Name: 腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: 学ぶ成体マウスの運動ニューロンと筋線維の同時細胞内記録法。電気生理学的特性と収縮特性を同時に測定し、神経筋系の機能を包括的に解析する技術です。

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この作品は、財団からの資金援助のおかげで可能にラRECHERCHEMédicale（FRM）、ALSの研究（ALS協会）のミルトンSafenowitzポスドク、NIHの助成NINDS NS05462とNS034382、及びANRグラントHyperMNDを注ぎました。

1。ステップワンプリ麻酔薬：麻酔導入前に10〜15分間、それぞれ流涎および浮腫を防ぐため、アトロピン（0.20 mg / kg）及びmethylprenidsolone（0.05 mg）を皮下に注射する。 2。ステップ2 麻酔導入：ペントバルビタールナトリウム（70 mg / kg）をまたはケタミン/キシラジンの混合物（それぞれ100 mg / kgおよび10 mg / kgの）腹腔内に注入します。マウスがないつま先のピンチ反射が得られないことができるようになるまで下に行きましょう。麻酔が軽すぎると思われる場合は、投与量の1/4で補う。 3。ステップスリー *注：この手術は、端末の手順です。 麻酔の外科平面に達したときは、腹臥位で提起された暖かい毛布の上にマウスを移す。 <ol><li> 100ミリリットル/分の周りの流れに純粋なO 2を提供するマスクを使用してマウスの鼻をカバーしています。 </li><li&gt;はバリカンを使用して、首筋から尾の付け根に背部を剃る。 </li><li>また、右後肢を剃る。 </li><li>仰臥位にマウスを裏返しますが、代わりに酸素マスクを残すために世話をする。 </li></ol> 4。ステップ4 手足に巻回され、作業面の四隅に固定縫合のある場所でマウスを固定します。 5。ステップ5 マウスのコア温度を監視する温度プローブを挿入します。 36℃と38℃の間でコア温度を維持するために、加熱毛布/ランプ電力を調整する 6。気管切開と人工換気<ol><li>鈍はさみを使用して、気管の上にカットして、両側の肌を引き出します。 </li><li>気管を覆う二つの薄い筋（胸骨舌骨）を露出するように鈍い鉗子を用いて、唾液腺を引き裂く。 </li><li> 2 MUSC別、鈍鉗子を用いて気管を明らかにするために彼らの内側に沿って分離レ。 </li><li>デュモン7鉗子を用いて、気管の下に4.0絹縫合糸の2つの長さをスライドさせます。 </li><li> 2軟骨のリングの間で気管内横断カットしてではなく、セクション気管を完全に世話をする。 </li><li>気管ダウン気管チューブを挿入し、その上に糸を結ぶことにより、挿入口の両側に固定します。気管チューブは、マウス人工呼吸器（SAR-830​​/AP、CWE社）とカプノグラフ（μcapstar、CWE社）に接続されています。人工呼吸器は、純粋なO 2のソースに、コンプライアンス袋を通して、接続されています。マウスは人工呼吸と戦っておらず、呼吸終期PCO 2が 4と5％の間で安定しているように、人工呼吸器（呼吸速度100から150拍、呼吸終期の容積170から310μL）のパラメータを調整します。 </li></ol> 7。静脈ラインの配置<ol><li>鈍的剥離技術を使用して、頸静脈を露出首の片側の静脈。このレベルでは、頸静脈は、2つの主要なトランク、前部と後部の顔面静脈に分割されます。 </li><li>これらのトランクのそれぞれについて、1回のセットを次の手順を実行します。 <ol><li>デュモン4または5の鉗子を使用して、その周囲の結合組織から静脈を慎重に分離します。 </li><li>デュモン7鉗子を用いて、静脈の下に6.0絹縫合糸の2つの長さをスライドさせます。静脈の長さに沿って可能な限りそれらを分離。 </li><li>静脈（心臓に近い側）の近位側にある小さな血管クリップを配置し、静脈の遠位側をオフに接続します。 </li><li>非常に微細なアイリスはさみを使用して、完全にセクションに静脈を細心の注意を払っていない取って、静脈内に小さな横切開を行います。 </li><li>アップ血管クリップに、開口部にプレフィル1FRカテーテル（premicath、Vygon）を挿入します。 </li><li> 、デュモン4鉗子で一緒に静脈カテーテルを保持して慎重に血管クリップを削除し、その後いくつかのMORカテーテルをプッシュ静脈へのeはミリメートル。 </li><li>挿入の両側の両方の縫合糸とそれを結ぶことによってカテーテルを固定します。 </li></ol></li><li>カテーテルの一つは、注射器や麻酔の補足投与、必要に応じて（通常は毎年10月30日分）を注入するシリンジポンプに接続されています。 IV用量は、ペントバルビタールナトリウムまたは1250年40μg/ kgの/ケタミン/キシラジン12分のいずれかの6 mg / kgである。他のカテーテルをNaHCO 3（1％）とplasmion（14％）を含む4％グルコース溶液をゆっくり静脈内注入（50μL/ HR）のシリンジポンプに接続されています。 </li></ol> 8。針および縫合糸と首の皮膚を閉じて、腹臥位にマウスを返す 9。後肢の筋肉と神経の解剖<ol><li>はさみを使って、太ももの上からアキレス腱に切り込みを入れる。血管を傷つけないように注意しながら、下層にある筋肉から皮膚を分離。必要に応じて焼灼する。 </li><li&gt;の腿を走って白い線として現れる大腿二頭筋の前縁を識別します。はさみを使って、慎重に膝からのラインに沿って腰の骨へのすべての道を開く。筋肉を区切ります。坐骨神経は現在、大腿二頭筋の下に表示されます。 </li><li>慎重に大腿二頭筋を解剖。出血を防ぐために、必要に応じて/リガチャーを焼灼する。大腿二頭筋は完全に削除されたり、単に坐骨神経と下腿三頭筋の筋肉を露出させるためにリクライニングすることができます。 </li><li>腓腹神経を解剖する。 </li><li> 8/0絹糸を使用し、総腓骨神経の遠位部を縛って、結び目の遠位にカットします。できるだけ腰に近づけて、神経のすべての方法を解剖する。 </li><li>総腓骨、腓腹神経間における脛骨神経を識別します。脛骨神経の別の支店の中では、（以下、脛骨神経とも呼ばれる）深く行く枝からトライセップス·下腿を支配ブランチを識別する。 </li><li> 8/0シルクを使用した枝はトライセップス·下腿を支配そのまま維持しながらスレッド、脛骨神経のすべての支店を結びつける。結び目に対して遠位脛骨神経をカットし、可能な限り神経を解剖する。 </li><li>次の手順に進む一方dessicationを防止するために生理食塩水を吸収させたガーゼで全体の後肢をカバーしています。 </li></ol> 10。椎弓切除術<ol><li>はさみを使って、骨格に沿って切り込みを入れる。下層にある筋肉から皮膚を分離します。 </li><li>皮下の筋肉を分離するために椎骨の両側にある2つの切開を行う。次に、それぞれの側の椎骨の側に取り付ける筋肉の各腱を切った。 </li><li>鈍鉗子と罰金キュレット使用して、明らかに個々の椎骨を特定するために棘突起の周りの脊椎の背側の筋肉の残りの部分を削除します。 </li><li>椎骨T13とL1を識別します。 T13は取り付けリブを持っている最後の椎骨である。脊柱ワット病気カニンガム脊髄脊椎のクランプ（株式会社Stoelting）を使用して固定化する。 T13とL1のそれぞれの側に脊髄クランプを置きます。脊髄を圧迫しますが、縦軸にテンションを少しかけないように注意してください。脊柱はよくピンセットで軽く押し下げて固定されていることを確認してください。 </li><li>細かいrongeursを使用して、それによって脊髄を露出し、T13とL1を介してその後ラミナを脊髄プロセスを削除します。 </li><li>乾燥を防ぐために、生理食塩水を吸収させ、綿またはspongelの小さなビットで露光脊髄をカバーしています。 </li><li>脊髄を取り巻く、背中の上にプラスチック製のお風呂を作ったカスタムを置きます。 4/0絹糸を使ってその場でお風呂を固定します。浴はクイック·キャストシーラント（WPI）とそれを封止することで防水であることを確認します。 </li><li>クイック·キャストが乾燥した後、脊髄を覆っている綿を除去し、ミネラルオイルと一緒にお風呂を埋める。 </li><li>デュモン5鉗子、非常に微細な虹彩のはさみを使って、優しく硬メイトを引っ張るrは脊髄を囲むと、両方の方向に可能な限りそれを開きます。脊髄の両側にある硬膜を折る。 </li><li>それが椎クランプによって中断保つようにマウスがそう嘘をついている上げられたプラットホームを下げます。 </li><li>動物の背中の領域をサポートするために仙骨部の棘突起をクランプするために別の椎クランプを使用しています。 </li><li>第3のクランプは、右後肢と足首を固定するために使用され、膝で90°の角度で屈曲。 </li></ol> 11。アキレス腱解剖<ol><li>手足が膝と足首は90°に曲げて、後肢領域をカバーガーゼを除去し、周囲組織の自由なアキレス腱を解剖。だけでなく、周囲の組織からできるだけ多くの下腿三頭筋を解剖。 </li><li>踵骨に近い足底筋の腱を切断し、その後完全に腱を削除するには、もう一度それをカット。 </li><li>スレッドニードルを使用して、目を通って6/0絹糸を添付電子アキレス腱と腱の周りトリプル結び目を作る。 </li><li>結び目に近い力変換器を配置し、腱の遠位部をカットし、絹糸を使用して力変換器に取り付けます。 </li><li>上腕三頭筋の下腿筋の筋膜の下にステンレス鋼線の2つの長さを挿入します。これらの配線は、筋電図記録用外ACアンプに接続されています。 </li><li> 2バイポーラフック電極上に総腓骨神経と脛骨神経を置きます。 </li><li>陽極は周辺の筋肉に触れると、フック電極の陰極上トライセップス·下腿の神経を置きます。 </li><li>分離ユニットにすべての刺激電極を接続する。 </li><li>脊髄背電位を記録するために外のACアンプに接続されている脊髄の後面には、ボール電極を配置します。背中の筋肉と接触したAg / AgCl参照電極を配置します。 </li></ol> 12。ステップ十二上腕三頭筋の下腿の神経を刺激する最大収縮振幅が観察されるまで、低周波（&lt;1 Hz）での増加強度の50μsecの方形パルスを使用しています。ゆっくり収縮の振幅が最大に達するまで攣縮反応の振幅を監視しながら、筋肉をストレッチする力変換器を移動します。 13。運動ニューロンの細胞内記録この時点から、標準的​​な電気生理学的手法、細胞内電極を準備脊髄ニューロンを貫通し、運動ニューロンとしてそれを識別するために使用されます。 <ol><li>ピペットプラー（P-97マイクロピペットプラー、サッターInstruments）を用いて約1μmの先端にガラスマイクロピペットを引き抜きます。 KClの3M溶液（MΩ電極10から20までの抵抗）で電極を埋める。 </li><li>マイクロポジショナーを使用して、脊髄に細胞内のアンプに接続し、マイクロピペットを、（Axoclamp 2B、アクソン·インスツルメンツ）を駆動する。 eの刺激によって誘発される局所電場電位を監視ACHは神経トライセップス·下腿のモータープールを検索する。 </li><li>微小電極の抵抗を監視しながら、推定上の運動ニューロンを慎重に近づく。膜に押し付けたときに、抵抗が増加します。浸透はいつか細胞内のアンプの &quot;バズ&quot;機能を使用することにより容易に行うことができる。 </li></ol> 14。安楽死手順実験の最後に、動物を断頭続いペントバルビタールの過剰投与（210 mg / kgをIV）によって安楽死させています。

