Name: のためのウイルス粒子腫瘍イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 学ぶウイルスナノ粒子を用いたマウス異種移植腫瘍モデルでのin vivo腫瘍標的化とイメージング手法。蛍光標識とPEG修飾によるナノ粒子の機能化と生体内分布評価を解説。

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この作品は、NIHの/ NIBIB助成R00 EB009105（NFS）とP30-EB011317 NFS（へ）、NIHの/ NIBIB訓練助成T32 EB007509（AMW）に、ケース·ウェスタン·リザーブ大学学際アライアンス·インベストメント·グラント（NFSへ）によってサポートされていましたとケース総合がんセンター助成P30 CA043703（NFS）である。我々は、彼らのためにシュタインメッツラボ学部生の研究者に感謝ハンズオンサポート：ナディア唱、ケビン·チェン、ソウラヴ（SID）Deyさん、アリスヤン、サムアレクサンダー、クレイグD&#39;クルス、だからスティーブン鷺、ローレンランドルフ、ブライアン、ポールChariou 。

1。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）伝搬<ol><li>一日の15時間（100％の光、25℃、65％湿度）と夜の9時間（0％光、22℃、60％湿度）に屋内植物室制御を設定します。 </li><li> 表1のタイムラインによると、植物に接種する。 </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX、TMV、とBMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> 0日目：植物3ササゲ種子/ポット。 </td><td> 0日目：植物〜30 N. benthamianaの種/ポット。大さじ1肥料/ 5リットルの水で週に一度受精。 </td></tr><tr><td> 14日目：1工場/ポットで再ポットN. benthamianaの。 </td></tr><tr><td> 10日目：感染は、カーボランダムを軽くを用いた機械的接種によりCPMV（5μg/50μL/葉）を使用してプライマリ·紅葉。 </td><td> 28日目：3〜fを感染IVEは、カーボランダムを軽くを用いた機械的接種によりPVX、TMV、またはBMV（5μg/50μL/葉）の葉。 </td></tr><tr><td> 20日目：収穫の葉や店舗-80℃である。 </td><td> 42日：収穫の葉や店舗-80℃である。 </td></tr></tbody></table> 、成長して感染し、葉を収穫するための表1。タイムライン。 注：のみCPMV伝播が例として示されている。 2。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）精製 注：すべてのステップは氷上または4で行われる℃の<ol><li> （ 表2参照）冷緩衝液の2倍量を使用して標準的なブレンダーで冷凍葉の100グラムをホモジナイズする。寒冷紗の2-3層を介してフィルタリングします。 </li><li> PVXの場合、1M HClを用いてpHを6.5に調整してください。 0.2％（w / v）のアスコルビン酸および0.2％（w / v）のナトリウムsulfiを追加TE。 </li><li> 20分間5500 xgで粗製植物ホモジネートを遠心分離します。上清を収集します。 </li><li> BMVのため、層の10％（w / v）スクロース溶液5ml上清の25ミリリットル。 3時間と38.5パーセントのCsCl溶液（w / v）に再懸濁しペレット9000×gで遠心分離します。 5時間振とうして混合し、次にステップ2.12に進みます。 </li><li> 1:1（v / v）のクロロホルム:1-ブタノール0.7ボリュームを追加することで、植物材料を抽出します。 30-60分間混合物をかき混ぜる。 </li><li> 20分間5500 xgでソリューションを遠心分離します。上部の水相を回収します。 </li><li> PEG（分子量8000）、0.2MのNaClを追加して8％（w / v）である。 TMVは、1％（v / v）トリトンX-100を追加することも。少なくとも1時間撹拌し、少なくとも1時間放置します。 </li><li> 15分間、15,000×gでソリューションを遠心分離します。緩衝液10mlでペレットを再懸濁します。 PVXについては、0.5メートルに0.1％β-メルカプトエタノール及び尿素を追加</li><li> 30分間8000 xgで遠心し、上清を集める。 </li><li> 3時間16万xgで上清を超遠心。 5ミリリットルOバッファでペレットを再懸濁しvernight。 </li><li>バッファの10％、20％、30％、および40％スクロース（最も重い第一）の等量を使用して10から40パーセントショ糖勾配を準備します。勾配は室温で一晩平衡化させます。 </li><li>超遠心機は、2時間（BMVのため24時間）を100,000 xgで、ショ糖勾配上にペレットを再懸濁した。 </li><li>光散乱バンドを収集し、緩衝液に対して透析する。 </li><li> 4時にVNPs（下）と店舗を特徴付ける℃に長期保存には、-80℃で保存し</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMVおよびTMV </td><td> 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0） 38.5 mMのKH 2 PO 4 61.5 mMのK 2 HPO 4、 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0.5 Mホウ酸緩衝液（pH7.8） 0.5Mのホウ酸 NaOHを用いてpHを調整</td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA緩衝液（pH4.5） 250 mM酢酸ナトリウム 10mMのMgCl 2 2 mMのβ-メルカプトエタノール（新鮮追加） </td></tr></tbody></table> 表2各VNP用のバッファーとそのレシピ。 注：のみCPMV伝播が例として示されている。 3。 VNP（CPMV、BMV、PVX、およびTMV）キャラ<ol><li> VNPsの濃度を決定するために、UV /可視分光法を実行します。 <ol><li>光度計、分光光度計を使用してサンプルを2μlの吸光度を測定します。 </li><li>ランベルト·ベールの法則を用いて粒子と色素の濃度を測定（吸光度=εcl、εは吸光係数、cは濃度、lはパスの長さです。）パスの長さは光度は0.1 cmです。 VNP固有の吸光係数は、次のとおりです。 