Name: アコースティック液滴蒸発とバブルが強化された超音波媒介アブレーションのための狭いサイズ分布を有する位相シフトナノエマルジョンの合成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ 位相シフトナノエマルジョンの合成プロトコルと超音波媒介アブレーションにおける気泡生成の効果。脂質被覆ナノエマルジョンの蒸散が加熱効率を向上させ、腫瘍治療への応用基盤を提供する。

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この作品は、BU / CIMIT応用医療工学博士号を取得する前のフェローシップ、工学への参加研究開始グラント（BRIGE）を広げる国立科学財団、国立衛生研究所（R21EB0094930）によってサポートされていました。

1。位相シフトナノエマルジョンの調製（PSNE） <ol><li> 11 mgのDPPCおよびクロロホルム中1.68ミリグラムDSPE-PEG2000を溶解</li><li>ガラス丸底フラスコに乾燥脂質膜を形成するために有機溶剤を蒸発させる</li><li>一晩脂質フィルムをDessicate </li><li>リン酸緩衝食塩水（PBS）の5.5ミリリットルと脂質膜を水和</li><li> 45℃の水浴中で熱ソリューションは、脂質膜は、定期的にボルテックスし、溶解するまで</li><li> 7ミリリットルバイアルに脂質溶液を移す</li><li> 20％の振幅で2分間脂質溶液を超音波処理</li><li> 2.5ミリリットルずつの2つのバイアルに溶液を分ける（残りの0.5ミリリットルを廃棄） </li><li>各バイアルに2.5 mlのPBSを追加</li><li> 0℃の氷水浴中で各バイアルを置きます</li><li>各バイアルに50μlのDDFPを追加</li><li>時間に25％の振幅、パルスモード（10秒オン、50秒オフ）、60秒合計：次の設定を使用して氷水浴中で各バイアルを超音波処理</li><li> TR20mlのシンチレーションバイアルにansfer PSNEソリューション</li><li> 10ミリリットル最終容量で、その結果、各バイアルに5mlのPBSを追加</li><li>製造業者によって提供さ押出次の方向を組み立てる<ol><li>脱イオン水を用いて、各部分をすすぐ</li><li>フィルタ支持基盤の中心にステンレス製のサポートディスクを置きます</li><li>ステンレス鋼のサポートディスクの上にステンレスメッシュを配置</li><li>ピンセットを使用して、ステンレス製のメッシュで押出機ドレンディスク膜（光沢のある面を上に）置く</li><li>ピンセットを使用して、ドレインディスク膜上に押出機フィルター（光沢のある面を上に）置く</li><li>慎重にフィルター上に小さなOリングを配置し、支持基盤上thermobarrelと押出機の上部に置く</li><li>部分的に第1の各ウィングナットを締め、その後完全に交互に手でウィングナットを締め</li><li>に押出機を接続窒素ガスライン</li><li>トップサンプルポートに押出機、ピペット10ミリリットルの脱イオン水を準備するために、開口部をキャップ、ベントバルブを締め</li><li>ゆっくり膜を通してサンプルを強制的に圧力を増加させ、出口チューブからサンプルを収集するために窒素ガスラインを開く</li><li>使用後は、逆の順序で分解し脱イオン水を用いて押出機の部品をすすぎ、メンブレンフィルターとメンブレンドレインディスクを破棄</li></ol></li><li> 200nmのフィルターを通して10回押し出して、100nmの液滴の場合のみ、事前条件PSNE </li><li>フィルターは100nm〜200nmで押し出しPSNEの16倍狭い粒度分布を得るために</li></ol> 2。 PSNEを含むポリアクリルアミドハイドロゲルの調製<ol><li> 5ミリリットルの脱イオン水に1.2グラムのBSA粉末を希釈することによって、24％BSA溶液を準備</li><li> 1ミリリットル脱ウォートで希釈し0.1グラムのAPS粉で10％APS溶液を準備R </li><li>次の順序で、2.1ミリリットルのアクリルアミド溶液、1.2ミリリットルのトリス緩衝液、0.1mlの10％APS、4.5ミリリットル24パーセントBSA溶液、プラスチックチャンバー内で脱イオン水3.6ミリリットルを混ぜる</li><li> 40℃、1時間真空下に置く熱</li><li> PSNEの480μlを加え、徹底的に優しくプラスチックチャンバーを回して混ぜる。 </li><li> 12μlのTEMEDを加え、2時間12℃の水浴で室を配置</li></ol> 3。代表的な結果組織模倣ハイドロゲルファントムによる超音波実験のセットアップの模式図を図1に示します。このプロトコルは、少なくとも1週間は溶液中で安定であり、狭いサイズ分布を有する脂質でコーティングされたパーフルオロカーボン液滴を生じる。動的光散乱（90Plus粒度分布測定装置、ブルックヘブンインスツルメンツ、ホールトヴィル、ニューヨーク州）を用いて測定粒度分布は、押し出さPSNEが100と200を使用するために、図2に示されていますnmのフィルター。動的光散乱法を用いて測定時間をかけPSNE有効径は、PSNEは、少なくとも1週間は安定していることを実証し、表1に示します。ポリアクリルアミドハイドロゲルの気化前後PSNEのBモード画像を図3に示します。また、アルブミンとPSNEを含むポリアクリルアミドハイドロゲルにおけるHIFU媒介の15によって形成された病変秒加熱は、 図4に示されている。病変の非対称形状は、超音波経路における気泡雲の存在に起因して発生するprefocal加熱の結果です。これは、送信された音響の電力を低減することで最小限に抑えることができ、そのprefocal加熱や気泡からの散乱に起因する病変形成に注意することが重要である。 <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig1.jpg" alt="図1"/> 図1：組織-MIMと超音波実験のための実験装置の模式図ヒドロゲルをicking。 <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig2.jpg" alt="図2"/> 図2：サイズ100 nmまたは200 nmのフィルターを通して押し出さPSNEの分布は、動的光散乱法を用いて測定。縦軸の単位は、サンプルからトータル散乱光強度に対して一定の大きさの粒子からの散乱光の強度に基づいています。 <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig3.jpg" alt="図3"/> （3）Bモード画像（）の前と（b）のポリアクリルアミドハイドロゲル中PSNE気化した後の図 。矢印はバブル雲がPSNE蒸発によって形成された震源域を示しています。 <img src="/files/ftp_upload/4308/4308fig4.jpg" alt="図4"/> 図4 polyacrの画像アルブミンとPSNE含むイルアミドハイドロゲルは、（a）、HIFUによる気化、超音波処理前と（b）の後、超音波誘導加熱の結果として病巣の形成を実証しています。超音波の中心周波数は3.3 MHzである。超音波信号は、直ちに0.77 Wで連続的な超音波の15秒、続いてPSNEを蒸発させるために最初の30サイクル、6.4 Wのパルスで構成されてい<table border="1"><tbody><tr><td rowspan="2"> 押出後の日 </td><td colspan="2"> 200 nmフィルターで押し出し </td><td colspan="2"> 100 nmフィルターで押し出し </td></tr><tr><td> 径を意味します。 （NM） </td><td> STD。 devの。 （NM） </td><td> 径を意味します。 （NM） </td><td> STD。 devの。 （NM） </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 182.9 </td><td> 4.9 </td><td> 118.0 </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> 7 </td> &lt;TD&gt; 177.7 </td><td> 2.5 </td><td> 124.8 </td><td> 3.1 </td></tr></tbody></table> 表1。100 nmと200 nmのフィルターを備えた押出後の1及び7日目の直径とPSNEの標準偏差を平均値。