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<li>Husch, A., Cramer, N., Harris-Warrick, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+duration+perforated+patch+recordings+from+spinal+interneurons+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Long duration perforated patch recordings from spinal interneurons of adult mice.</a> Journal of Neurophysiology. , (2011).</li>
<li>Manuel, M., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha%2C+beta+and+gamma+motoneurons%3A+functional+diversity+in+the+motor+system%27s+final+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Integr.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system's final pathway.</a> J. Integr. Neurosci. 10, 243-276 (2011).</li>
<li>Nakanishi, S. T., Whelan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decerebrate+adult+mouse+model+for+examining+the+sensorimotor+control+of+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">A decerebrate adult mouse model for examining the sensorimotor control of locomotion.</a> Journal of Neurophysiology. 107, 500-515 (2012).</li>
<li>Meehan, C. F., Grondahl, L., Nielsen, J. B., Hultborn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fictive+locomotion+in+the+adult+decerebrate+and+spinal+mouse+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fictive locomotion in the adult decerebrate and spinal mouse in vivo.</a> The Journal of Physiology. 590, 289-300 (2012).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

ここで説明する準備が腰椎運動ニューロンの成体マウス、同時細胞内記録とその軸索によって神経支配筋線維による力の測定には、ことができます最初のものである。 なぜなら動物のサイズが小さいため、この準備のために必要な外科的スキルが身に挑戦することができます。これらのスキルを習得されるただし、一度全体の手術は3時間で行うことができ、動物が録音のため外科手術の端の後の7時間以上に用に生き残ることができます。この技術の成功は、麻酔に関する管理上の本質的に左右されます。それは慎重に、できるだけ多くの生理学的パラメーター（コア温度、PCO 2、心拍数等）として監視し、彼らのそれぞれの生理的範囲で維持するために非常に重要である。任意の偏差はhに電力を増加/減少させることにより、例えば、直ちに是正しなければならない呼吸器のパラメータを調整すること、以上の麻酔薬を追加して、毛布を食べる。それは、細心の注意をこれらのパラメータにすべての回で支払われていない場合は、マウスの生理的状態を悪化さのための驚くほど素早いターンを取ることができることを私たちの経験である。 <p class...

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Manuel Marin

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Erratum: Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In Vivo

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>硫酸アトロピン</td><td> Aguettant </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Methylprenidsolone </td><td>ファイザー</td><td>ソリューションメドロール</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>サノフィ·アベンティス</td><td>ペントバルビタール</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>血漿増量剤</td><td>ロジャーBellon </td><td> Plasmagel </td><td></td></tr><tr><td>ブラントはさみ</td><td> FST </td><td> 14079から10 </td><td></td></tr><tr><td>ブラント細かいハサミ</td><td> FST </td><td> 15025から10 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas春はさみ</td><td> FST </td><td> 15002から08 </td><td></td></tr><tr><td>ファイン鉗子鋸歯</td><td> FST </td><td> 11370から32 </td><td></td></tr><tr><td>ファイン鉗子鋸歯</td><td> FST </td><td> 11370から31 </td><td></td></tr><tr><td>カニンガム脊髄アダプター</td><td> Stoelting株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>クイック·キャストシーラント</td><td> WPI </td><td> ＃KWIK-CAST </td><td></td></tr><tr><td>人工呼吸器</td><td> CWE株式会社</td><td> SAR-830​​/AP </td><td></td></tr><tr><td>カプノグラフ</td><td> CWE株式会社</td><td> μcapstar </td><td></td></tr><tr><td>暖房毛布</td><td>ハーバード装置</td><td> 507221F </td><td></td></tr><tr><td>細胞内のアンプ</td><td>軸索InstrumeNTS </td><td> Axoclamp 2B </td><td></td></tr><tr><td>ピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> KClを</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P9333-500G </td><td></td></tr></tbody></table>

腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録<emインビボ&gt;</em

Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo

それは独特の特性（1）は、容易に識別可能ターゲット（筋線維）を有するため、非常によく知られた機能を有するもので、中枢神経系のニューロンであるため、脊髄の運動ニューロンは、長い神経機能を研究するための優れたモデル系であった（筋収縮を制御する）、（2）それゆえ、多くの脊髄と降順ネットワークの収束目標、 &quot;最終的な共通経路&quot;の名であること、（3）それが可能鋭い細胞内電極を用いて、それらを貫通するようになり、大きなソーマを持つ。さらに、in vivoで検討したときに、同時に運動ニューロンとその筋肉のターゲットによって開発された力の電気的活動を記録することができる。したがって、同時に、勉強することができるというユニークな立場に実験者を置くin vivoで運動ニューロンの細胞内録音の実行&quot;を参照してモータユニット&quot;（運動ニューロンに与えられた名前は、その軸索のすべてのコンパートメント、およびそれは1を神経支配筋線維）：運動ニューロンに衝突する入力は、運動ニューロンの電気生理学的特性、及び運動ニューロンの生理的機能のこれらのプロパティの影響は、そのモータユニットで発生する力、 すなわち 。準備が麻痺することはできませんので、細胞内記録のための機械的安定性が低下するので、このアプローチは非常にやりがいがあります。したがって、この種の実験は、ネコやラットでは達成されています。それは、正常および遺伝子改変マウスで同様の実験を行うことが可能であった場合は、脊髄運動系の研究は恐るべき飛躍を作ることができます。 技術的な理由のために、マウスの脊髄ネットワークの研究は主に運動ニューロンと脊髄ネットワークが未熟、運動ニューロンは、そのターゲットから分離され、スライスで研究されているin vitro標本で新生児に限られていた、MOtoneuronsは、それらの入力の大部分から分離されています。最近まで、唯一のいくつかのグループは、私たちは成体マウスの生体内で 5,6を運動ニューロンの非常に安定した録音を取得するために許可された新たな準備を発表し、私たちのチームも含め、 生体内2-4に運動ニューロンの細胞内の録音を実行するために管理していた。しかし、これらの録音は、 すなわちこれらの運動ニューロンの力出力を記録する可能性がなく、麻痺した動物で得られた。ここで我々は運動ニューロンの電気生理学的特性とそれらのモータユニットにより開発力の同時録画を得ることができましたこのオリジナルの準備の延長を提示。それは、私たちは彼らの力のプロファイルに基づいて、運動ニューロンの異なるタイプを識別し、それによって、その機能を明らかにすることができますので、これは重要な成果である。遺伝的モデルは、脊髄分節回路7-9を乱し、又はヒトdiseaをreproductingと相まって10,11 SE、我々 はこの手法は、脊髄運動系の研究のために不可欠なツールであることを期待しています。

図1は、貫通後トライセップス·下腿グループから運動ニューロンを同定する方法を示しています。低刺激強度では、唯一の単シナプスEPSP（ 図1A）を観察することができます。高強度で、EPSPが&quot;順行&quot;スパイク（ 図1B）をトリガするのに十分な大きさかもしれません。さらに高い刺激強度では、全か無かの逆行性スパイクは単シナプスEPSP（ 図1C）よりも短い待ち時間で、表示されます。十分な電流がスパイクをトリガーするために微小電極を介して注入されている場合は、筋活動は筋収縮（ 図1D）に続いて、短い遅延の後に筋肉に記録することができます。運動ニューロンを同定した後、その電気生理学的特性を特徴づけることができる。たとえば、 図2は、入力抵抗が過分極と脱分極電流のパルス（ 図2A）、およびプロットを用いて測定することができる方法を示しています<html>注入された電流の量（ 図2...

