Name: 幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学ショウジョウバエ網膜 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: 学ぶショウジョウバエ網膜の解剖と免疫組織化学法。幼虫、蛹、成虫の3段階で網膜を摘出し、タンパク質発現を可視化して光受容細胞の分化を単細胞レベルで解析する手法です。

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この作品はHYにEhrmanの交わりによってサポートされていました。 H.、DV、JRにニューヨーク大学ディーンの論文をCDにDJのフェローシップは、NIH GrantR01 EY13010とDFG交わりRJJ、NIHグラントF32EY016309に医学研究ポスドクのためのジェーン棺チャイルズメモリアル基金（RI 2208/1- 1）。我々は、原稿上のコメントのためのニーナ·フォークトとパメラBoodramに感謝します。

1。はじめに三齢幼虫、midpupalと成虫：このビデオでは、3つの定義済みの発達期間における網膜の解剖および免疫組織化学のための方法を説明します。我々のプロトコルは、他の蛹の段階のために動作しますが（それ以前の段階の詳細については、16を参照）は、1つの焦点面とその核にイメージングのためのすべてのPRに最適であるように、我々は、midpupal舞台を選んだの可視化を容易にする、簡単に識別できます転写因子の発現パターン。後半蛹網膜の郭清は成人網膜の解剖と非常によく似ています。 まず、希望の段階での幼虫や蛹を収集する方法を示しています。そこで、幼虫17-18、midpupalと成人網膜の最適解剖を入手する方法について説明します。第二に、我々は、免疫組織化学および共焦点顕微鏡を使用して、これらの段階でPRの開発を可視化する方法を示します。 昆虫の発育期間は、温度に依存しています。幼虫と蛹の再現ステージングを容易にするために、私たちは12 hr/12時間の明/暗サイクル下で25℃ですべてのフライ株式℃に上げることをお勧めします。 3齢幼虫：産卵後約96時間（25℃）、後期3齢幼虫停止送り、彼らは最終的には蛹になる食品バイアルの壁にさまよう。優しく食品用容器の壁から徘徊3齢幼虫を除去するために柔らかいブラシや鉗子を使用しています。 50％の蛹（ &#39;midpupae&#39;）は蛹化後48時間程度観測されている。正確なタイミングでは、食品バイアル上のマーカーにだけ形成された白い蛹を一周することができます。あるいは、均一なステージングのバイアル（形態学的基準を使用して蛹のステージング用に、19を参照）を得るために新しいバイアルにすべての白い蛹を移動します。 48時間後、慎重にレムピンセットを用いてバイアルからmidpupaeのオベ。 アダルトハエ：CO 2のパッドの上に麻酔の若い大人のハエ（2-5日羽化後）。鉗子を使用してヘッドを取り外し、寒い1X PBSを含むガラスウェルディッシュに保管してください。 3。解剖手順（実験1〜2時間程度） 標本を収集した後、シルガード郭清を皿に冷PBSの一滴の中に置いてください。遺伝子型10-15網膜について解剖する。 試薬や機器の適切な取り扱いのために化学物質等安全データシートだけでなく、金融機関の環境衛生および安全管理室（このプロトコールの最後にある表を参照してください）​​ご相談ください。 1。幼虫アイ成虫<ol><li>口のフックが含まれている幼虫の前端の位置を確認します。シルガード皿の底そっと幼虫の中央部を押すように鉗子を使用しています。 