに変更することが可能です。ご視聴ありがとうございました。本内容が今後皆様のお役に立てれば幸いです。表1は、末梢血中の主要な白血球集団の表現型解析および計数のために開発された11色抗体染色パネルを示しています。抗体カクテルは、施設間での一貫性を確保し、治験サンプルに使用する前にコントロール血液でカクテルをテストできるようにするため、中央アッセイラボで調製され、処理ラボに送られます。各蛍光標識抗体は個別にタイトレーションされ、その後、適切なタイターを用いて、2%熱不活化胎児牛血清を含むdelcos PBS含有フロー洗浄バッファーとともに単一の混合液に統合されます。抗体カクテルにはバッチ番号と有効期限が記載されており、輸送中に4°Cの温度を維持できる梱包システムを用いて、中央アッセイラボから処理ラボへ配送されます。受領後、抗体染色パネルは遮光状態で4°Cにて最大8週間保存可能です。染色の後、BD FAS溶血液を使用して赤血球を溶血させ、白血球を維持しながら抗体染色を固定します。本溶液は製造元から10倍濃度で提供され、中央アッセイラボにて脱イオン水で10倍に希釈されます。希釈後の溶液にはロット番号と有効期限が記載され、受領後、常温で処理ラボへ配送されます。TrueCount染色のための採血前は、ファックス用溶血液を15〜30°Cの室温で保存してください。処理ラボは、中央アッセイラボからすべての適切な試薬が入手されていることを確認しなければなりません。これらには、BD TRU countチューブ、複合抗体染色パネル、および1x faxライセンシング溶液が含まれます。HVTNでは、ラボデータ管理システムを利用して、各サンプルのすべての関連情報を記録しています。固有の識別コードが印刷されたラベルを、True Countチューブに貼付します。プロセス全体を通じて検体を追跡するため、染色するサンプルを識別するためのラベルをクライオバイアルに貼付してください。通常、これには患者またはボランティアの識別子、受診識別子、および採血日が含まれます。無菌操作を用いて、必要な量の血液をラベル付きのクライオバイアルに分注します。染色のに使用する血液量は、使用する染色パネルによって異なりますが、通常は1パネルあたり50または100 µLです。その後、クライオバイアルは染色まで室温で最大4時間保存することが可能です。残りの血液を用いて、より時間制限のある操作を行います。チューブの底にビーズペレットが完全な状態で存在することを確認し、TruCountチューブにラベルを貼ります。該当する検体情報とともに、すべての試薬のロット番号と有効期限を記録してください。治験全体を通してこれらの情報を追跡するには、ワークシートの使用が有効です。Tru Countチューブのビーズ数およびロット番号は、Tru Countチューブの袋の表面に記載されています。Tru Count染色プロセスを開始する準備ができたら、バイオセーフティキャビネット内で使用するすべての材料と試薬が揃っていることを確認してください。これらには、Tru Countチューブとラベル付けされた血液分注量、複合抗体染色パネルチューブ、10x FACS溶解液、200 µLおよび1000 µLマイクロピペットとピペットチップ、アルミ箔、ラボ用フィルム、および染色後のタイマーが含まれます。また、染色済み検体ボックスも必要ですが、これはフード内に置く必要はありません。使用する血液量および抗体量は、パネルでどの細胞を区別するか、および適切な解析に十分な細胞数がどれくらい必要かによって異なります。各パネルはコントロールサンプルでテストされており、染色に最適な血液量が決定されています。本ビデオで示すパネルで使用する抗体量は、使用する血液量と同量です。ピペッティングの前に、100 µLの血液と100 µLの抗体を用意します。チューブを数回緩やかに転倒混和し、さらにピペッティングで数回穏やかに吸い上げと吐き出しを繰り返して、血液を十分に混合させます。次に、リバースピペッティングを用いて、分注した全血をtru countチューブのメタルリテーナーの直上へ正確にピペッティングします。チューブの側面に血液を塗り広げないようにしてください。tru countチューブ1本ごとにピペットチップを交換してください。次に、ピペッティングを行う前に、抗体染色パネルを用いて血液を染色します。