この新しい方法は、単一の成体マウスの運動ニューロンとその筋線維による力の測定を同時に細胞内記録を可能にします。正常および遺伝子改変動物における運動単位の電気的および機械的特性の組み合わせ調査は、神経筋システムの研究のための画期的な製品です。

脊髄運動ニューロンは、中枢神経系のニューロンでありながら…（中略）…であるため、神経機能を研究するための優れたモデルシステムとして長年利用されてきました。

本手順の全体的な目的は、生体内で運動ニューロンの細胞内記録を行うことにより、単一のマウス運動単位の電気生理学的および収縮特性を研究することである。まず、脊髄および目的の筋肉を露出させ、次に筋肉の腱に力変換器を取り付けることでこれを達成する。次に、細胞内電極で運動ニューロンを刺激し、記録した運動単位の収縮を誘発させます。これにより、最終的に運動ニューロンの電気生理学的特性を、その運動単位の収縮特性と同時に評価することが可能になります。動物のサイズが非常に小さいため、マイクロサージャリーの手順を習得することは非常に困難であり、この手法を視覚的に示すことは極めて重要です。手順を開始するために、ペントバルビタールナトリウム、またはケタミンとキシラジンの混合液を腹腔内投与してマウスを麻酔します。マウスに足指つまみ反射がないことを確認してください。次に、鈍端剪刀を用いて気管上の皮膚を切開し、皮膚を両側に引っ張って広げます。次に、鈍端鑷子を用いて唾液腺を引き剥がします。気管を覆っている2本の細い筋肉を露出させるため、これら2本の筋肉を分離して気管を露出させます。この際、Dumont No.7鑷子を使用してください。4-0のシルク縫合糸2本を気管の下に通します。次に、2つの軟骨環の間で気管を横方向に切開します。ただし、気管を完全に切断しないように注意してください。次に、気管チューブを気管内に挿入します。挿入部位の両側を縫合糸で結び、固定します。その後、気管チューブをマウス用人工呼吸器とカプノグラフに接続します。次に、コンプライアンスバッグを介して人工呼吸器を純酸素に接続します。マウスが人工呼吸に抵抗せず、呼気終末二酸化炭素分圧が4%から5%の間で安定するように、人工呼吸器のパラメータを調整します。このステップでは、鈍的剥離の手法を用いて、頸部の片側の頸静脈を露出させます。頸静脈は、前顔面静脈と後顔面静脈の2つの主要な幹に分かれています。静脈を周囲の結合組織から慎重に剥離します。次に、6-0のシルク縫合糸2本を静脈の下に滑り込ませ、静脈の長さに沿って可能な限り離して配置します。次に、静脈の近位側に小さな血管クリップを装着し、遠位側を結紮します。極細のアイリス剪刀を用いて、静脈に小さな横切開を加えます。この際、静脈を完全に切断しないよう十分に注意してください。その後、あらかじめ充填された1 Frenchカテーテルを、静脈とカテーテルを一緒に固定している血管クリップまで開口部に挿入します。血管クリップを注意深く取り除きます。次に、カテーテルを静脈内へさらに数ミリメートル押し込みます。挿入箇所の両側を縫合糸で結んでカテーテルを固定します。次に、カテーテルのいずれかをシリンジまたはシリンジポンプに接続し、ペントバルビタールナトリウムやケタミン・キシラジンなどの麻酔剤を追加投与します。別の静脈に対しても同様の手順を繰り返し、もう一方のカテーテルをシリンジポンプに接続して、1%重曹と14%プラズモンを含む4%グルコース溶液を緩徐に静脈内投与します。最後に、頸部の皮膚を縫合糸と針で閉鎖します。その後、マウスを腹臥位に戻します。次に、大腿部上端からアキレス腱にかけて切開します。皮膚を下の筋肉から剥離させ、血管を損傷しないように注意してください。次に、大腿部を縦に走る白い線として現れる大腿二頭筋の前縁を特定します。その後、膝から骨盤まで、その線に沿って慎重に切開します。筋肉を分離し、大腿二頭筋の下にある坐骨神経を露出させます。大腿二頭筋を慎重に剥離して除去します。坐骨神経と三頭筋（腓腹筋）を露出させるため、総腓骨神経と外側皮神経の間にある脛骨神経を確認します。