CPMV：8.1 cm -1のミリグラム-1ミリリットル（260nmで） PVX：2.97 cm -1のミリグラム-1ミリリットル（260nmで） TMV：3.0 cm -1のミリグラム-1ミリリットル（260nmで） BMV：5.15 cm -1のミリグラム-1ミリリットル（260nmで） </li></ol></li><li>サイズ排除高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）によって粒子を分析します。 <ol><li>スーパーロース6サイズ排除カラムとÄKTAエクスプローラー、0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）200μl中VNPsの負荷50から100μgを用いた。 </li><li> 260 nmの（核酸）、280 nmの（タンパク質）、および接続された任意の色素の励起波長に検出器を設定します。 </li><li> 72分間、0.5ml /分の流速で実行します。 </li><li>溶出プロファイルとA260：A280 nmはVNPの準備が純粋であるかどうか、および粒子が無傷で組み立てられているかどうかを示します。 以下A260：280比率は純粋VNPの準備を示します： CPMV：1.8±0.1 PVX：1.2±0.1 TMV：1.1±0.1 BMV：1.7±0.1 </li></ol></li><li>個々のコートタンパク質への準備と共役の純度を分析する（プレキャストNuPAGE）変性ビス - トリスアクリルアミド4-12％勾配ゲル電気泳動を行います。 <ol><li>リン酸カリウム緩衝液9μlの中の粒子の10μgを4倍LDSサンプルバッファーの3ミリリットルを追加します。ジスルフィド結合の高い数を減らすためのbmv 4X LDSサンプルバッファーおよびβ-メル​​カプトエタノールを3μlの追加の1μlを添加する。 </li><li> 100℃で5分間熱ブロックでインキュベート℃、 </li><li> SDSゲルにサンプルをロードします。 </li><li>ランニングバッファー1X MOPSで1時間、200Vでサンプルを実行します。 </li><li>蛍光コートタンパク質を可視化するためにUV光下でゲルを文書化します。 </li><li>非蛍光性タンパク質は、1時間クーマシーブルー（0.25％（w / v）をクーマシーブリリアントブルーR-250、30％（v / v）メタノール、10％（v / v）の酢酸）で染色。 </li><li>一晩30％メタノール、10％酢酸で脱色。チャン必要であればGEはソリューションを提供します。 </li><li>白色光の下でゲルを文書化します。 </li></ol></li><li>透過型電子顕微鏡（TEM）により粒子の整合性を分析します。 <ol><li> DI水20μlに0.1から1 mg / mlに試料を希釈します。 </li><li>パラフィルム上のサンプルの20μlの水滴を置きます。 </li><li> TEMグリッドでドロップをカバーし、2分間放置します。ろ紙でグリッド上の余分な溶液をオフウィック。 </li><li>乾いたウィッキングその後DI水の降下に配置することにより、グリッドを洗ってください。 </li><li> 2パーセント20μlのドロップ（w / v）の2分間酢酸ウラニルに配置することにより、グリッドを染色。ろ紙汚れ過剰をオフウィック。 </li><li>もう一度水でグリッドを洗う。 </li><li>透過型電子顕微鏡下のグリッドを観察します。 </li></ol></li></ol> 4。 PEGおよびフルオロフォア、精製とキャラクタリゼーションとVNPsの化学的結合<ol><li>下記の反応のための計算の場合は、VNPsのモル質量は以下のとおりです。 CPMV：5.6×10 6 g / molで PVX：35×10 6 g / molで TMV：41×10 6 g / molで BMV：4.6×10 6グラム/モル</li><li>ワンステップN-ヒドロキシスクシンカップリング反応を用いたCPMVおよびPVXの表面リジンに染料とPEGコンジュゲート：のAlexa Fluor 647、スクシンイミジルエステルの2500モル当量（全モル過剰がVNPあたりモル過剰を参照してください）との4500同等追加NHSを- PEG（分子量5000）は、0.1 Mリン酸カリウム緩衝液中でCPMVをDMSOに溶解した。 PVXで作業する場合、NHS-染料とNHS-PEGの万モル過剰を追加します。 CPMVおよびPVXの最終濃度が2 mg / mlとし、DMSO含有量となるようなバッファーとDMSOのボリュームを調整すると、総反応容量の10％です。光から保護し、室温で一晩反応混合物をインキュベートする。 CPMVおよびPVXは、それぞれ300と1270にアドレス指定リジンを持っています。 （ 読者は上のさらなる読書のための以下の参照と呼ばれますCPMVおよびPVXの化学修飾：13-15）。 </li><li>ジアゾニウムカップリングによるTMVのチロシンと共役染料およびPEGが銅（I）触媒によるアジド - アルキン環が続く。 <ol><li> 0.3Mのp-トルエンスルホン酸一水和物、3.0 Mの亜硝酸ナトリウムを25μl、及び0.68Mの蒸留1時間4℃でアセトニトリルに溶解した3 - ethynylaniline75μlの400μlの混合することによりジアゾニウム塩（アルキン）を準備します。 </li><li> TMVの1.25ミリリットル（20 mg / mlの原液）のNaClを100mMを含むホウ酸塩緩衝液、pH 8.8の3.3ミリリットルを追加します。 </li><li>ジアゾニウム結合によってTMVにアルキンライゲーションハンドルを追加するには3時間、氷浴中でジアゾニウム塩（アルキン）溶液450μlで、TMVに反応する。解決策は、薄茶色に変わります。 TMVは抱合のための2140利用可能なチロシンを持っています。 </li><li>ステップ4.4で説明されるようにショ糖クッションを使用して最終生成物を精製する。 </li><li>アジド官能のAlexa Fluor 647及びPEG-アジド（MW 5000）usinを​​取り付けグラム銅（I）触媒によるアジド - アルキン環化（CuAAC）。 1mMのCuSO 4を 、2mMのAMGは、15分間室温で2mMのアスコルビン酸ナトリウムとコートタンパク質とインキュベート当たり染料およびPEG-アジド2当量を追加します。 TMVの最終反応濃度が2 mg / mlとなるようなバッファの音量を調整します。 （：16,17読者はTMVの化学修飾に関するさらなる読書のための以下の参照と呼ばれます ）。 </li></ol></li><li>リジンとBMVシステイン変異体（cBMV）のシステインにPEGに染料を結合さ： <ol><li> 0.1MのTNKM緩衝液（50mMトリス塩基、50mMのNaCl、10mMのKCl、5mMのMgCl 2、pH7.4）にcBMVにDMSOに溶解オレゴングリーン488、スクシンイミジルエステルの2000モル当量を追加します。 BMVの最終濃度が1 mg / mlおよびDMSOのコンテンツであることそのようなバッファーとDMSOのボリュームを調整すると、総反応容量の10％です。 4℃で一晩反応混合物をインキュベート℃で光から保護。 </li><li>遠心を使って浄化する粒子ステップ4.4で説明されるようにフーガのフィルタ。 </li><li>前と同じ反応条件を用いてPEG-マレイミド（MW 2000）の2000モル過剰を追加し、4℃で2時間反応混合物をインキュベート℃にcBMVは180反応性リジン及びシステインを持っています。 （：18読者はBMVの化学修飾に関するさらなる読書のための以下の参照と呼ばれます ）。 </li></ol></li><li> 精製：2.5時間16万xgで40％（w / v）ショ糖クッションを通して溶液を渡します。バッファーでペレットを再溶解。あるいは、10kDaのカットオフスピンフィルターを使用して、適切な緩衝液に対して透析する。 </li><li> キャラクタリゼーション：UV /可視分光法、SDSゲル電気泳動、FPLC、およびTEM（ 図示されていない、しかし、 図6と図7を参照してください ）：PEG化および蛍光標識VNPsは、上述した方法を用いて分析されています。 </li></ol> 5。マウス異種移植モデルを用いて腫瘍標的とイメージング<ol><li>文化HT-29ヒト結腸癌細胞をRPMI培地で5％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシンを補充し、37℃で1％L-グルタミン℃、5％のCOのC 2 175cm 2の細胞培養フラスコを使用しています。 </li><li> 5分間37℃でトリプシン-EDTA 5mlでインキュベートすることにより、滅菌PBSと収穫で細胞を2回洗浄します。 RPMI培地5mlのトリプシンを不活性化する。 5分間、500×gで遠心分離して細胞を回収する。 5×10 6 cells/50μlの培地（トリパンブルーおよび血球計数器を用いて総細胞数を決定）で新鮮なRPMI中で4℃で再懸濁します。注射（すべてのソリューションおよび試薬は無菌に保つ）に先立ってマトリゲルの等量で混ぜます。 </li><li>調達6週齢のNCR nu / nuマウス、2週間アルファルファフリーダイエットでそれらを維持する。 [注：すべての動物の動物実験委員会の手続きが承認されなければならない。]無菌の18 1/2ゲージを用いて脇腹に5×10 6 cells/100μL/腫瘍（2腫瘍/マウス）の皮下注射による腫瘍異種移植片を誘導針。定期的に動物を監視します。ノギスを用いて腫瘍の大きさを測定し、腫瘍が20ミリメートル3（今後12日以内）の平均体積にまで成長することができます。 PBSおよびVNP（N = 3匹/群/時点）：ランダムに二つのグループにマウスを割り当てる。 1ミリリットル28ゲージインスリン注射器を用いて、静脈内の滅菌PBS尾静脈注射を100μlまたは10 mg / kgのVNP製剤によって管理します。 </li></ol> 注：生きた動物を用いて組織培養実験と研究が実証されることはありません。ハンズオンデモが組織の処理とデータ取得に制限されます。 HT-29腫瘍の異種移植モデルで参照するために、読者はrefに呼ばれています19 3つの手法がVNPsのホーミング腫瘍を評価するために使用されています： <ol start="4"><li> CO 2を使用して、異なる時間点（2、24、および72時間）で生け贄マウス：マエストロイメージングシステムを用いた蛍光イメージングガス。脇腹に腫瘍と一緒に動物や消費税、すべての主要な臓器（脳、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓）解剖、パラフィルム上にティッシュを置いて、（800ミリ黄色励起および発光フィルターを用いた蛍光イメージング装置で分析組織における蛍光シグナル（VNPsに共役A647ラベル由来）の存在を検出するための露光）。画像を保存すると、ImageJ 1.44oソフトウェア（使用して蛍光強度を分析<a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ）。時間は他の主要な組織と腫瘍におけるVNPsの取り込みのパターンを比較してください。 </li><li>撮影後、半分に各組織を切断し、凍結切片および共焦点解析用OCTコンパウンドで半分を埋め込む。予め秤量したクライオバイアル内の他の半分を収集し、直ちにそれらを液体N 2を使用してフリーズ。 -80℃で保存さらなる処理のための準備が整うまでは、C。 </li><li> 蛍光定量：再コー​​ドは、組織の重みを。室温で凍結組織を解凍し、1mlのPBSを含む別々の50mlのFalconチューブの中に置いてください。ハンドヘルド組織ホモジナイザーを用いて、PBS中で2〜3分間組織をホモジナイズ後、マイクロチューブにホモジネートを転送します。非均質化された組織を除去するために13000×gで10分間ホモジネートを遠心分離します。 </li><li> 384ウェル黒色のUVプレートに各グループ（PBSおよびVNP製剤/時点）から組織からの上清をピペットで100μL添加します。プレートリーダーを用いて蛍光強度（励起/ EM波長665分の600）を評価します。組織重量によって得られた蛍光値を正規化します。 </li><li> 免疫組織化学：-20℃で凍結ミクロトーム切片（10μm）とストアを準備細胞核（DAPI）および内皮細胞マーカー（FITC標識抗マウスCD31抗体）の組織切片を染色します。蛍光標識VNPの血管および腫瘍内局在をマッピングする共焦点顕微鏡分析を行うsである。 </li></ol> 注：この手順は、実証されませんが、代表的なデータは、図8に示されている。免疫組織化学上の基準及び記載の染色法について、読者はrefに呼ばれています19

<ol><li>Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dpvweb.net/ ">http://dpvweb.net/ </a> (2012).</li>
<li>Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIPERdb2%3A+an+enhanced+and+web+API+enabled+relational+database+for+structural+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology.</a> Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).</li>