染色パネルをピぺッティングで数回緩やかに混ぜ合わせます。True Countチューブ内の血液に、抗体混合液を100 microliters加えます。貴重な試薬を浪費するため、このステップではリバースピペッティングを行わないでください。チューブにキャップをし、低速で約15秒間ボルテックスして混合します。ビーズペレットが完全に溶解していることを確認してください。チューブをホイルで覆い、血液を15分間染色するためのタイマーを設定します。必要な1x fax slicing solutionの量は、アッセイに使用した血液量の9倍であるため、この例では900 µLの1x fax slicing solutionを使用します。15分間のインキュベーション後、染色した血液に900 µLの1x fax slicing solutionを加え、染色を固定し、赤血球を溶血させます。このステップではリバースピペッティングは不要です。チューブにキャップをし、低速で約15秒間ボルテックスして混合します。キャップをロック位置までしっかりと押し下げて密封してください。ラボ用フィルムを使用します。チューブは、中央アッセイラボに輸送されるまで、暗箱に入れるか、アルミホイルで完全に包み、-65°Cから-95°Cで保存してください。これまでの試験により、サンプルはこの温度で最大4週間安定であることが示されています。染色サンプルは、国際航空運送協会（IATA）に従い、カテゴリーB生物学的物質として輸送する必要があります。HVTNの規定に基づき、サンプルは処理ラボから中央アッセイラボへ、これらの要件を満たすように特別に設計されたSafety Pack Inc.社の断熱輸送システムを用いて週単位で配送されます。本システムを使用する際は、内側の茶色の箱を発泡スチロール製チェストの中に入れ、位置がずれないよう凹みに固定します。チェストいっぱいにドライアイスを満たし、箱が冷却されるまで5〜10分間待ちます。輸送用の検体を準備するため、各チューブとフォイルを完全に包み、染色済み検体ボックスに入れます。吸収材とともに染色済み検体ボックスを漏れ防止ポリ袋に入れます。袋の中の余分な空気を抜き、しっかりと封印します。漏れ防止ポリ袋をタイベック袋に入れます。この際、封印する前に袋の中からすべての空気を抜いてください。検体パッケージを内側の茶色い箱に入れ、発泡スチロール製チェストの蓋をしっかりと閉めます。輸送箱をしっかりとテープで封印し、適切なドライアイスの表示を添えて、カテゴリーBの生物学的物質として発送してください。多施設共同臨床試験においては、IATA PI 650の指示に従ってください。短期保存、輸送、および長期保存の各段階において、検体を追跡管理することが重要です。HVTNが使用しているデータ管理システムでは、サンプルが保管および分析される中央アッセイラボの検体データベースにインポート可能な配送マニフェストを作成できます。これにより、サンプルの発送日および受領日、最終保管場所、および取り出し日の記録が作成されます。分析を行う際は、染色サンプルをフリーザーから取り出し、遮光ボックス内で室温解凍してください。フローサイトメーターでの回収を行う1時間前までに準備してください。複数のサンプルでデータを収集する場合は、各チューブが室温に1時間以上放置されないよう、解凍のタイミングをずらしてください。各サンプルは、BD LSR IIなどの適切なフィルターを備えた4レーザーフローサイトメーターを用いて解析してください。装置で必要な場合は、標準的なサイトメーターのキャリブレーションおよび蛍光補正法を用いてデータを収集してください。しきい値を設定するには、AM Cyanチャンネルのしきい値を可能な限り低く設定してください。フローサイトメーターにロードする前に、サンプルチューブを5秒間ボルテックスしてください。サイトメーター用tru countビーズは、多くのチャネルで強い蛍光を発します。収集時に、ダブルポジティブな集団を特定することでビーズをゲートしてください。PE SCI fiveおよびPCの場合、ビーズと細胞を最も容易に区別できる2つの色は、使用する機器によって異なる場合があることに注意してください。Tru Countビーズのゲートを停止ゲートとして選択し、少なくとも20,000個のビーズが取得されるまでデータを記録します。