anothを使用erが口のフックをつかむと、体内から優しくゆっくりと引き離し鉗子。本体の主要部分を破棄し、脳に接続されたまま成虫から余分な組織を除去するために前部を保持するために口器を使用しています。 </li><li> 3ウェルガラス皿の1X PBSに鉗子で口フックをつかんで成虫と脳を転送します。固定ステップを（ ​​ステップ4.1）を実行します。 </li><li>固定後、唾液腺、脂肪組織を除去し、離れて目を触角の成虫原基から脳を引き出します。 &quot;難しい&quot;抗体のアクセシビリティを向上させるために、上皮の表面に配置されているperipodial膜は、ディスクの触角の部分を押しながら解剖ピンと離れて膜を剥離することにより除去することができる。次に、（ステップ5.1）免疫組織化学を行ってください。 </li></ol> 2。 50％の蛹化/ Midpupal網膜<ol><li>ピンセットで蛹例後端を保持します。そっと別の鉗子でキューティクルをつかんで蛹例前面を取り外し、ゆっくりと蛹殻から引き離します。頭を露出させるために離れて残留キューティクルをはがします。 </li><li>背前歯部では、基礎となる、柔らかい袋を貫通する鉗子 &quot;のヒントを参考にしてください。これは、頭部へのアクセスを提供します。優しくゆっくりP20ピペットで頭を吸引することによって胸部から頭部を分離します。新鮮な冷1X PBSにピペットの先端から頭を追放し、余分な組織を除去し、頭のキューティクルをつかむと口吻を削除します。固定ステップ（ステップ4.1）に進みます。 </li><li>ピアース着実な組織への1解剖ピンと視葉。ラミナとラミナ/視葉から網膜を分離するために網膜の間に他の解剖ピンを挿入します。免疫組織化学を行う（ステップ5.1）を実行します。 </li></ol> 3。大人の目<ol><li>鉗子で後部頭部カプセルの中央をつかむと、口の部分（吻）、脂肪TISSを削除UEと気管。 </li><li> 1鉗子で背頭のキューティクルをつかむと、そっと横に引いて、脳組織から目を分離するために、他を使用しています。ほとんどの場合、ラミナ、脳の神経網の薄くて透明なシースは、網膜に取り付けられたままになります。これは、固定後粘膜を除去する方が簡単です。 </li><li>アイマージンでキューティクルを除去しますが、さまざまなソリューションに網膜の転送を容易にするために後ろに小片にしておきます。 （ステップ4.1）。固定を行う。 </li><li>ピンセットで片側でそれをつかんで、ゆっくりと網膜を損なうことなく、他の鉗子で横に引いて、ラミナを削除します。それは実装時の網膜上に折ることができるように、残留キューティクルを取り除きます。これらの2つの手順がそうでなければ、イメージングプロセス中に、キューティクルのラミナや遺跡で隠されてしまう光受容体を、可視化するために重要である。免疫組織化学（ステップ5.1）に進みます。 </li></ol> 4。固定と和紙NG（約1時間） <ol><li>新たに固定液を（1×PBS、氷の上で渦や店舗を360μlの37％ホルムアルデヒド溶液の希釈40マイクロリットル）の準備中、氷上に置い3ウェルガラス皿に1X PBSで切開した網膜を格納します。我々は、固定プロトコールを続行すると氷（&gt; 15分）で長期保存時間を避けることをお勧めします。 </li><li> 3.7％ホルムアルデヒド溶液200μlの1×PBSを交換してください。組織を固定液に浸漬されていることを確認します。それはそうでなければ適切に修正されない場合がありますので、これは重要です。