<ol><li>Hynynen, K., Darkazanli, A., Unger, E., Schenck, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI-guided+noninvasive+ultrasound+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Phys%22%5BJournal%5D)">MRI-guided noninvasive ultrasound surgery.</a> Med. Phys. 20, 107-115 (1993).</li>
<li>Baban, D. F., Seymour, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+tumour+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Control of tumour vascular permeability.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 34, 109-119 (1998).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> J. Control. Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Schadlich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+accumulation+of+NIR+fluorescent+PEG-PLA+nanoparticles%3A+impact+of+particle+size+and+human+xenograft+tumor+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Tumor accumulation of NIR fluorescent PEG-PLA nanoparticles: impact of particle size and human xenograft tumor model.</a> ACS Nano. 5, 8710-8720 (2011).</li>
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<li>Martz, T. D., Sheeran, P. S., Bardin, D., Lee, A. P., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+manufacture+of+phase-change+perfluorocarbon+droplets+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Precision manufacture of phase-change perfluorocarbon droplets using microfluidics.</a> Ultrasound Med. Biol. 37, 1952-1957 (2011).</li>
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<li>Allen, T. M., Hansen, C., Martin, F., Redemann, C., Yau-Young, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+containing+synthetic+lipid+derivatives+of+poly%28ethylene+glycol%29+show+prolonged+circulation+half-lives+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Liposomes containing synthetic lipid derivatives of poly(ethylene glycol) show prolonged circulation half-lives in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1066, 29-36 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maruyama, K., Beckerleg, A. M., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity+of+amphipathic+poly%28ethylene+glycol%29+5000+to+prolong+the+circulation+time+of+liposomes+depends+on+the+liposome+size+and+is+unfavorable+for+immunoliposome+binding+to+target%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Activity of amphipathic poly(ethylene glycol) 5000 to prolong the circulation time of liposomes depends on the liposome size and is unfavorable for immunoliposome binding to target.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1062, 142-148 (1991).</li>
<li>Klibanov, A. L., Maryama, K., Torchilin, V. P., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphipathic+polyethyleneglycols+effectively+prolong+the+circulation+time+of+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes.</a> FEBS Lett. 268, 235-237 (1990).</li>
<li>Gabizon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+circulation+time+and+enhanced+accumulation+in+malignant+exudates+of+Doxorubicin+encapsulated+in+polyethylene-glycol+coated+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of Doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes.</a> Cancer Res. 54, 987-992 (1994).</li>
<li>Awasthi, V. D., Garcia, D., Goins, B. A., Philips, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+biodistribution+profiles+of+long-circulating+PEG-liposomes+of+various+sizes+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Circulation and biodistribution profiles of long-circulating PEG-liposomes of various sizes in rabbits.</a> Int. J. Pharm. 253, 121-132 (2003).</li>
<li>Zhang, P., Porter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+study+of+a+phase-shift+nanoemulsion%3A+a+potential+nucleation+agent+for+bubble-enhanced+HIFU+tumor+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">An in vitro study of a phase-shift nanoemulsion: a potential nucleation agent for bubble-enhanced HIFU tumor ablation.</a> Ultrasound Med. Biol. 36, 1856-1866 (2010).</li>
<li>Lafon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel+phantom+for+use+in+high-intensity+focused+ultrasound+dosimetry%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Gel phantom for use in high-intensity focused ultrasound dosimetry.</a> Ultrasound Med. Biol. 31, 1383-1389 (2005).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

高強度集束超音波（HIFU）は熱的に腫瘍を切除するために臨床的に使用されます。1が局部加熱を強化し、腫瘍内の熱焼灼を改善するために、脂質でコーティングされたパーフルオロカーボン液滴は、HIFUによって蒸発させることができるが開発されてきた。多くの腫瘍における血管系が原因で彼らの急速な成長に異常漏出であり、図2は、このように、ナノ粒子は、腫瘍内に蓄積受動強化された透過性と保持（EPR）効果として知られているプロセスを開窓を貫通し、することができます。3は、それがあることが示されている70〜200nmのナノ粒子が腫瘍で最も効率的に蓄積されます。このレポートに記載されて4の手順では、狭いサイズ分布を有する脂質でコーティングされたパーフルオロカーボン液滴の安定した位相シフト·ナノエマルジ ​​ョン（PSNE）を生成します。過去には、ほとんどの研究はPSNEの多分散サイズ分布を使用しましたが、最近の研究では、狭いサイズ分布とPSNEを生産に焦点を当てている。5,6このプロトコールに記載押出法は、1つは腫瘍内に蓄積され、全身投与された液滴の割合を増加させるために...

