アコースティック液滴蒸発とバブルが強化された超音波媒介アブレーションのための狭いサイズ分布を有する位相シフトナノエマルジョンの合成

本実験の全般的な目的は、音響的に気化させた脂質被覆ナノエマルションによって生成される気泡が、超音波介在性アブレーションに及ぼす影響を観察することである。まず、アルブミン含有ポリアクリルアミドハイドロゲル全体に脂質被覆ナノエマルションを分散させる。次に、集束型トランスデューサを用いてハイドロゲル内に短時間の高振幅パルスを送信し、焦点付近でナノエマルションを局所的に気化させる。その後、生成された気泡を超音波で連続的に駆動させると、気泡から放射される音響エネルギーがハイドロゲルに急速に吸収され、超音波介在性加熱の速度が加速する。

結果から、気泡が存在することで、タンパク質変性の閾値温度までハイドロゲルを加熱するために必要な時間とエネルギーが劇的に減少し、より迅速で効率的な超音波介在性アブレーションが可能になることが示されました。相転移ナノエマルションのサイズは、圧力閾値を決定する重要な要因となります。音響蒸発に関して、我々は、狭いサイズ分布と明確な蒸発閾値を持つ安定した相転移ナノエマルションを製造するプロトコルと、超音波媒体アブレーションへの影響を評価するためのin vitroシステムを開発しました。

本稿ではin vitroシステムについて記述しますが、ナノエマルションは、音響的に気化可能な粒子を用いて、血管外組織および固形腫瘍を可視化するように設計されています。形成された気泡は、がん治療における診断または治療への応用に利用できます。相転移ナノエマルション（PSNE）の調製手順を開始するには、まず脂質を混合し、11 mgのDPPCと1.7 mgのDSPEを溶解させます。

ガラス製丸底フラスコにクロロフォームに溶解したPeg 2000を入れます。丸底フラスコを化学薬品用ドラフト内の50 °Cの水槽に置き、アルゴンガスを流して有機溶媒を蒸発させます。乾燥脂質膜を形成するため、フラスコをデシケーターに入れ、一晩真空状態で保持し、翌朝に脂質膜を乾燥させます。

5.5 millilitersのPBSで脂質膜を再水和させます。脂質膜が溶解するまで、45 degree Celsiusのウォーターバスで溶液を加熱し、確認します。脂質溶液を7 millilitersのバイアルに移し、プローブソニケーターを用いて20% amplitudeで2分間超音波処理を行います。

溶液を2.5 mLずつ2本のバイアルに分注します。残りの0.5 mLは廃棄します。各バイアルに2.5 mLのPBSを加え、その後、両方のバイアルを0 °Cの氷水浴に入れます。

各バイアルに50 µLのdoca fluoro pentane（DDFP）を添加します。DDFP脂質混合物を氷水浴で処理することが、本手順において最も重要な点です。

液体パーフルオロカーボン（per fluorocarbon）の蒸発を防ぐために、氷水バスを使用します。この工程では、25% amplitudeのパルスモード、総時間60秒の設定で、氷水バスに入れた各バイアルをソニケーションします。ソニケーション後、PSNE溶液を20 mLのシンチレーションバイアルに移し、各バイアルに5 mLのPBSを加えることで、最終的に1バイアルあたり10 mLの容量にします。

製造元の指示に従ってエクストルーダーを組み立て、プライミングを行います。脱イオン水10 millilitersを上部のサンプルポートにピペットで注入します。開口部をキャップし、ベントバルブを締めて固定します。

窒素ガスラインをゆっくりと開き、圧力を上げてサンプルをメンブレンに押し出します。出口チューブからサンプルを回収し、PSNEを100 nanometerまたは200 nanometerのフィルターで16回押し出して、狭いサイズ分布を得ます。まず、PSNEを含むポリアクリルアミドハイドロゲルを調製して、この手順を開始してください。

まず、2.4 gのBSA粉末を10 mLの脱イオン水に溶解させ、24%牛血清アルブミン（BSA）溶液を調製します。次に、1 gのPS粉末を10 mLの脱イオン水で希釈し、10%過硫酸アンモニウム（PS）溶液を調製します。これらの試薬をプラスチック型に、アクリルアミド溶液 2.1 mL、Tris緩衝液 1.2 mL、10% PS溶液 0.1 mL、24% BSA溶液 4.5 mL、脱イオン水 3.6 mLの順に混合します。この溶液をウォーターバスで40 °Cに加熱し、その後真空状態で1時間静置して液中の脱気を行います。

これは、1時間後にハイドロゲル内で不要な気泡が形成されるのを防ぐために必要です。真空状態から取り出し、480 µLのPSNE懸濁液を加え、プラスチックチャンバーをゆっくりと回して十分に混合させます。化学薬品用ドラフトチャンバー内で、アクリルアミドを重合させるために12 µLのテトラエチルエチレンジアミン（TEMED）を加え、チャンバーを12 °Cの水槽に2時間置きます。

重合反応は発熱反応であるため、重合中のPSEの気化を防ぐために冷却バスが必要です。アクリルアミドの重合が完了したら、DGA脱イオン水で満たしたアクリルタンク内に、集束パワートランスデューサとイメージングプローブを配置し、イメージング平面がトランスデューサの焦点体積と重なるようにします。次に、PSNEを充填したポリアクリルアミドハイドロゲルをパワートランスデューサの焦点に配置し、短い音響パルスを用いてハイドロゲル内のPSNEを気化させ、続いて15秒間の連続波照射を行い、気泡によるアブレーション効果を高めます。

BSAが変性するにつれて、診断用超音波スキャナーによる気化と気泡形成に伴う超音波の吸収と熱発生により、ハイドロゲルは不透明になります。この例示画像では、矢印はPSNEの気化によって気泡群が形成された焦点領域を示しています。PSNEを換えずに、ハイドロゲルの新しい箇所で音響曝露を繰り返し、アブレーション時間と体積を比較します。

このプロトコルにより、粒径分布の狭い脂質被覆パーフルオロカーボン液滴が得られます。ここでは、100 nmおよび200 nmのフィルターを用いて押し出したPSNEについて、動的光散乱法で測定した粒径分布を示しています。縦軸の単位は、サンプルからの全散乱光強度に対する、特定のサイズの粒子からの散乱光強度の比に基づいています。

100 nmおよび200 nmのフィルターを用いて押し出した1日後と7日後のPSNEの平均粒径および標準偏差を動的光散乱法で測定したところ、PSNEが少なくとも1週間は安定していることが示されました。この図は、気化前後のPSNEのBモード画像を示しています。ポリアクリルアミドハイドロゲルにおいて、矢印はPSNEの気化によって気泡群が形成された焦点領域を示しています。

これらは、アルブミンとPSNEを含むポリアクリルアミドハイドロゲルの、高強度集束超音波（HyFu）による気化およびソニケーション前後の画像です。15秒間のHyFuによる加熱によって病変が形成されています。病変の非対称な形状は、超音波の経路に気泡群が存在することで生じる焦点前加熱の結果です。気泡による散乱に起因する焦点前加熱および病変形成は、気泡発生後の送信音響電力を低減させることで最小限に抑えることができます。

安定した相転移ナノエマルジョンを製造するこの手法は、超音波治療分野の研究者が、固形腫瘍における気泡増強HIFUアブレーションを探索するための道を切り拓くものです。このビデオを視聴することで、サイズ分布の狭い安定した相転移ナノエマルジョンの製造方法、および気泡の核形成と超音波増強アブレーションの研究手法について、十分に理解することができます。