血管疾患の研究のためのマウスにおける同所性大動脈移植

本手順の目的は、ドナーマウスの腹部大動脈を同種Recipientマウスに移植することです。まず、ドナーの大動脈を採取し、次に、レシピエント動物にグラフト部位を構築することでこれを達成します。

次に、レシピエント動物の自前の大動脈を剥離し、切断します。最終ステップとして、2か所の端端吻合（end-to-end anastomosis）を用いてドナーの大動脈を移植します。最終的に、この手法は同系以外の系統の組み合わせにおける移植後血管疾患の発症を研究するために利用可能です。

この手法が、例えば異所性心移植と比較して優れている点は、血管のサイズが均一であるため、形態計測学的解析がより容易なことです。さらに、血管が実質組織に囲まれていないため、細胞浸潤などの解析データを複雑にする要因に影響されません。この技術を用いることは、ヒトの臨床移植において難治性の問題となっている移植後血管疾患に関与するメカニズムを解明する上で、特に有用です。

ストレスの影響を最小限に抑え、エネルギー蓄えを最大限にするため、手術の少なくとも72時間前には動物を飼育室に留めておきます。手術当日、35から38 °Cに設定したヒートパッドの上に金属製の手術台を設置します。その後、麻酔をかけ、動物の腹側腹部の被毛を除去します。

ラボ用テープを使用して、動物を処置台の上に四肢を広げた状態で固定します。次に、滅菌鋏を用いて、動物の除毛領域全体を消毒剤とエタノールで3回ずつ洗浄し、殺菌します。続いて、腹壁を切開して腹部内臓を露出させます。その後、滅菌綿棒を用いて内臓を温 saline で濡らした滅菌ガーゼの上に脇へ寄せ、腹部の大血管を露出させます。

次に、細心の注意を払って鈍的に剥離し、下大静脈を含む周囲組織から腹部大動脈を分離し、腰動脈を慎重に挙上して焼灼します。解剖に用いる大動脈の部位は、腎血管の下側かつ、大腿動脈へ分岐する部位の上側である必要があります。この領域を確認後、腎動脈のすぐ下に1か所、また分岐部のすぐ上にさらにもう1か所、結紮を行います。

次に、ハサミで大動脈を切断し、血管の一端を非常に慎重に保持して、ヘパリン生理食塩水を滴下し、重力によって血管内を流れるようにします。その後、血管の両端に触れる回数を最小限に抑えながら、グラフトを取り出し、直ちに氷冷生理食塩水の容器に入れます。

レシピエント動物に麻酔および鎮痛処置を施した後、示した通りに腹側腹部を剃毛します。眼球の乾燥を防ぐため、眼にゲンタマイシン点眼軟膏を塗布し、次にデモンストレーションした通りに腹部を消毒して、十分な除菌を行います。続いて、皮膚と体壁に沿って正中切開を段階的に行います。

次に、開創器を挿入して腹部の切開口を開いたままに保持します。この際、クランプが邪魔にならないよう、ネジアセンブリを動物の後端に向けて配置してください。続いて、腸の上に生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼを置きます。その後、指でガーゼを軽く押さえて固定します。

滅菌綿棒を腸管の下に挿入し、腸管がガーゼの上に載るようにそっと持ち上げます。さらに別の滅菌ガーゼを腸管の上に置き、生理食塩水で湿らせます。腹大動脈（ATA）と下大静脈を覆っている脂肪組織を慎重に取り除いた後、ピンセットを用いて腎下大動脈を下大静脈から丁寧に剥離します。

次に、2つのクランプを配置するのに十分な広さを確保し、さらに分割した際にグラフトを縫合できる十分な長さの血管が残るように領域をクリアにします。黒色の縫合糸を用いて、血管に沿って重量感を確認できることに注意してください。剥離を行う際は血管の分枝に注意し、必要に応じて低温電気凝固器で分枝を焼灼してください。

次に、腎動脈の直下に1つの血管鉗子を、また分叉部の直上に別の血管鉗子を挿入します。その後、大動脈を切断します。この例では、2つの鉗子のほぼ中間にある分枝血管を焼灼したため、そこが吻合に不適切な部位となり、分叉部により近い位置で切断しています。通常、大動脈の両端は後退し、約5 mmの間隔が生じます。

止血状態を確認します。クランプが適切に機能していれば、切断後に漏れ出す血液は少量であるはずです。次に、大動脈の切断端をヘパリン生理食塩水で洗浄し、余分な溶液をスワブで拭き取ります。

次に、両端に3か所ずつ不連続縫合を行い、グラフトを仮止めします。続いて、両端の吻合部の一側を縫合し、残りの部分を7〜8本の不連続縫合で埋めます。連続縫合を行う場合は、血管壁が弛緩したままであること、および吻合部で狭窄が起きないように注意してください。

次に、大動脈の頭側にあるクランプを慎重に外し、縫合線に漏れがないか確認します。続いて、濡らした綿棒で吻合部の上の大動脈を軽く押さえながら、2番目のクランプを取り除きます。大動脈を数回軽く圧迫しては離し、血管が開通しているかを確認してください。これによりグラフトにすぐに血流が流れ、拍動が確認できるはずです。

次に、腸を覆っているガーゼを取り除き、ねじれが生じないように注意しながら、腸を本来の解剖学的方向に従って元の位置に戻します。5-0のVicryl縫合糸を用いて筋層を閉鎖し、続いて5-0または6-0のproline縫合糸で皮膚を閉鎖します。麻酔を終了させる前に、鎮痛効果を高めるためカルプロフェンをマウスに皮下投与し、その後、同様の経路で0.5から0.8 mLの生理食塩水を投与します。

最後に、マウスを保温ケージに入れて回復させ、動物の状態を注意深く観察します。手術から12時間後および24時間後に、それぞれブプレノルフィンとカルプロフェンを皮下投与します。この最初の図は、大動脈グラフトを示しています。

ここにある白色の矢印で示された縫合線に注目してください。レシピエントの生存を56日間追跡した典型的な実験が描かれています。コントロール群は、bowel C 大動脈を移植した野生型 C 57 BL six by FVB レシピエントマウスで構成されました。

実験群は、ヘムオキシゲナーゼ-1の発現が欠損したC57BL/6 × FVBレシピエントで構成された。このノックアウトにより、24時間以内にグラフトの血栓症が引き起こされる。特筆すべきは、これによりすべてのレシピエントが死亡したことである。

この最後の図は、正常個体および移植レシピエントにおける下大静脈、中空、および腹部大動脈のエコー測定値を示しています。移植片は開通しており、非移植個体の大動脈と同様の外観であることに注目してください。これまで見てきたように、組織は非常に繊細で小さいため、この手技は確実に習得が必要なスキルであることを念頭に置く必要があります。したがって、一度習得した後に、この手技をルーチンとして成功させるまでには、かなりの練習が必要です。

この手法は、適切に行えば1時間以内に完了できます。