必要に応じて、ピンセットで気泡や気管を削除します。 </li><li>室温で15分間シェーカーでインキュベートする。 </li><li> 1×PBSで固定液を交換し、1×PBSで二回すすいでください。 30分（シェーカー上、室温）をPBS中で洗浄を続けます。 </li><li> PBSTでPBSを交換してください。 PBSTで二回すすぎ。 </li><li>幼虫の眼ディスク（3.1.3。）とmidpupal /成人の網膜からラミナからperipodial膜の削除を続行&lt;強い&gt;（3.2.3、3.3.4）。 </li></ol> 5。免疫組織化学<ol><li>ブロッキング：室温でシェーカーで20分間インキュベートし、PBST網膜で5％正常血清200μlのPBSを交換してください。 </li><li>一次抗体溶液を用いてブロッキング液を交換してください。パラフィルムを持つ3つのウェルディッシュを密封し、室温でシェーカー上で一晩インキュベートする。 </li><li> PBSTでソリューションを交換して、3回すすいでください。室温でシェーカーで1時間の最小値をPBSTで洗浄を続けます。 </li><li>室温で一晩振とう機にパラフィルム密封されたガラスだけでなく皿の中で二次抗体溶液とインキュベートで転送。 </li><li> PBSTで抗体溶液を交換して、3回すすいでください。室温でシェーカーで1時間の最小値をPBSTで洗浄を続けます。サンプルは数日間PBSTで続けたが、それは乾燥からそれらを防ぐためには、少なくとも1日に1回、新鮮なPBSTを追加することが重要であることができます。 </li></ol> 6。 Mounting <ol><li> 幼虫とmidpupal網膜を取り付けるために 、きれいなスライドガラスの中央に網膜を転送するためにP20を使用しています。過剰PBSTを削除します。イメージングを容易にするために、網膜を揃えるためにピンセットを使用しています。 </li><li>網膜の上にメディアをマウントする10μlを添加する。明確なマニキュア付き24x40-1カバースリップとシールで軽くカバーしています。 </li><li> 成体網膜を装着するための準備、 &#39;ブリッジ&#39; 20：ガラス面の両端に50％グリセロールの25μlの液滴を追加して、22x22のA-1カバースリップ（厚0.13〜0.17ミリメートル）でそれらをカバーしています。 </li><li> P20ピペットでPBSTを取り外し、網膜が乾燥しないように注意してください。ウェルに培地を取り付けるの20μlを添加する。 &quot;ブリッジ&quot;ガラススライドにP20と網膜を転送するために封入剤を使用しています。 </li><li>東洋に鉗子を使用します（レンズはガラススライドを向ける必要があります）とイメージングを容易にするために、網膜の位置を合わせます。必要な場合は、P20と気泡を除去。 </li><li>ゆっくり明確なマニキュアやスコッチテープでトップとシールエッジの片側から場所24x40-1カバースリップ（厚さ0.13〜0.17ミリメートル）。ストアサンプルは4℃顕微鏡スライドセーバーボックスのC（暗所におく）。 </li></ol> 7。代表的な結果このプロトコルのアプリケーションの例として、我々は、ビデオ内の3発生段階において、感光体分化を可視化するための代表的な結果を示しています。幼虫の目触角ディスクとmidpupal網膜は、それらの開発（ 図1A、B）の中に異なる光受容体の種類にラベルを付けたり、成体網膜は、2つの光受容体のサブタイプ（ 図1C）を可視化するために2ロドプシン抗体で染色した抗体で染色した。