<li>Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+of+engineering+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">The art of engineering viral nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+an+icosahedral+virus+for+nanomedicine+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Nano-Constructs+Composed+of+Genome-Depleted+Brome+Mosaic+Virus+Doped+with+a+Near+Infrared+Chromophore+for+Potential+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications.</a> ACS Nano. , (2011).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+virions%3A+dynamic+tracking+of+the+pathway+of+adenoviral+gene+transfer+vectors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells.</a> Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat. Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+human+prostate+cancer+using+viral+nanoparticles+targeted+to+gastrin-releasing+Peptide+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors.</a> Small. 7, 1664-1672 (2011).</li>
<li>Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+probe+using+hybrid+virus-dye+nanoparticles+for+near-infrared+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Communications%22%5BJournal%5D)">A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography.</a> Optics Communications. 255, 366-374 (2005).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cowpea+mosaic+virus+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3A+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+novel+platform+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications.</a> Nano Lett. 10, 305-312 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+virus+particles+as+addressable+nanoscale+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).</li>
<li>Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+tobacco+mosaic+virus+with+%22click%22+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry.</a> Chembiochem. 9, 519-523 (2008).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+of+the+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルは、in vivoでの腫瘍イメージングのためのVNPsとその応用の化学修飾のためのアプローチを提供します。ここで紹介する動物蛍光イメージング、蛍光定量、および免疫組織化学の技術は生体内分布を研究し、腫瘍がホーミング評価するのに役立ちます。これらの技法は、EPR効果による腫瘍へのナノ粒子のアクセスに関する貴重な情報を提供します。種々の分析方法からの結果を組み合わせることで、我々はVNPsの局在化および生体内分布を評価するための強力なアプローチを取得します。 これらの研究はしかし実行できる前に、それは純粋なウイルス製剤を得ることが不可欠である。別に機械的な接種から、VNP伝播のための可能な代替手段は、高変換と蓄積速度を持つことができagroinfiltrationです。 VNPsを伝播する際に、注意が別個トンなど、さまざまなウイルスに感染した植物を維持するために取られるべきであるoは、交差汚染を避ける。具体的には、TMVのは容易に拡散し、機械的に送信されます。に留意すべき別の重要なステップは、氷上または4℃でウイルス精製を行っているすべ...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;VNPの作製&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>室内植物チャンバー</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; 種子（California black-eye no. 5）</td><td>バーピー</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; 種子</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;N. benthamianaの種子はSalk Instituteから提供されたものである。種子は植物の増殖を通じて生産される。&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>カーボランダム</td><td>フィッシャー</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Pro-mix BX 培養土</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite 肥料</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;装置&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>50.2 Tiローター</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 チタン製ローター</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K 