ゼブラフィッシュの開発時Photoconvertibleタンパク質を用いた細胞トラッキング
2012年9月28日
ここでは、生きたゼブラフィッシュの胚における光変換性蛍光タンパク質(PCFP)の光活性化スイッチの方法と、発生中の特定の時点での光変換タンパク質のさらなる追跡方法を紹介します。この方法論により、生きた脊椎動物におけるさまざまな発生過程の根底にある細胞生物学的事象をモニタリングすることができます。
この手順の全体的な目標は、生きているゼブラフィッシュの胚の光スイッチされた細胞を追跡することです。これは、最初に胚を埋め込み、組織特異的な光、変換可能な蛍光タンパク質を低融点のaros中で発現させることによって達成されます。次に、目的領域内のタンパク質が完全に写真変換されます。
その後、胚をアロスから慎重に取り出し、後の段階まで摂氏28.5度の卵水に維持します。最後に、写真変換された胚は再び低融解温度のarosに埋め込まれます。最終的には、共焦点顕微鏡による光変換タンパク質の安定した存在により、光変換された細胞を後の段階で正確に検出できることを示す結果を得ることができます。
ですから、今日紹介する方法は、細胞生物学や発生生物学の文脈で非常に役立つと考えています。ですから、この方法論を細胞移動、組織ダイナミクス、その他の細胞の振る舞いの文脈で使用することは、非常に有用であると考えています。この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるVeronica Lombardoです トランスジェニックゼブラフィッシュを交配した後、光変換可能な蛍光タンパク質を発現します。
ホモ接合体である最も明るい胚を選択し、目的の段階に達したときに摂氏28.5度で成長させます。鉗子を使用して、卵水を入れたガラス容器にデコートし、胚を麻酔します。ガラスピペットまたはカットしたピペットチップを使用して、一度に1つずつトリカに移します。
麻酔をかけた胚を培養皿の蓋に移し、胚を可能な限り最小の培地に維持します。胚を1%低融点のアグロスとトリカを摂氏30度でピペッティングしてアロスに移し、蓋付きガラス底の培養皿に入れます。滑らかなプラスチック製の先端を使用して、アグロスが重合したときに胚の向きを合わせます。
405、488、561ナノメートルのレーザー光源と20 x対物レンズを装備した倒立共焦点顕微鏡でTrica溶液で覆います。488ナノメートルおよび561ナノメートルレーザーを使用して、関心領域を含む試料の全構造のZスタックを生成します。時系列ツールを選択し、インターバルなしの2サイクル(1つは事前変換用、もう1つはポストフォト変換用)に設定します。
領域のツールを選択し、写真変換の対象領域を 1 つ以上定義します。次に、漂白ツールを選択し、スキャン後に漂白を開始するように設定します。ここで使用される2つのうちの1つは、30ミリワットの405ナノメートルダイオードレーザーです。
レーザー光の強度、関心領域のスキャン反復、およびスキャン速度を変化させることによって達成される完全な写真変換に必要な最小限のレーザー光量のために慎重に最適化されています。488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーでサンプルをスキャンし、光変換蛍光タンパク質の残りの緑色と光変換された赤色の蛍光を視覚化します。写真変換後、溶液を廃棄し、針または滑らかなプラスチック製の先端を使用して、胚をアグロから慎重に取り除きます。
胚を暗所28.5°Cの卵水に置き、所望の発達段階まで維持します。胚を2回目に埋め込むと、488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーを使用して、関心領域を含む標本のザックを再度生成します。このプロトコルは正常な発生に影響を与えないため、後の段階で写真変換された胚を観察することが可能です。
以下は、光変換アッセイの一例です。内皮細胞は、受精後48時間から72時間までのゼブラフィッシュの発育中に、ここに示すように内皮核内でキックGを発現するトランスジェニックレポーターラインを使用して追跡しました。その後、写真変換キックGは内皮組織内で発現し、488ナノメートルのアルゴンレーザー制御スキャンと561ナノメートルの赤色蛍光スキャンを使用して緑色蛍光としてのみ検出できました。写真変換前にキックGRに変換された写真は検出されませんでした。
その後、関心領域を405ナノメートルのダイオードレーザーを使用して10%の強度で完全に光変換し、20回の反復を行い、488ナノメートルと561ナノメートルのレーザーを使用して頭部血管を再度スキャンしました。このパネルでは、緑のキックGが関心領域内で完全に赤に切り替わり、後の段階で写真変換された内皮細胞を追跡していました。胚は、写真変換後24時間で観察されました。これは、光変換された関心領域から生じる内皮組織内で受精後約72時間です。
赤色蛍光光変換キックGの安定性により、非変換キックGタンパク質と光変換キックGタンパク質の両方が観察され、その開発後に新しい緑色非変換キックGが合成されました。この技術は、発生生物学の分野の研究者がいくつかの魚の細胞生物学と組織リモデリングを探求する道を歩むペースを速めました。
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概要
この記事では、光変換可能な蛍光タンパク質を使用して、生きているゼブラフィッシュ胚内での光スイッチされた細胞を追跡する方法を紹介します。この技術により、共焦点顕微鏡を用いて発生過程中の細胞生物学的現象を監視することが可能になります。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 光変換可能な蛍光タンパク質（PCFP）は、特定の細胞の視覚化を可能にします。
- 生きた生物内での細胞イベントの追跡は発生を理解する上で重要です。
- ゼブラフィッシュ胚は脊椎動物の発生を研究するためのモデル生物です。
- 共焦点顕微鏡は生物学的サンプルの高解像度イメージングを提供します。
研究の目的
- ゼブラフィッシュ胚内での光スイッチされた細胞を追跡する方法を開発すること。
- 発生過程中の光変換タンパク質の安定性を監視すること。
- 生きた脊椎動物の発生プロセスの理解を深めること。
使用された方法
- ゼブラフィッシュ胚を低融点アガロースに埋め込む。
- 組織特異的な光変換可能な蛍光タンパク質を発現させる。
- 関心領域でタンパク質を光変換する。
- 発生のために28.5度セルシウスの卵水中で胚を維持する。
主な結果
- 光変換された細胞は後の発生段階で検出できます。
- 光変換タンパク質の安定な存在により、正確な追跡が可能になります。
- 共焦点顕微鏡は光スイッチされた細胞を効果的に視覚化します。
- この方法論は様々な発生研究に適用できます。
結論
- 提示された方法は、生きたゼブラフィッシュ胚内での細胞イベントを追跡するのに効果的です。
- これは発生プロセスと細胞生物学に関する洞察を提供します。