<ol><li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).</li>
<li>Hardie, R. C. Functional organization of the fly retina. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHardie%2C+RC+%22Sensory+Physiology%22">Sensory Physiology</a>. D, O. ttoson 5, Springer-Verlag. 1-79 (1985).</li>
<li>O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ninaE+gene+encodes+an+opsin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ninaE gene encodes an opsin.</a> Cell. 40, 839-850 (1985).</li>
<li>Zuker, C. S., Cowman, A. F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+structure+of+a+rhodopsin+gene+from+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation and structure of a rhodopsin gene from D. melanogaster.</a> Cell. 40, 851-858 (1985).</li>
<li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev. Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Drosophila+opsin+reveals+specific+patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Drosophila opsin reveals specific patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells.</a> Neuron. 17, 1101-1115 (1996).</li>
<li>Chou, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterning+of+the+R7+and+R8+photoreceptor+cells+of+Drosophila%3A+evidence+for+induced+and+default+cell-fate+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Patterning of the R7 and R8 photoreceptor cells of Drosophila: evidence for induced and default cell-fate specification.</a> Development. 126, 607-616 (1999).</li>
<li>Papatsenko, D., Sheng, G., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rhodopsin+in+R8+photoreceptors+of+Drosophila%3A+evidence+for+coordinate+expression+with+Rh3+in+R7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new rhodopsin in R8 photoreceptors of Drosophila: evidence for coordinate expression with Rh3 in R7 cells.</a> Development. 124, 1665-1673 (1997).</li>
<li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+pattern+formation+in+the+Drosophila+compound+eye%3A+the+morphogenetic+furrow+and+the+second+mitotic+wave%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave.</a> Development. 113, 841-850 (1991).</li>
<li>Roignant, J. Y., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+in+the+Drosophila+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern formation in the Drosophila eye disc.</a> Int. J. Dev. Biol. 53, 795-804 (2009).</li>
<li>Tsachaki, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+developmental+mechanisms+underlying+the+formation+of+the+Drosophila+compound+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Genetic and developmental mechanisms underlying the formation of the Drosophila compound eye.</a> Dev. Dyn. 241, 40-56 (2012).</li>
<li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+differentiation+in+Drosophila+ommatidium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal differentiation in Drosophila ommatidium.</a> Dev. Biol. 120, 366-376 (1987).</li>
<li>Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+analysis+of+Drosophila+eye+development%3A+sevenless%2C+bride+of+sevenless+and+rough%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic analysis of Drosophila eye development: sevenless, bride of sevenless and rough.</a> Trends Neurosci. 12, 183-189 (1989).</li>
<li>Basler, K., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cell+fate+in+the+developing+eye+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Specification of cell fate in the developing eye of Drosophila.</a> Bioessays. 13, 621-631 (1991).</li>
<li>Charlton-Perkins, M., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+fly+eye%3A+terminal+differentiation+events+of+the+retina%2C+corneal+lens%2C+and+pigmented+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Building a fly eye: terminal differentiation events of the retina, corneal lens, and pigmented epithelia.</a> Curr. Top Dev. Biol. 93, 129-173 (2010).</li>
<li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat. Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li>
<li>Wolff, T. Histological Techniques for the Drosophila Eye Part I: Larva and Pupa. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWolff%2C+T+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W. ea , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).</li>
<li>Wolff, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+techniques+for+pupal+and+larval+Drosophila+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection techniques for pupal and larval Drosophila eyes.</a> CSH Protoc. 2007, pdb prot4715(2007).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Embryol.+Exp.+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Morante, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+optic+lobes+at+different+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila optic lobes at different stages of development.</a> Cold Spring Harb Protoc. , 652-656 (2011).</li>
<li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+Developing+and+Adult+Drosophila+Brains+and+Retinae+for+Live+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (37), e1936(2010).</li>
<li>Stowers, R. S., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+method+for+generating+Drosophila+eyes+composed+exclusively+of+mitotic+clones+of+a+single+genotype%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic method for generating Drosophila eyes composed exclusively of mitotic clones of a single genotype.</a> Genetics. 152, 1631-1639 (1999).</li>
<li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li>
<li>Sood, P., Johnston, R. J., Kussell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+De-repression+of+Rhodopsins+in+Single+Photoreceptors+of+the+Fly+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic De-repression of Rhodopsins in Single Photoreceptors of the Fly Retina.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002357(2012).</li>
<li>Johnston, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlocked+feedforward+loops+control+cell-type-specific+Rhodopsin+expression+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interlocked feedforward loops control cell-type-specific Rhodopsin expression in the Drosophila eye.</a> Cell. 145, 956-968 (2011).</li>
<li>Jukam, D., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binary+regulation+of+Hippo+pathway+by+Merlin%2FNF2%2C+Kibra%2C+Lgl%2C+and+Melted+specifies+and+maintains+postmitotic+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Binary regulation of Hippo pathway by Merlin/NF2, Kibra, Lgl, and Melted specifies and maintains postmitotic neuronal fate.</a> Dev. Cell. 21, 874-887 (2011).</li>
<li>Vasiliauskas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+from+rhodopsin+controls+rhodopsin+exclusion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feedback from rhodopsin controls rhodopsin exclusion in Drosophila photoreceptors.</a> Nature. 479, 108-112 (2011).</li>
<li>Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+an+ommatidium+one+cell+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Building an ommatidium one cell at a time.</a> Dev. Dyn. 241, 136-149 (2012).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