超遠心機</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>SLA-3000ローター</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>SS-34ローター</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus遠心機</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンボトル</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>SLA-3000ローター用</td></tr><tr><td>ポリカーボネート製ボトル</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>SS-34ローター用</td></tr><tr><td>超透明チューブ</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>ショ糖密度勾配およびSW 32 Tiローター用</td></tr><tr><td>ポリカーボネート製ボトル</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>ペレット化および50.2 Tiローター用</td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>PowerEase 500 プリキャストゲルシステム</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL (24 ml) サイズ排除クロマトグラフィーカラム</td><td>GEヘルスケア</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;KTA Explorer 100 クロマトグラフ</td><td>GEヘルスケア</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>卓上遠心機</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;in vivo&lt;/em&gt; イメージングシステム</td></tr><tr><td>組織破断装置</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>透過電子顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>FluoView共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;化学薬品および試薬&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-エチニルアニリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>384ウェル黒色プレート</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris NuPAGE SDSゲル</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>4X LDSサンプルバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャー</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 アジド</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 カルボン酸、コハク酸イミドエステル</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 ml 遠心フィルター</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>分画分子量10 kDa</td></tr><tr><td>アミノグアニジン塩酸塩</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>フィッシャー</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルー R-250</td><td>フィッシャー</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>塩化セシウム</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td>フィッシャー</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>ろ紙</td><td>フィッシャー</td><td>09-801K</td><td>P5グレード</td></tr><tr><td>FITC標識抗マウスCD31抗体</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャー</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸ナトリウム</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>フィッシャー</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドガラス</td><td>フィッシャー</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡用カバーガラス</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>MOPS緩衝液</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>ナノ粒子</td><td>PG1-ML-2k</td><td>分子量 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>ナノカプセル</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>分子量 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>ナノ粒子</td><td>PG1-SC-5k</td><td>分子量 5000</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 サクシニミジルエステル *6-イソマー*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>p-トルエンスルホン酸一水和物</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td>フィッシャー</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二カリウム</td><td>フィッシャー</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>リン酸一カリウム</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>亜硝酸ナトリウム</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>亜硫酸ナトリウム</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>フィッシャー</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>TEMグリッド</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-メルカプト&amp;#8211;エタノール</td><td>フィッシャー</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;組織培養&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>血球計数器</td><td>フィッシャー</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>HT-29細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン、0.05% (1X) EDTA 4Na含有、液体</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;動物実験&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>18%タンパク質 ラット・マウス用飼料</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>アルファルファ不含食</td></tr><tr><td>インスリン用注射器</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>28ゲージ</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>バクスター</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel マトリックス基底膜</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>NCR nu/nuマウス</td><td></td><td></td><td>ケース・ウェスタン・リザーブ大学（CWRU）学部&lt;br/&gt; 医学部 無菌動物およびゼノグラフトコアファシリティ</td></tr><tr><td>滅菌済みシリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18.5ゲージ</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT 包埋剤</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

ナノ材料の使用は、材料科学と医学に革命を起こす可能性を秘めています。現在、異なるナノ粒子の数は、イメージング及び治療への応用が検討されている。植物由来のウイルス粒子（VNPs）が定義されたサイズと形状を持つ自己組織化bionanomaterialsとみなすことができる。シュタインメッツのラボで研究中の植物ウイルスは直径30nmのが、どちらもササゲモザイクウイルス （CPMV）とブロムモザイクウイルス （BMV）によって形成された正二十面体粒子が挙げられる。我々はまた、以下の植物ウイルス由来の棒状、糸状の構造を開発している：18 nmで、300 nmの寸法、および糸状粒子515を形成ポテトウイルスX（PVX）で剛体棒を形成したタバコモザイクウイルス （TMV）、長さと幅で13 nmのナノメートル（ リーダーがレフリーと呼ばれています。VNPsの詳細については、1および2）。 プランタで大規模に容易に製造することができる、非常に安定していて、生体適合性である。また、VNPsは、特に遺伝子組み換えや化学バイオコンジュゲーション法3を用いて操作することができる&quot;プログラマブル&quot;単位です。 VNPsの構造を原子レベルの分解能に知られており、変更は原子レベル4、現在の最先端の技術を有する合成ナノ材料を用いて達成することができないコントロールのレベルで空間的な精度で行うことができる。 本稿では、 緑豆ungiuculataとNicotiana benthamianaのプラントで CPMV、PVX、TMV、とBMVの伝播を記述します。各VNPための抽出と精製プロトコルが与えられている。精製し、化学的に標識VNPsのキャラクタリゼーションのための方法が記載されている。そこで、本研究ではchに焦点を当てるフルオロフォア（ 例えばのAlexa Fluor 647）、ポリエチレングリコール（PEG）とVNPsのemicalラベリング。染料は、5月10日 VNPsの追跡および検出を容易にし、8,11その薬物動態を向上させながら、PEGはタンパク質性ナノ粒子の免疫原性を低減します。我々は、マウス異種移植腫瘍モデルを用いてPEG化VNPsのホーミング腫瘍を実証している。マエストロイメージングシステムを用いて組織ex vivoでの蛍光イメージングの組み合わせは、均質化された組織における蛍光定量、および共焦点顕微鏡は、生体内分布を研究するために使用されています。 VNPsは細網内皮系（RES）を経由してクリアされます。ホーミング腫瘍が強化された透過性と保持（EPR）効果12を介して受動的に達成されます。 VNPナノテクノロジーは、画像に強力なプラグ·アンド·プレイ·テクノロジーであり、 生体内での病気のサイトを扱います。今後はへの薬物貨物や臨床的に意義のあるイメージング部分、ならびに組織特異的リガンドを運ぶためにVNPsを開発しているがんや心臓血管疾患で過剰発現分子の受容体を標的とする。

<img alt="植物成長の比較分析。実験セットアップ、葉色の変動調査、クロロシス法。" src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図1"> 
 図1. 植物ウイルス感染植物。 CPMVに感染したVigna unguiculata (A)。PVX (B)、TMV (C)、およびBMV (D)に感染したNicotiana benthamiana。写真は機械的接種による感染から約10日後に撮影された。
<img alt="吸光度対波長のグラフ。ウイルスの比較：PVX、CPMV、BMV、TMV。スペクトル解析。" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/4352/4352fig...