<table border="1"><tbody><tr><td> 共通名 </td><td> メーカー </td><td> 猫。数 </td><td> 完全な名前/説明 </td></tr><tr><td> DPPC </td><td>アヴァンティ脂質、アラバスター、アラバマ、米国</td><td> 850355P </td><td> 1,2 - ジパルミトイル-sn-グリセロ-3 - ホスホコリン</td></tr><tr><td> DSPE-PEG2000 </td><td>アヴァンティ脂質、アラバスター、アラバマ、米国</td><td> 880120P </td><td> 1,2 - ジステアロイル-sn-グリセロ-3 - ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ（ポリエチレングリコール）-2000]（アンモニウム塩） </td></tr><tr><td> DDFP </td><td> Fluoromed、ラウンドロック、テキサス州、アメリカ合衆国</td><td> CAS：138495-42-8 </td><td>ドデカ（C 5 F 12） </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td> P2194 </td><td>リン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td> Sigma-Aldrich社、セント。ルイ、ミズーリ州、米国</td><td> 372978 </td><td>クロロホルム</td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td> A9926 </td><td> 40パーセント19時01アクリルアミド/ビスアクリルアミド</td></tr><tr><td>トリス緩衝液</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td> T2694 </td><td> 1M、pHを8、トリズマ塩酸塩とトリズマベース</td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td> A3059 </td><td>ウシ血清アルブミン</td></tr><tr><td> APS </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td> A3678 </td><td>過硫酸アンモニウム溶液</td></tr><tr><td> TEMED </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州、米国</td><td> 87689 </td><td> N、N、N &#39;、N&#39;-テトラメチルエチレンジアミン</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>ソニケーター（3mmの先端） </TD&gt; <td>ソニックス＆マテリアルズ、ニュータウン、コネチカット州、アメリカ合衆国</td><td>振動セル</td><td></td></tr><tr><td>水浴</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国</td><td> Neslab EX-7 </td><td></td></tr><tr><td>押出機</td><td>ノーザン脂質、バーナビー、BC、カナダ</td><td>ライペックス</td><td></td></tr><tr><td>押出機フィルター</td><td>ワットマン、ピスカタウェイ、NJ、USA </td><td> Nuclepore＃110605と＃110606 </td><td></td></tr><tr><td>押出機ドレインディスク</td><td> Sterlitechコーポレーションケント、ワシントン州、アメリカ合衆国</td><td> ＃PETEDD25100 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック容器</td><td>米国プラスチック（株）、リマ、オハイオ州、米国</td><td> ＃55288、1 3/16 &quot;×3/16&quot;×2 7/16 &quot; </td><td></td></tr></tbody></table>

アコースティック液滴蒸発とバブルが強化された超音波媒介アブレーションのための狭いサイズ分布を有する位相シフトナノエマルジョンの合成

Synthesis of Phase-shift Nanoemulsions with Narrow Size Distributions for Acoustic Droplet Vaporization and Bubble-enhanced Ultrasound-mediated Ablation

高強度集束超音波（HIFU）は、熱的に腫瘍を切除するために臨床的に使用されます。局部加熱を強化し、腫瘍内の熱焼灼を改善するために、脂質でコーティングされたパーフルオロカーボン液滴は、HIFUによって蒸発させることができるが開発されてきた。多くの腫瘍における血管系が原因で彼らの急速な成長に異常漏出であり、ナノ粒子は、開窓を貫通し、受動的に腫瘍内に蓄積することができます。このように、液滴の大きさを制御することは腫瘍内の良い蓄積をもたらすことができます。本報告では、狭いサイズ分布を有する位相シフトナノエマルジョン（PSNE）で安定した液滴の調製が記載されている。 PSNEは液体パーフルオロカーボンの存在下で脂質溶液を超音波処理することによって合成した。狭いサイズ分布は、100または200 nmの細孔径を持つフィルタを使うPSNE複数回押し出すことにより得られた。粒度分布は、動的光散乱法を用いて7日間にわたって測定した。 PolyacPSNEを含むrylamideのヒドロゲルは、in vitroの実験のために調製した。ヒドロゲルでPSNE滴は、超音波および結果として生じる泡強化局所的に加熱して気化された。気化PSNEはより急速加熱を可能にし、また熱アブレーションに必要な超音波強度を低減します。したがって、PSNEは、潜在的にHIFU媒介熱アブレーション治療の治療成績を向上させ、腫瘍内の熱アブレーションを高めることが期待される。