1。トラブルシューティング我々の経験では、解剖の練習（最大〜数週間）が必要で、テーブルの上に、解剖皿に接触して指で肘や前腕を置くことによって快適な手の位置21を達成することによって促進される。そのように、唯一の親指、人差し指と中指が微妙な動きを実行します。 感光体を傷つけることなく薄層を除去することは、おそらく最も困難なステップです。ラミナ赤目色素沈着に対して参照する方がはるかに簡単であるように赤い目をした野生型との練習は、白い目をした変異体を解剖する前に、まず飛ぶ。また、最適なコントラストを実現するために解剖皿の下に背後と暗い背景から照明を使用しています。 しかし、赤目顔料は蛍光性であり、イメージングプロセスの間に高いバックグラウンドを引き起こす可能性があります。これは、二次抗体からの信号を弱めることができる。良い戦略はKEにあるepは四から五日間成人網膜を洗浄し、少なくとも1日1回、新鮮なPBSTで洗浄溶液を交換する。顔料が洗い...

<table border="1"><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td> （PBS1x、pH7.4）をリン酸緩衝生理食塩水</td><td>シグマ</td><td></td><td> 10倍原液20を準備します。室温で1×PBSでストアを取得するために蒸留水で希釈します。解剖の前に氷の上で冷やす。 </td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマ</td><td> 9002-93-1 </td><td> 注意：刺激性の手袋を着用してください。 0.3パーセントのTriton X-100（PBST）で50ml 1xPBSを準備します。室温で保管してください。 </td></tr><tr><td> 37％ホルムアルデヒド溶液</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> F75P1GAL </td><td> 注意：有毒、推定ヒト発がん性物質は、手袋を着用してください。固定ステップの前に、新たにPBSで希釈することにより化学ヒュームフードの3.7％溶液を調製し、氷上店。 </td></tr><tr><td> 5％正常ウマ血清</td><td>ジャクソンイムノリサーチ</td><td> 008-000-001 </td><td> PBSTで5％（v / v）の希釈液を調製します。 4℃で保管してください。 </td></tr><tr><td>一次抗体および二次抗体（ 例えばロバ抗ヒツジのAlexa Fluor 488、ロバ抗ウサギのAlexa Fluor 555、ロバ抗マウスのAlexa Fluor 647） </td><td> Invitrogenのモレキュラープローブ</td><td> A11015 A31572 A31571 </td><td> 4度でPBST及び​​店舗で1:800二次抗体を希釈します。 </td></tr><tr><td>のAlexa Fluor 488ファロイジン</td><td></td><td> A12379 </td><td>二次抗体溶液で1:100に希釈します。 </td></tr><tr><td> Slowfadeゴールド褪色防止試薬</td><td> Invitrogenのモレキュラープローブ</td><td> S36936 </td><td>メディアのマウント。 -20℃で保存してください。 </td></tr><tr><td> GlyceROL </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> G31-1 </td><td>取付用。室温で蒸留水、店舗で50％希釈液10mlを準備します。 </td></tr><tr><td> CO 2 </td><td></td><td></td><td>ハエの成虫を麻酔するため。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td> 2つの鋭い鉗子（デュモン＃55） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11255から20 </td><td></td></tr><tr><td>シルガード184シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウコーニング</td><td></td><td>シルガード混合物でプラスチックシャーレを充填することにより、シルガード郭清皿を準備します。 </td></tr><tr><td>スリーウェルガラス解剖皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 21から379 </td><td></td></tr><tr><td> TWO minutien解剖ピン（0.1ミリメートル径）と2 pinholders（12 cm）の</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 26002から10 </td><td> 2 pinholdersのそれぞれに1 minutienピンを挿入し、フックを形成するために、ピンの1つを曲げる。 </td></tr><tr><td>顕微鏡カバースリップ（22x22の24x40-1とA-1） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-542A </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド（25x75x1.0ミリメートル;予備洗浄） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-550-143 </td><td></td></tr><tr><td> 1.5 mlのマイクロチューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マニキュアやセロテープをクリア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>ベルコ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スライドホルダーボックス</tD&gt; <td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>ビーミス</td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td>細い絵筆</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> P20とP200のピペットとヒント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氷と一緒に小さなバケツ</td><td></td><td></td><td>ガラスウェルプレート、解剖網膜やソリューションを冷却する。 </td></tr></table>

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜

Dissection and Immunohistochemistry of Larval, Pupal and Adult Drosophila Retinas