FlowJoなどの適切なソフトウェアを使用してデータを解析します。次に、代表的なコントロール血液採取のデータを用いて、主要な白血球集団の解析に利用されるゲーティングスキームについて説明します。このパネルを使用することで、NKT細胞や好中球などのより詳細な細胞サブセットを区別することも可能ですが、本例ではそれらは示しません。まず、tru countビーズの周囲にインクルージョンゲートとエクスクルージョンゲートを描き、これらを重ねて配置します。これにより、一つは計数用のビーズを抽出し、もう一つは細胞解析からビーズを除外するために使用します。次に、ビーズを除外した細胞データを、前方散乱光（FSC）の高さ（height）対面積（area）を用いて、シングルセルのみが含まれるようにゲートします。このゲートにより、小さなデブリも除外されます。次にCD 45陽性細胞をゲートし、サイドスキャッターを用いて顆粒球をリンパ球および単球から分離します。その後、CD 14とサイドスキャッターを用いて、リンパ球と単球を3つの独立したグループに分離します。これらには、CD 14陰性リンパ球、すべてのCD 14陰性細胞、および非リンパ球が含まれます。CD 14陰性リンパ球ゲートの細胞は、まずCD 3陽性CD 19陰性、CD 3陰性CD 19陽性、およびCD 3陰性CD 19陰性の3つのグループに分けられます。T細胞は、CD 3陽性CD 19陰性ゲートから抽出されます。その後、CD 56陽性およびCD 16陽性細胞を除外することで、CD 4陽性およびCD 8陽性T細胞を区別できます。B細胞は、CD 56陽性およびCD 16陽性細胞を除外した後、CD 3陰性CD 19陽性ゲートから抽出されます。また、NK細胞はCD 3陰性CD 19陰性ゲートから抽出されます。CD 11 CおよびCD 4を用いて混入の可能性がある単球を除去した後、NK細胞をCD 56 brite、CD 56 DM、およびCD 56 negativeの集団に分画します。樹状細胞集団を区別するため、すべてのCD 14 negative細胞をゲートし、CD 3 positive、CD 19 positive、CD 56 positive、およびCD 16 positive細胞を除外します。そこからHL A DR positive細胞をゲートし、CD 11 CおよびCD 1 23の発現によって骨髄性樹状細胞とプランミサイトイド樹状細胞を区別することができます。最後に、非リンパ球ゲートから、CD 56陽性CD 3陽性およびCD 19陽性の混入細胞を除外した後、単球サブセットをゲートします。非古典的単球、中間的単球、および古典的単球は、CD 16およびCD 14の発現に基づいて区別されます。目的の集団をゲートすると、濃度を算出することができます。ビーズゲート内のイベント数と、もともとチューブに含まれていたビーズの総数を比較することで、回収されたサンプルの割合を決定でき、それを用いて絶対濃度を算出することが可能です。これにより、各集団における1 µLあたりの細胞数を求められます。この目的には、ここに示す計算式を使用できます。このビデオでは、血液処理ラボの技術者が新鮮な全血に対して染色を行い、さらに中央アッセイラボでこれらの染色サンプルを分析するための手順を実演しました。多施設共同臨床試験の文脈において、このアッセイは簡便で所要時間も比較的短いため、血液処理ラボの技術者が実施し、サンプルを凍結して分析を行うための主要なアッセイラボへ輸送することが可能であることを示しました。正確で一貫した結果を得るための鍵は、プロトコルにおける重要なステップを慎重に標準化し、すべての工程を記録するドキュメンテーションシステムを活用して、発見されたあらゆる異常をその発生源まで遡って追跡できるようにすることです。この染色パネルから得られたデータは、白血球濃度の経時的な変化を追跡するために利用でき、さらに発展させることで、目的とする特定の細胞型の活性化状態を容易に評価することが可能です。

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Research

JoVE Journal

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