位相シフトナノエマルジョン（PSNE）は局所的な加熱を強化し、腫瘍内の熱焼灼を向上させるために高強度集束超音波を用いて蒸発させることができる。本報告では、狭いサイズ分布を有する安定したPSNEの調製が記載されている。さらに、超音波媒介アブレーションで気化PSNEの影響は組織模倣ファントムに示されています。

高強度集束超音波（HIFU）は、腫瘍を熱凝固させるために臨床的に用いられています。局所的な加熱を促進し、...における熱凝固能を向上させるために、

本実験の全般的な目的は、音響的に気化させた脂質被覆ナノエマルションによって生成される気泡が、超音波介在性アブレーションに及ぼす影響を観察することである。まず、アルブミン含有ポリアクリルアミドハイドロゲル全体に脂質被覆ナノエマルションを分散させる。次に、集束型トランスデューサを用いてハイドロゲル内に短時間の高振幅パルスを送信し、焦点付近でナノエマルションを局所的に気化させる。その後、生成された気泡を超音波で連続的に駆動させると、気泡から放射される音響エネルギーがハイドロゲルに急速に吸収され、超音波介在性加熱の速度が加速する。結果から、気泡が存在することで、タンパク質変性の閾値温度までハイドロゲルを加熱するために必要な時間とエネルギーが劇的に減少し、より迅速で効率的な超音波介在性アブレーションが可能になることが示されました。相転移ナノエマルションのサイズは、圧力閾値を決定する重要な要因となります。音響蒸発に関して、我々は、狭いサイズ分布と明確な蒸発閾値を持つ安定した相転移ナノエマルションを製造するプロトコルと、超音波媒体アブレーションへの影響を評価するためのin vitroシステムを開発しました。本稿ではin vitroシステムについて記述しますが、ナノエマルションは、音響的に気化可能な粒子を用いて、血管外組織および固形腫瘍を可視化するように設計されています。形成された気泡は、がん治療における診断または治療への応用に利用できます。相転移ナノエマルション（PSNE）の調製手順を開始するには、まず脂質を混合し、11 mgのDPPCと1.7 mgのDSPEを溶解させます。ガラス製丸底フラスコにクロロフォームに溶解したPeg 2000を入れます。丸底フラスコを化学薬品用ドラフト内の50 °Cの水槽に置き、アルゴンガスを流して有機溶媒を蒸発させます。乾燥脂質膜を形成するため、フラスコをデシケーターに入れ、一晩真空状態で保持し、翌朝に脂質膜を乾燥させます。5.5 millilitersのPBSで脂質膜を再水和させます。脂質膜が溶解するまで、45 degree Celsiusのウォーターバスで溶液を加熱し、確認します。脂質溶液を7 millilitersのバイアルに移し、プローブソニケーターを用いて20% amplitudeで2分間超音波処理を行います。溶液を2.5 mLずつ2本のバイアルに分注します。残りの0.5 mLは廃棄します。各バイアルに2.5 mLのPBSを加え、その後、両方のバイアルを0 °Cの氷水浴に入れます。各バイアルに50 µLのdoca fluoro pentane（DDFP）を添加します。DDFP脂質混合物を氷水浴で処理することが、本手順において最も重要な点です。液体パーフルオロカーボン（per fluorocarbon）の蒸発を防ぐために、氷水バスを使用します。この工程では、25% amplitudeのパルスモード、総時間60秒の設定で、氷水バスに入れた各バイアルをソニケーションします。ソニケーション後、PSNE溶液を20 mLのシンチレーションバイアルに移し、各バイアルに5 mLのPBSを加えることで、最終的に1バイアルあたり10 mLの容量にします。製造元の指示に従ってエクストルーダーを組み立て、プライミングを行います。脱イオン水10 millilitersを上部のサンプルポートにピペットで注入します。開口部をキャップし、ベントバルブを締めて固定します。窒素ガスラインをゆっくりと開き、圧力を上げてサンプルをメンブレンに押し出します。