脛骨神経のさまざまな分枝の中から、より深層へ向かう分枝と区別し、三頭筋（腓腹筋）を支配する分枝を特定します。8 OTTのシルク糸を用い、三頭筋への神経枝を温存しながら、脛骨神経のすべての枝をまとめて結紮します。結紮点からできるだけ離れた位置で脛骨神経を切断します。第13胸椎（T 13）と第1腰椎（L one）を特定します。なお、T 13は肋骨が付着している最後の椎骨です。次に、T 13とL 1の両側にCunningham脊髄椎体クランプを使用して、脊柱を固定します。この際、脊髄を圧迫しないように注意し、縦軸方向にわずかに張力をかけます。ピンセットで軽く押し下げ、脊柱がしっかりと固定されていることを確認してください。微細なRジュラース（R jurors）を用いて、T13およびL1上の棘突起と椎弓を除去し、脊髄を露出させます。次に、特製のプラスチック製バスを配置して脊髄を囲みます。その後、4-0シルク糸を用いてバスを固定します。最後に、クイックキャスト密封剤で密封し、バスの防水性を確保します。クイックキャストが乾燥したら、脊髄を覆っている綿を取り除き、バスにミネラルオイルを満たします。別の椎体クランプを使用して、仙骨領域の棘突起を固定します。動物の背部を支持するために、3つ目のクランプを用いて右後肢を固定します。この際、膝関節と足関節をそれぞれ 90°に屈曲させてください。後肢領域を覆っているガーゼを取り除きます。アキレス腱を周囲の組織から剥離します。絹糸の縫合糸（6-0）をアキレス腱に通し、腱の周囲に三重結びを作ります。その後、結び目の近くに力変換器を配置します。その後、絹糸を用いて腱をフォーストランスデューサーに固定し、腱の遠位端を切断します。次に、三頭筋の筋膜下に2本のステンレス鋼線を挿入します。これらの電線は細胞外ACアンプに接続されています。EMG記録を行うには、三趾腓骨神経をフック電極のカソードに配置し、アノードを近接する筋肉に接触させます。次に、最大収縮振幅が観察されるまで、低周波で強度を上げながら50 microsecondの方形パルスを用いて三趾腓骨神経を刺激します。その後、最大収縮振幅が観察されるまで、低周波で強度を上げながら50 microsecondの方形パルスを用いて三趾腓骨神経を刺激します。これらの図は、三頭筋群から運動ニューロンを同定する方法を示しています。低強度の刺激で刺入した後は、より高い強度においてのみ単シナプス性EPSPが観察されます。さらに刺激強度を高めると、EPSPが十分に大きくなり、全か無かの原理に従って正方向のスパイクを誘発する可能性があります。逆行性スパイクは、単シナプス性EPSPよりも短い潜伏期で現れます。マイクロ電極からスパイクを誘発するのに十分な電流を注入すると、短い遅延の後に筋肉でEMG活動が記録され、それに続いて筋収縮が起こります。運動ニューロンを特定した後、その電気生理学的特性を評価することができます。例えば、この図は、過分極および脱分極電流パルスを用い、注入電流量に対する膜電位の変化をプロットすることで、入力抵抗をどのように測定できるかを示しています。また、さまざまな刺激プロトコルを用いて、運動単位の収縮特性を調べることも可能です。例えば、運動ニューロンにさまざまな周波数で短パルスの電流を注入することで、力-周波数関係を得ることができます。その後、定常状態の力を電流パルスの周波数に対してプロットすると、シグモイド状の力-周波数曲線が現れます。手術に習熟すれば、適切に行った場合にこの手法の一部を3時間で完了させることができます。

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学ぶ成体マウスの運動ニューロンと筋線維の同時細胞内記録法。電気生理学的特性と収縮特性を同時に測定し、神経筋系の機能を包括的に解析する技術です。

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