植物ウイルス粒子（VNPs）は生物医学への応用のための有望なプラットフォームです。ここでは、植物VNP伝播、精製、特性評価、バイオコンジュゲーションするための手順について説明します。最後に、我々は腫瘍ホーミングとマウス異種移植モデルおよび蛍光イメージングを用いたイメージング用VNPsの応用を示す。

ナノ材料の使用は、材料科学および医学に革命をもたらす可能性を秘めています。現在、数多くの異なるナノ粒子が……

この手順の全体的な目的は、蛍光標識したウイルスナノ粒子のin vivoにおける腫瘍標的能および生体内分布を研究することです。マウス腫瘍モデルにおいて、まずウイルスの増殖と精製を行い、次に粒子に色素とPEGを結合させます。機能化された粒子の特性評価後、腫瘍ゼノグラフトを移植したマウスにそれらを注入します。Maestroイメージング、蛍光強度、組織の均質性の測定、および免疫蛍光の結果から、ウイルスナノ粒子が腫瘍および全身の様々な器官に局在していることが示されています。ナノ粒子またはVMPは、生物医学への応用のための有望なプラットフォームです。ここでは、PLA VMPの作製、増殖、精製、キャラクタリゼーション、およびボウェル接合の手順について説明します。最後に、マリノ・グラフトモデルと蛍光イメージングを用いて、腫瘍標的能およびイメージングにおけるV mpsの応用を示します。現在、イメージングおよび治療への応用のために、多くの異なるナノ粒子が研究されています。金属やポリマーナノ材料などの合成材料ではなくバイオナノ粒子を使用する主な利点は、植物由来のBMPsが均一に分散しており、その構造が原子分解能で解明されていることです。植物ウイルスは、分子農業を通じて大量に生産することができ、遺伝子工学および化学工学の両方による改変が可能です。本実演では、フルオロフォア（蛍光色素）とPEGを用いたウイルスナノ粒子の化学修飾について示します。フルオロフォアはイメージングの強化に、PEGは薬物動態の改善に使用されます。化学修飾を拡張することで、ウイルスナノ粒子に治療薬やMRIなどの臨床用イメージングのための造影剤を搭載させることが可能です。ここでは、他のナノ粒子と同様に、修飾されたウイルスナノ粒子の生体内分布研究について実証しました。ウイルスナノ粒子（V NPs）の腫瘍への集積は、透過性および保持性の向上に基づいたものであり、これは受動的腫瘍標的化として記述されます。最近の研究により、異なる植物ウイルスの生体内分布プロファイルがそれぞれ異なることが明らかになりました。本デモンストレーションでは、ウイルスナノテクノロジーのゴールドスタンダードとされるコピーモザイクウイルスを使用します。私たちは、植物ウイルス由来のナノ材料の開発、設計、および研究に特に関心を持っています。当研究室では、Ed cowpea mosaic virus、brown mosaic virus、rock-shaped bacca mosaic virus、およびfilamentous potato virus Xが哺乳類システムとどのように相互作用するかについて、基礎的な理解を得ることに重点を置いています。具体的には、形状と柔軟性がEVO特性にどのような影響を与えるか、また、組織特異的イメージングやドラッグデリバリーなどの応用に向けた最適な調整方法を研究しています。本稿では、cowpea mosaic virus、potato virus X、brown mosaic virus、およびtobacco mosaic virusの調製について詳述します。Vic、Gil、およびNicotianaを用いて、それらの機能化および前臨床マウスモデルへの適用について記述します。本デモンストレーションでは、屋内インキュベーションチャンバー内で牛Pモザイクウイルスを使用します。1ポットあたり3粒の牛P種子を播種してください。10日目に、カルムを軽く振りかけた後、葉を軽く擦る機械的接種法により、0.1 µg/µLのCPMVを各葉に接種します。10日後、葉を採取し-80 °Cで保存します。標準的なブレンダーを用いて、冷凍した葉100 gを2倍量の冷 0.1 M リン酸カリウム緩衝液（pH 7）中でホモジナイズし、ホモジネートを3層のチーズクロスでろ過した後、5,500 ×gで20分間遠心分離します。上清を回収し、クロロホルムと1-ブタノールを1:1の割合で混合した溶液を0.7重量分加え、植物材料の有機抽出を行う。