腰椎運動ニューロンおよび成体マウスでそのモーターユニットによる力の同時細胞内記録

この手順の全体的な目的は、in vivoで運動ニューロンの細胞内記録を行うことにより、単一のマウス運動単位の電気生理学的および収縮特性を研究することです。まず、脊髄と目的の筋肉を露出させます。次に、筋肉の腱にフォーストランスデューサーを取り付けます。

次に、細胞内電極で運動ニューロンを刺激し、記録対象のモーターユニットを収縮させます。これにより、最終的に運動ニューロンの電気生理学的特性を、そのモーターユニットの収縮特性と同時に特性評価することが可能になります。動物のサイズが非常に小さいため、微小外科の手順を習得することは極めて困難であり、本手法を視覚的に提示することは非常に重要です。

手順を開始するために、ペントバルビタールナトリウム、またはケタミンとキシラジンの混合液を腹腔内投与してマウスを麻酔させます。マウスに趾（あしゆび）のつまみ反射がないことを確認してください。次に、鈍端鋏を用いて気管の上を切り、皮膚を両側に引き寄せます。

次に、鈍端鑷子で唾液腺を切り離します。気管を覆っている2本の細い筋肉を露出させるため、これら2本の筋肉を分離して気管を露出させます。この際、Dumont 7鑷子を使用してください。

4-0の自動絹縫合糸2本を気管の下に通します。次に、2つの軟骨環の間で気管を横方向に切開します。ただし、気管を完全に切断しないように注意してください。

次に、気管チューブを気管内に挿入します。挿入箇所の両側を縫合糸で結び、固定します。その後、気管チューブをマウス用人工呼吸器とカプノグラフに接続します。

次に、コンプライアンスバッグを介して人工呼吸器を純酸素に接続します。マウスが人工呼吸に抵抗せず、呼気終末二酸化炭素分圧が4〜5%の間で安定するように人工呼吸器のパラメータを調整します。このステップでは、鈍的解剖の手法を用いて、頸部の片側の頸静脈を露出させます。

頸静脈は、前顔面静脈と後顔面静脈という2つの主要な幹に分かれています。静脈を周囲の結合組織から慎重に分離します。次に、6-0オートシルク縫合糸を2本、静脈の下に滑り込ませ、静脈の長さに沿って可能な限り離して配置します。

次に、静脈の近位側に小さな血管クリップを装着し、静脈の遠位側を結紮します。非常に細いアイリス剪刀を用いて、静脈に小さな横切開を加えます。この際、静脈を完全に切断しないよう十分に注意してください。

その後、あらかじめ充填した1 Frenchカテーテルを、静脈とカテーテルを同時に固定している血管クリップがある開口部まで挿入します。慎重に血管クリップを取り除きます。次に、カテーテルを静脈内へさらに数ミリメートル押し込みます。挿入箇所の両側を縫合糸で結び、カテーテルを固定します。

次に、カテーテルの片方をシリンジまたはシリンジポンプに接続し、ペントバルビタールナトリウムやケタミン・キシラジンなどの麻酔薬を追加投与できるようにします。別の静脈に対しても同様の手順を繰り返し、もう一方のカテーテルをシリンジポンプに接続して、1%重曹（炭酸水素ナトリウム）と14%プラズモンを含む4%グルコース溶液を徐々に静脈内投与します。最後に、針と縫合糸を用いて頸部の皮膚を閉鎖します。

その後、マウスを腹臥位に戻します。次に、大腿部の上端からアキレス腱にかけて切開します。皮膚を下の筋肉から剥離させ、血管を損傷しないよう注意してください。

次に、大腿部を縦に走る白い線として現れる大腿二頭筋の前縁を特定します。その後、膝から骨盤まで、その線に沿って慎重に切開します。筋肉を分離し、大腿二頭筋の下にある坐骨神経を露出させます。

