Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成
2013年3月5日
多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。
次の実験の全体的な目標は、マルチタイタープレート形式を使用して、ヒト多能性幹細胞またはH PSCをニューロンに分化することです。これは、H PSCの単一細胞懸濁液を回収し、Vボトム96にプレーティングすることによって達成されます。ウェルプレートで胚体またはEBSを一晩で形成します。
次に、EBSを分化媒体を含むU字型の超低付着板に移し、神経外胚葉形成を誘導します。その後、EBSをマトリゲルコーティングされた皿に播種して、ニューロンの伸長を促進します。免疫蛍光法により、8日目頃に典型的なニューロンマーカーの存在を示す結果を得ることができます。
ヒトの有能幹細胞をニューロンに分化するための染色プロトコルは、しばしば複雑で面倒です。ちょっと偶然です。私たちは、ヒトの有能幹細胞からニューロンを作るための非常に簡単な手順に出くわしました。
技術的な観点から見ると、既存の方法のこの手法の主な利点は、実行が簡単で、迅速で、コスト効率が高いことです。同時に、研究室のMI Z博士が手順を発表します。EB形成培地と分化培地を、書面によるプロトコルに概説されているように調製します。
マトリゲルコーティングされたプレート上のメスコンディショニング培地などのフィーダーフリー条件下で、またはサブコンフルエントの活発な増殖条件下で化学的に定義された培養システムを使用して、h PSCを成長させます。滅菌プラスチックピペットチップ付きの実体顕微鏡を使用すると、自発的に分化したコロニーを機械的に除去します。残りの未分化コロニーをPBSで洗浄し、1 x 岩石阻害剤を含むAccutaneを使用して単一細胞に消化します。
単一細胞を200 Gで2分間遠心分離してペレット化し、Resusを少量のEB形成培地に懸濁します。ヘモサイトメーターを使用して、細胞の力価を測定します。残りのEB形成培地に追加の細胞を添加して、ミリリットルあたり40, 000から80, 000細胞の力価に到達します。
マルチチャンネルピペットを使用すると、ウェルあたり100マイクロリットルを96Vの底板に移し、4、000〜8、000個の細胞が得られます。まぁ。400 Gのスイングアッププレート遠心分離機でプレートを1分間回転させ、ウェルの底にあるすべての細胞を回収します。細胞をインキュベーターに移し、翌日実体顕微鏡下でEBSを一晩形成します。
EBSを採取し、2ミリリットルの分化を含む3.5cmの細菌皿に少量で移します。中程度。皿を静かに回転させて細胞を洗います。100マイクロリットルの分化培地を超低アタッチメントの各ウェルに加えます。
実体顕微鏡下のボトム96ウェルプレート。EBSを少量の洗濯皿から96Uウェルに移します。EBSを4日間インキュベートして、4日目に神経外胚葉が形成されます。
細胞を分化培地で洗浄し、12ウェルプレートなどのマトリゲルコーティングマルチ力価プレートのウェルに1つずつ播種します。細胞は、ニューロンの乱れのない成長を可能にするために、ウェル内に均等に分布する必要があります。EBSを室温で約10分間マトリゲルに緩く付着させます。
それからプレートを慎重にインキュベーターに移します。ニューロンは、次の4日以内に播種されたEBSから放射状に成長します。以前、他の多くのものと同様に、H PSCからのEBSは、H HPCを低アタッチメントディッシュに定期的に分割する際に、骨材を再めっきするだけで生成できることを示しました。
これにより、通常、セルサイズが広く分布します。別の問題は、懸濁液で維持されたEBSは互いに凝集する傾向があり、この単一のH PSCを回避するためのさらに高いサイズの不均一性につながることです。しかし、細胞生存分子であるY 2 7 6 3 2をポリビニルアルコールと組み合わせることで、HSCからのEB形成を促進することが示されています。これにより、シングルセルHESC懸濁液からEBSを一晩で形成することができました。
便利なことに、このマルチタイタープレートフォーマットのEBサイズは、ウェルごとに異なる数の細胞を着座させることで厳密に制御できます。従来の手法とは対照的に、EBSを超低付着96Uプレートに転写した後、F-G-F-E-R-K-T-G、TGFベータSMA two、BP SMA one阻害剤からなる低分子カクテルを用いて神経外胚葉形成を誘導し、マトリゲル上に細胞をプレーティングしてニューロンを生じさせました。約8, 000個の細胞からEB形成を開始すると、最高のニューロン分化能力が得られ、これはメッキされたEBからの顕著なニューロンの成長によって特徴
付けられます。プレーティング後の壊死性EBセンターの減少と、B、rrn、3、A、β、3チューブリンなどの感覚および汎ニューロンマーカーの高発現。全体的なニューロンの分化効率は、元の手順と同等であるように思われ、これはこれまでのところHSCとHI PSCの両方に適用できます。3つの独立したHPSC株、HES細胞、およびHIPS細胞は、マルチウェル手順で成功裏に試験されていますが、細胞株に依存する変動性と分化効率は一般的に除外できません。
この図は、単一細胞としてプレーティングされ、約60%の効率で正常に分化した解離した1日4つの神経外胚葉細胞を示しています マルチティッタープラットフォームでEBSを処理するには、最初は少しトレーニングが必要ですが、しばらくすると、非常に簡単であることがわかります。
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概要
この記事では、多孔プレート形式を用いて、ヒト多能性幹細胞（hPSC）をニューロンに分化するプロトコルを紹介します。この方法は、分化を制御しながら、プロセスを簡素化し、迅速かつ効率的にします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- 細胞分化
背景
- ヒト多能性幹細胞（hPSC）は様々な細胞タイプに分化できます。
- 従来の分化プロトコルは複雑で時間がかかることがよくあります。
- ニューロンの効率的な生成は神経科学研究にとって重要です。
- 多孔プレート形式を使用することで、プロセスを効率化できます。
研究の目的
- hPSCのニューロン分化の簡素化されたプロトコルを開発すること。
- 制御された方法で迅速にニューロンを生成すること。
- 研究目的のためのニューロン培養へのアクセスを容易にすること。
使用した方法
- V底96ウェルプレートへのhPSCの収穫とプレートへの播種。
- 一晩かけて胚様体の（EB）形成。
- 分化培地を用いてEBをU字型の超低付着プレートに移す。
- ニューロンの伸展を促進するためにマトリジェルコーティングされた皿にEBをプレートする。
主な結果
- 8日目頃に典型的なニューロンマーカーの存在が観察されました。
- 免疫蛍光によりニューロン分化が確認されました。
- プロトコルを使用することでニューロンの効率的な生成が達成されました。
- この方法は研究における高スループット応用を可能にします。
結論
- 適応されたプロトコルは、hPSCからニューロンを生成する迅速かつ効率的な方法を提供します。
- 多孔プレート形式の利用により分化プロセスが簡素化されます。
- この方法は神経科学における研究能力を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables rapid, scalable generation of functional neurons from human pluripotent stem cells in a multi-titre plate format, addressing the need for efficient, reproducible neuronal models in early-stage drug discovery. By eliminating multi-step precursor expansion and using a chemically defined, small-molecule-based approach, it reduces technical complexity and supports mid-throughput screening applications. The method provides a de-risked source of human sensory-like neurons for target validation and phenotypic screening campaigns.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of neuroectoderm induction and neuronal differentiation pathways using defined small-molecule inhibition of TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK signaling.