出口チューブからサンプルを回収し、PSNEを100 nanometerまたは200 nanometerのフィルターで16回押し出して、狭いサイズ分布を得ます。まず、PSNEを含むポリアクリルアミドハイドロゲルを調製して、この手順を開始してください。まず、2.4 gのBSA粉末を10 mLの脱イオン水に溶解させ、24%牛血清アルブミン（BSA）溶液を調製します。次に、1 gのPS粉末を10 mLの脱イオン水で希釈し、10%過硫酸アンモニウム（PS）溶液を調製します。これらの試薬をプラスチック型に、アクリルアミド溶液 2.1 mL、Tris緩衝液 1.2 mL、10% PS溶液 0.1 mL、24% BSA溶液 4.5 mL、脱イオン水 3.6 mLの順に混合します。この溶液をウォーターバスで40 °Cに加熱し、その後真空状態で1時間静置して液中の脱気を行います。これは、1時間後にハイドロゲル内で不要な気泡が形成されるのを防ぐために必要です。真空状態から取り出し、480 µLのPSNE懸濁液を加え、プラスチックチャンバーをゆっくりと回して十分に混合させます。化学薬品用ドラフトチャンバー内で、アクリルアミドを重合させるために12 µLのテトラエチルエチレンジアミン（TEMED）を加え、チャンバーを12 °Cの水槽に2時間置きます。重合反応は発熱反応であるため、重合中のPSEの気化を防ぐために冷却バスが必要です。アクリルアミドの重合が完了したら、DGA脱イオン水で満たしたアクリルタンク内に、集束パワートランスデューサとイメージングプローブを配置し、イメージング平面がトランスデューサの焦点体積と重なるようにします。次に、PSNEを充填したポリアクリルアミドハイドロゲルをパワートランスデューサの焦点に配置し、短い音響パルスを用いてハイドロゲル内のPSNEを気化させ、続いて15秒間の連続波照射を行い、気泡によるアブレーション効果を高めます。BSAが変性するにつれて、診断用超音波スキャナーによる気化と気泡形成に伴う超音波の吸収と熱発生により、ハイドロゲルは不透明になります。この例示画像では、矢印はPSNEの気化によって気泡群が形成された焦点領域を示しています。PSNEを換えずに、ハイドロゲルの新しい箇所で音響曝露を繰り返し、アブレーション時間と体積を比較します。このプロトコルにより、粒径分布の狭い脂質被覆パーフルオロカーボン液滴が得られます。ここでは、100 nmおよび200 nmのフィルターを用いて押し出したPSNEについて、動的光散乱法で測定した粒径分布を示しています。縦軸の単位は、サンプルからの全散乱光強度に対する、特定のサイズの粒子からの散乱光強度の比に基づいています。100 nmおよび200 nmのフィルターを用いて押し出した1日後と7日後のPSNEの平均粒径および標準偏差を動的光散乱法で測定したところ、PSNEが少なくとも1週間は安定していることが示されました。この図は、気化前後のPSNEのBモード画像を示しています。ポリアクリルアミドハイドロゲルにおいて、矢印はPSNEの気化によって気泡群が形成された焦点領域を示しています。これらは、アルブミンとPSNEを含むポリアクリルアミドハイドロゲルの、高強度集束超音波（HyFu）による気化およびソニケーション前後の画像です。15秒間のHyFuによる加熱によって病変が形成されています。病変の非対称な形状は、超音波の経路に気泡群が存在することで生じる焦点前加熱の結果です。気泡による散乱に起因する焦点前加熱および病変形成は、気泡発生後の送信音響電力を低減させることで最小限に抑えることができます。安定した相転移ナノエマルジョンを製造するこの手法は、超音波治療分野の研究者が、固形腫瘍における気泡増強HIFUアブレーションを探索するための道を切り拓くものです。このビデオを視聴することで、サイズ分布の狭い安定した相転移ナノエマルジョンの製造方法、および気泡の核形成と超音波増強アブレーションの研究手法について、十分に理解することができます。

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