同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

この手順の全体的な目的は、正確な定位固定座標で光遺伝学的刺激中のEEGで定義された睡眠と乳酸濃度を測定することです。乳酸センサーと光ファイバーケーブルに必要な脳波リード線とカニューレを外科的に埋め込みます。次に、光ファイバーケーブルと事前に校正された乳酸センサーを動物の頭蓋骨のガイドカニューレに挿入します。

次に、青色光刺激の強度を調整して、目的の電気生理学的応答を実現します。次に、脳波、筋電図、および乳酸濃度データの収集に進みますが、動物は自発的に行動したり眠ったりすることができます。EEGの薬理学的研究などの他の方法と比較して、この実験的アプローチには、ニューロンの活動がサブセカンドの時間スケールでリアルタイムに操作されながら、脳の生化学と電気生理学を監視できるという利点があります。

そのため、睡眠研究分野に新たな知見をもたらす可能性は高いです。例えば、徐波睡眠の代謝的および電気生理学的付随物を特定することができます。このタイプの実験は、学習と記憶、シナプス可塑性、発作障害など、神経科学の他の分野にも適用できます。

手術技術は技術的に困難です。それにはかなりの器用さが必要ですが、それは練習によって達成できます。この視覚的なデモンストレーションでは、書かれた説明を補完するいくつかの複雑な外科的処置の重要な手順を繰り返します。

動物が手術から回復したら、乳酸センサーと光ファイバーケーブルを適切に挿入することが課題となります。ジョナサンと私は、動物を拘束してこれらの2つの繊細な機器を挿入するときに、しっかりとした手の使い方を実演します。最後に、刺激の強度をリアルタイムで調整することにより、EEG応答を最適化する方法を示します。

この実験では、青色光感受性カチオンチャネルを発現するトランスジェニックマウスを使用します。チャネルは大脳皮質ニューロンで2つに採用されます。まず、5%isofフッ素、95%酸素を使用してマウスを麻酔し、3%isofフッ素、97%酸素で麻酔を維持します。

頭蓋骨の上部を目の間から頭蓋骨の後ろまで内側に切開します。過酸化水素と滅菌生理食塩水で頭蓋骨を洗浄します。電極の光遺伝学的刺激構成の定位固定座標を決定するためのBとラムダを見つけてマークします 0.5ミリメートルのボールバービットとそれに続く0.7ミリメートルのボールバービットを備えた高速歯科用ドリルでネジ穴をプライムします。

電極ケログラムネジをマイナスハンドドライバーで穴に挿入します。約4〜5回転で駆動して、目的の深さを取得します。ガイドカニューレを定位固定カニューレで所定の位置に保持し、アクリルセメントで頭蓋骨とアンカーに固定します 開存性を維持するために、各ガイドカニューレには、手術時から実験時までダミーのカニューレまたはスタイレットが含まれている必要があります。

脳波とガイドカニューレを頭蓋骨に配置したら、歯科用アクリルセメントの薄層で接着します。セメントが固まった後、EEGから発せられるワイヤーの端で販売されている乾燥セメントマウンドの上にプラスチックコネクタを配置し、ワイヤーがセメントにつながっている場合に備えて、プラスチックコネクタの接点につながりました。次に、筋電図ワイヤーを21ゲージの針のバレルにスライドさせて、核筋に引き込みます。

筋肉の結び目を貫通し、二重の外科医の結び目、これらのワイヤーの周りの5ゼロナイロン縫合糸、これらのワイヤーのすぐ遠位で、筋肉の縫合糸を出る場所のすぐ遠位に、逆切断P、3本の針、5本のゼロナイロン縫合糸を使用して、単一の中断された外科医の結び目で筋肉組織にアクセスするために引っ込められた皮膚を突き刺します。mc刺激ユニットがプログラムされたら、5ボルトのバイナリオンオフ信号としてスタンドアロン信号発生器として実行します。mc刺激ユニットをBNCコネクタ付きのレーザーのTTL対応パワーユニットに接続します。