キイロショウジョウバエの複眼は約750 ommatidiumの複数形（ユニット目）から構成されています。それぞれの個眼は、レンズを分泌する錐体細胞、色素細胞、毛細胞と8つの光受容体（PRS）R1〜R8 2を含む約20の細胞で構成されています。 PRSは、特殊な微絨毛構造​​、光に敏感な顔料を含有rhabdomeres、ロドプシンを（RHS）があります。 6 PRのrhabdomeres（R1〜R6）は、台形を形成し、体Rh1 3 4が含まれています。 R7とR8のrhabdomeresは台形の中心にタンデムに配置され、光の同じパスを共有しています。 R7とR8 PRSは確率的に2メインサブタイプ5のRHSのさまざまな組み合わせを表現： &#39;p&#39;のサブタイプでは、p R7sでRH3 は p R8sでRH5と結合されて、 &#39;y&#39;のサブタイプには、y R7sでRH4が関連付けられているのに対し、 yの R8sでRH6 6 7 8。 PRSとommatidiumの複数形の開発の初期仕様では幼虫の目触角成虫原基は、上皮細胞の単層で始まる。差別化の波は、ディスク9に掃引とommatidiumの複数形10月11日に未分化細胞のアセンブリを開始します。 &#39;創始細胞&#39; R8はR7を12月14日 、第1及び新入社員、R1-6と指定されています。その後、蛹の開発中に、PRの分化は感桿分体形成、シナプス形成し、最終的にrhの発現を含む広範な形態学的変化15につながる。 このプロトコルでは、網膜の形成や発達経路に関するさまざまな問題に取り組むために適用することができる網膜の開発の3つの定義された期間、網膜における解剖および免疫組織化学のための方法を説明します。ここで、我々は全体のマウント幼虫、midpupalと成人網膜の単一細胞レベルで段階的なPRの分化を視覚化するために、これらのメソッドを使用します（ <sチョン·&gt;図1）。

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;網膜は、紋切り型の方法で生成された細胞の種類の数が少ないからなる結晶状格子です<sup&gt; 1</sup&gt;。洗練された遺伝解析への従順は、複雑な発達プログラムの研究を可能にします。このプロトコルは、感光体の分化を中心に、3つの個別の発達段階で解剖し、網膜の免疫組織化学を説明しています。

キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）の複眼は約750個の個眼（単位眼）で構成されている。各個眼は約20個の細胞で構成されており、それには…が含まれる。

本手順の全体的な目的は、ショウジョウバエの網膜を最適に摘出すること、および発達中の網膜で発現しているタンパク質を可視化することです。まず、幼虫期、瞳孔期、成虫期の3つの発達段階における網膜の摘出法を実演します。続く工程は、固定および免疫組織化学的染色です。最終ステップでは、共焦点顕微鏡で可視化するために網膜をスライドガラスに封入します。最終的に、このプロトコールにより、単一細胞レベルでの網膜細胞の発達と分化を明らかにすることができます。歴史的に、ショウジョウバエの網膜は、発生生物学における幅広い疑問に対処し、その根底にある遺伝子調節メカニズムを研究するための理想的なシステムとなってきました。ここでは、多能性段階から最終分化状態に至るまでの発達中の網膜細胞を可視化する手法を解説します。まず、網膜の摘出方法について説明します。光受容体の核がほぼ同一焦点面上に位置するため、今回は中瞳孔期の網膜を用いて摘出を実演します。この段階は、転写因子などの核局在タンパク質の発現を比較するのに最適です。本日は、成虫のショウジョウバエの網膜を解剖する方法を解説します。発生段階の再現性のあるステージングを容易にするため、ショウジョウバエを25°Cの一定温度、および12時間明期・12時間暗期のサイクル条件下で飼育してください。これらの条件下では、3齢幼虫が餌から離れる時期を調整することで、約96時間後に3齢後期幼虫を得ることができます。これらはソフトブラシまたはピンセットで取り除くことができます。幼虫を回収した後、Sylgard製解剖皿上の冷PBSの一滴に置きます。実験群あたり約10〜15個の網膜を解剖できるよう準備します。解剖顕微鏡下で、口鉤がある幼虫の前端を確認します。ピンセットを用いて、幼虫の中央部をシルガード皿の底に軽く押し付けます。別のピンセットで口鉤を掴み、体からゆっくりと静かに引き抜きます。体の大部分を廃棄し、口器を用いて前方部分を保持します。ここでの目的は、成虫原基（imaginal discs）および脳から不要な組織を取り除くことです。次に、ピンセットで口鉤をつかみ、成虫原基を伴う脳をPBSを満たした3ウェルのガラス製ディッシュに移します。次に、PBSを調製したばかりの固定液に置換し、組織をシェーカー上で室温で15分間インキュベートします。15分後、P 200ピペットを用いて固定液を除去します。組織をPBSで2回洗浄し、新しいPBSバスに移します。シェーカーを用い、室温で30分間組織を洗浄します。次に、PBSを除去し、組織をPBSTで2回すすぎます。その後、新鮮なPBSTを加え、顕微鏡下で組織をさらに解剖する準備をします。唾液腺と脂肪組織を除去します。次に、目の成像円盤を他の組織から分離します。これで、免疫組織化学的処理を行う準備が整いました。組織の処理後、それらを