大腿二頭筋を慎重に剥離して取り除きます。坐骨神経と三頭腓腹筋を露出させるため、総腓骨神経と外側皮神経の間にある脛骨神経を特定します。脛骨神経のさまざまな分枝の中から、深層へ向かう分枝とは別に、三頭腓腹筋に分布する分枝を特定します。

8本のOTT絹糸を用いて、三頭筋を神経支配する枝は温存したまま、脛骨神経のすべての枝をまとめて結紮します。結節からできるだけ離れた位置で脛骨神経を切断します。肋骨が付着している最後の椎骨であるT 13と、L 1の椎骨を特定します。

次に、T 13とL 1の両側にCunningham脊髄椎骨クランプを用いて脊柱を固定します。この際、脊髄を圧迫しないように注意し、縦軸方向にわずかに張力をかけます。鉗子で軽く押し下げ、脊柱が十分に固定されていることを確認してください。

微細なRジュラース（R jurors）を使用して、脊柱突起およびT13とL1上の椎弓を除去し、脊髄を露出させます。次に、特製のプラスチック製バスを配置して脊髄を囲みます。その後、4-0シルクサスを用いてバスを固定します。

最後に、クイックキャスト密封剤で密閉し、バスの防水性を確保します。クイックキャストが乾燥したら、脊髄を覆っている綿を取り除き、バスにミネラルオイルを満たします。別の椎体クランプを使用して、仙骨領域の棘突起を固定します。

動物の背部を支持するため、3つ目のクランプを使用して、右後肢と足首を膝で90度の角度に屈曲させ、膝と足首の両方が90度に曲がった状態で固定します。後肢領域を覆っているガーゼを取り除きます。アキレス腱を周囲の組織から剥離します。

太い針を用いて、三頭筋を周囲の組織から可能な限り切り離します。6-0シルク縫合糸をアキレス腱に通し、腱の周囲に三重結びを作ります。その後、結び目の近くにフォーストランスデューサーを配置します。

その後、絹糸を用いて腱を力変換器に取り付け、腱の遠位端を切断します。次に、三頭筋筋膜の下に2本のステンレス鋼線を挿入します。これらの電線は細胞外ACアンプに接続されています。

EMG記録を行うため、三頭腓骨神経をフック電極のカソードに配置し、アノードを近接する筋肉に接触させます。次に、最大収縮振幅が観察されるまで、低周波数で強度を上げていきながら、50 microsecondの矩形パルスを用いて三頭腓骨神経を刺激します。その後、最大収縮振幅が観察されるまで、低周波数で強度を上げていきながら、50 microsecondの矩形パルスを用いて三頭腓骨神経を刺激します。

これらの図は、上腕三頭筋群から運動ニューロンを同定する方法を示しています。低強度の刺激で穿刺した後、より高い強度で刺激すると単シナプス性EPSPのみが観察されます。さらに高い刺激強度では、EPSPが十分に大きくなり、全か無かの原則に従って正方向のスパイクが誘発される可能性があります。

逆行性スパイクは、単シナプス性EPSPよりも短い潜伏期で出現します。マイクロ電極を通じてスパイクを誘発するのに十分な電流を注入すると、短時間の遅延の後に筋肉でEMG活性が記録され、続いて筋収縮が起こります。

運動ニューロンを特定した後、その電気生理学的特性を評価することができます。例えば、この図は、過分極および脱分極電流パルスを用いて入力抵抗を測定し、注入電流量に対する膜電位の変化をプロットする方法を示しています。また、さまざまな刺激プロトコルを用いて、運動単位の収縮特性を検討することも可能です。

例えば、運動ニューロンにさまざまな周波数の短時間電流パルスを注入することで、力-周波数関係を得ることができます。その後、定常状態の力を電流パルスの周波数に対してプロットすると、シグモイド型の力-周波数曲線が描かれます。手術手技を習得すれば、適切に行った場合にこの手法の一部を3時間で完了させることが可能です。