レーザーパワーユニットをリボンケーブルでレーザーに接続します。また、レーザーを元の光ファイバーパッチケーブルのオスFCコネクタに接続します。元の光ファイバーケーブルをロータリージョイントに接続します。

整流子 光ファイバーロータリージョイントは、整流子として機能します。動物がケージの周りを移動すると、回転トルクによる光ファイバーケーブルの切断を防ぐために、回転ジョイントが回転します。プラスチック製のケーブルタイで、動物が収容されている円筒形のケージの上に置かれた金属製のスタンドに整流子を固定します。

片手でマウスをカップ状の手のひらの下に固定して、マウスを拘束します。実験者の中指と人差し指の間に頭を向けます。次に、ガイドカニューレの破片、滅菌済みの25ゲージ針を使用して破片を取り除きます。

次に、光ファイバーケーブルを手で挿入し、ネジ付きスクリューキャップで光ファイバーガイドカニューレに固定します。脳内の光ファイバーケーブルの挿入深さは、平らな劈開端から一定の距離で光ファイバーケーブルに結ばれた縫合糸によって制御されます。センサーは、リン酸緩衝生理食塩水でeと同等視され、3つの濃度のL乳酸に段階的にさらされます。

メーカーのプロトコルに従って、光ファイバーケーブルの挿入手順と同じ方法で、事前に校正されたセンサーを頭蓋骨に取り付けられた乳酸ガイドカニューレに挿入します。乳酸センサーをバイポーラプラグコネクタ付きのピナクル8、400バイオセンサーのプリアンプに接続します。次に、このプリアンプを外科的に埋め込まれたヘッドマウントの8ピンコネクタに取り付けます。

データを収集する前に、レーザー強度制御ノブを使用して、光遺伝学的刺激の強度を調整します。EEG応答の振幅は、体系的に研究されていない要因により、動物によって異なります。したがって、光遺伝学的刺激の強度を調整し、 EEG応答が適切である 目的の応答が達成されたとき。

Pinnacle 8, 400 システムを使用して、ニューロスコアでデータを収集します。SEIAインターフェースは、EEGおよびEMGデータプロセスの目視検査により、睡眠状態を分類します。10秒間のデータは、脳波とEMGに基づく覚醒非急速眼球運動、睡眠、または急速眼球運動睡眠として

このバイオセンサー光遺伝学的刺激構成は、外科的に埋め込まれた脳波電極、乳酸センサー、および光遺伝学的刺激のためのカニューレを示しています。光遺伝学的刺激がない場合、このマウスは自発的な睡眠を受けました。覚醒状態の遷移は、E-E-G-E-M-Gと脳の乳酸濃度が継続的に監視されている間、覚醒と睡眠の2つのサブタイプです。

急速な眼球運動と非急速眼球運動は、EEG と EMG に基づいて定義されます。興味深いことに、乳酸バイオセンサーの電流は、低振幅EEGの関数として上昇し、高振幅EEGの関数として減少します。EEGの両方のチャネルは、前頭皮質で送達される光遺伝学的刺激に応答します。

このビデオを見れば、マウスを外科的に移植して、脳内の脳波、筋電図、乳酸濃度の光遺伝学的操作と測定を同時に行う方法についてよく理解できるはずです。一度習得すれば、この外科的技術は90分から120分で適切に行うことができます。麻酔の深さの尺度として、動物の呼吸を常に監視することを忘れないでください。

動物が4〜5秒に1回よりも呼吸する頻度が少ない場合は、麻酔が深すぎる可能性があります。動物が2秒に1回以上頻繁に呼吸する場合、麻酔が軽すぎる可能性があります。フッ素のガス麻酔薬を使用するときは、適切な安全対策を講じることを忘れないでください。

光遺伝学的刺激に使用されるレーザーから網膜を保護するために、手術室で十分な換気を確保してください。保護メガネを着用するか、動物を遮光キャビネットに閉じ込めてください。完全に覚醒したマウスに乳酸バイオセンサーと光ファイバーケーブルを埋め込む練習をしたいと思うでしょう。

マウスはこれらの手順に準拠していないため、固定する必要があります。ただし、拘束は動物を傷つけたり呼吸を妨げたりするほど強力ではありません。