- このアプローチは将来の脊椎動物の発生研究で利用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Cell tracking using photoconvertible proteins enables precise monitoring of cellular dynamics in vivo, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, reproducible data on cell fate and tissue remodeling, enhancing predictive confidence in preclinical models. The method’s applicability to zebrafish—a disease-relevant system—facilitates translational biomarker alignment and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking specific cell populations during morphogenesis.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of protein fate changes in intact organisms.
- Predictive Value: Generates stable, quantifiable readouts for assessing target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, fluorescent outputs compatible with confocal imaging for high-content screening.
- Reproducibility: Ensures consistent photoconversion efficiency via controlled laser parameters and embedding protocols.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and automated microscopy for longitudinal studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Tracks endothelial and other cell types in zebrafish models of vascular and developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by monitoring cellular events across developmental stages.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights that inform go/no-go criteria for target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven cell tracking, supporting assay development for phenotypic screening, and informing translational research through longitudinal fate mapping.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and target validation by isolating cellular contributions to morphogenetic processes.
- Screening: Generates quantitative fluorescence readouts for compound effect assessment in live embryos.
- Analytics: Delivers stable red/green signal ratios for objective comparison of photoconversion efficiency and protein turnover.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking cellular dynamics to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for tracking multiple cell types across diverse zebrafish transgenic lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in cellular mechanism and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized embedding, photoconversion, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets via direct cell fate observation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative, mechanism-linked cellular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, transgenic line maintenance, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to UV/blue laser sources (405 nm) and compatible photoconvertible protein expression systems.
- Necessitates standardization of laser intensity, scan speed, and iteration counts for reproducible photoconversion.
- Requires optimization across tissue types and developmental stages to avoid phototoxicity and ensure signal stability.
- Limited by the need for genetic accessibility and embryonic viability during prolonged imaging sessions.