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、次の3つについて説明します...

開発と大人の準備ショウジョウバエ</emライブイメージングのための>脳と網膜

シングルショウジョウバエ個眼の解剖とイメージング

成人を準備するために標準的なアプローチ...

大人の準備ショウジョウバエ</emシンセクショニングおよび顕微鏡分析のための>アイズ

ショウジョウバエの蛹の腹部の免疫組織化学

このビデオでは、ショウジョウバエの蛹から眼と脳の複合体を解剖し、分離する方法を説明しています。この注目のプロトコールは、例えば免疫染色や他の遺伝子発現実験と適合性のある高品質の組織を作製する手順を示しています。...

ハエの蛹からの眼脳複合体の解剖:網膜組織を分離する方法

免疫染色は、組織内の特定の細胞タイプやタンパク質を可視化するための効果的な技術です。超音波処理を利用することにより、ここに記載されているプロトコルは、免疫染色の前に後期胚および幼虫からショウジョウバエ・メラノガスター組織を解剖する必要性を軽減する。私たちは、ホルムアルデヒド固定全マウント幼虫の免疫染色のための効率的な方法を提供します。...

後期胚および幼虫の超音波処理により促進免疫蛍光染色<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;組織<em&gt;その場で</em

ショウジョウバエの成体構造は、虚数円盤と呼ばれる袋のような構造に由来します。これらのディスクの解析により、組織決定、コンパートメント境界の確立、細胞増殖、細胞運命の仕様、平面細胞の極性など、多くの発生過程に関する洞察が得られます。このプロトコールは、光/蛍光顕微鏡用の架空ディスクを調製するために使用されます。...

解剖や成虫の免疫染色からキイロショウジョウバエ

この技術の目標は、研究者があらゆる年齢のショウジョウバエの眼板の解剖、免疫染色、および装着を行うことを可能にすることです。...

解剖と実装<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;蛹アイディスク

このプロトコルは、郭清と大人のショウジョウバエの染色について説明します脳の組織。具体的には、このプロトコルでは、神経の開発の多くの側面の基礎となる原則を明らかに正確に使用することができます例の神経細胞サブセットとしてショウジョウバエのきのこ体と光受容ニューロンの使用を強調表示します。...

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

免疫組織化学、西部の分析、および RNA 抽出のための組織の処理のためのプロトコル、ショウジョウバエ蛹網膜を解剖するための手術方法を提案する.

免疫組織化学、西部の分析、および RNA の隔離のためのショウジョウバエ蛹網膜の解剖

このプロトコルは、イメージングのために幼虫および成虫の ショウジョウバエ...

視葉可視化のためのショ ウジョウバエ の幼虫および成虫の脳の解剖、免疫組織化学、およびマウント

学ぶショウジョウバエ網膜の解剖と免疫組織化学法。幼虫、蛹、成虫の3段階で網膜を摘出し、タンパク質発現を可視化して光受容細胞の分化を単細胞レベルで解析する手法です。

幼虫、蛹および成人の解剖と免疫組織化学

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