- Operational Value: Supports rapid hypothesis testing in a 96-well format, reducing time from pluripotent stem cells to functional neurons to eight days.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces neurons expressing pan-neuronal (beta-III tubulin) and sensory (Brn3a) markers, suitable for screening compounds affecting neuronal maturation or function.
- Operational Value: Compatible with multi-titre plate formats, allowing standardized seeding, differentiation, and readout in V-bottom and ultra-low attachment plates for assay reproducibility.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrated across three independent hPSC lines (HES and hiPSCs), supporting cross-line consistency for disease-relevant modeling.
- Operational Value: Enables scalable production of neurons for downstream functional assays, including electrophysiology or high-content imaging, without requiring specialized differentiation expertise.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting target validation through rapid neuronal differentiation and enabling lead identification via compound screening in a format compatible with automated liquid handling and imaging platforms.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic de-risking by providing a defined system to study neuroectoderm formation and neuronal outgrowth from pluripotent stem cells.
- Screening: Yields adherent neurons from embryoid bodies plated on matrigel, allowing standardized compound exposure and phenotypic readout in multi-well formats.
- Analytics: Enables quantitative assessment via immunofluorescence for neuronal markers (e.g., beta-III tubulin, Brn3a) at day eight, supporting dose-response and hit confirmation.
- Translational Research: Uses human pluripotent stem cells to generate neurons with sensory neuron characteristics, offering translational relevance for peripheral nervous system targets.
- Enterprise Reuse: The multi-titre plate format supports assay standardization across teams and sites, reducing variability in neuronal differentiation for repeated screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in neuronal differentiation efficiency (~60% in optimized conditions) and marker expression reduces ambiguity in target engagement studies.
- Operational Value: Simple, chemically defined medium with small-molecule inhibitors eliminates need for complex growth factor changes or feeder layers.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions in target validation by providing rapid access to functional human neurons.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of neuroscience targets through reproducible, scalable neuronal model generation.
Implementation Considerations
- Requires basic cell culture training for embryoid body handling and multi-titre plate transfers.
- Depends on access to V-bottom 96-well, U-shaped ultra-low attachment, and matrigel-coated plates for embryoid body formation and neuronal outgrowth.
- Necessitates standardization of small-molecule inhibitor concentrations (TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF/ERK) across batches for consistent neuroectoderm induction.
- Adaptation to other neuronal subtypes may require protocol optimization beyond the sensory neuron-biased output observed.
- Limited to adherent differentiation outcomes; not suited for suspension-based or 3D organoid applications without modification.