混合物を少なくとも30分間攪拌する。その後、溶液を5,500 Gで20分間遠心分離し、上層の水相を回収して超遠心分離にかける。160,000 Gで3時間遠心分離します。次に、ペレットを5 mLのリン酸緩衝液で再懸濁し、試料を4 °Cで一晩インキュベートします。また、緩衝液を用いて、10%、20%、30%、40%のスクロースを等量ずつ用いた10〜40%スクロース密度勾配を調製します。最も濃度の高い溶液から順に加えて、室温で一晩置いて勾配を平衡化させます。再懸濁したペレットをスクロース勾配の上に重ね、100,000 Gで2時間遠心分離します。光散乱バンドを回収し、バッファーに対して透析を行い、CPMVの表面リシン残基に、蛍光色素を2,500モル当量、NHS PEGを4,500当量で接合させます。反応物を精製した後、NanoDropを用いて2 µLのサンプルの吸光スペクトルを測定し、260 nm、280 nm、および651 nmにおける値を記録します。次に、Superdex 200 size exclusion columnとÄKTA Explorerを用いたサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（SEC-FPLC）で粒子の解析を行います。0.1 Mリン酸カリウム緩衝液200 µLに溶解した50～100 µgのVNPサンプルをロードします。pH 7.0にて、核酸用に260 nanometers、タンパク質用に280 nanometersに検出器を設定します。また、付着させた染料の吸収波長も設定してください。流速0.5 milliliters per minuteで72分間、分離を行います。2:62:80の比率を示すEllucianプロファイルは、反応が純粋であるか、およびV NPSが完全に組み立てられ、完全な状態であるかを示します。次に、個々のコートタンパク質への結合を解析するために、変性SDSゲル電気泳動を準備します。各サンプルについて、9 µLのリン酸カリウム緩衝液中の10 µgの粒子に、4X SDSサンプルバッファーを3 µL加え、ヒートブロックを用いて100 °Cで5分間変性させます。サンプルをSDSゲルにロードし、200 voltsで1時間電気泳動します。1 X mops泳動バッファー中で、白色光を用いてゲルをドキュメントします。染色後、これらのウイルスナノ粒子は、ゼノグラフトマウスモデルを用いた腫瘍標的化およびイメージングに使用可能な状態になります。通常、これらの粒子を静脈内に投与し、VN psの腫瘍ホーミングを評価するために尾静脈注射を用います。Maestro蛍光イメージング装置を使用して組織を分析します。蛍光定量のために、VN PSに結合したA 6 47ラベル由来の蛍光シグナルの検出には、黄色励起・蛍光フィルターを用い、露光時間を800ミリ秒に設定して使用します。組織をPBS中で2〜3分間ホモジナイズします。次に、各時点のPBSおよびVNP製剤用の遠心チューブにホモジナイズした試料を移し、サンプルの100 µLを384ウェルブラックUVプレートに分注します。励起波長600 nmおよび蛍光波長665 nmを用いて、蛍光強度を測定します。VNPの伝播が成功したかどうかは、機械的接種から約1週間後に葉にモザイク症状が現れることで判断できます。粒子の純度の評価には、紫外可視分光光度計を用いることができます。260 nmにおける吸光度は核酸濃度に比例し、280 nmにおける吸光度はタンパク質濃度に比例します。これらのVN PSのサイズ排除溶出プロファイルは、Superose 6カラムおよびAKTA purifierを用いて得られました。UV可視スペクトルと同様に、A260/A280比を用いてVNP調製物の純度を評価できます。さらに、溶出プロファイルを用いて粒子の純度を判定することも可能です。SDSゲル電気泳動により、変性したコートタンパク質のサブユニットを分離します。CPMV粒子は、42 kilodaltonの大タンパク質と24 kilodaltonの小タンパク質の2種類のタンパク質で構成されています。注：これらのウイルス粒子のTEM画像において、小タンパク質には2つの電気泳動形態が存在します。TEMグリッドを2%酢酸ウラニルでネガティブ染色したため、粒子は暗い背景の中で明るく見えます。CPMV粒子のサイズは30 nanometersです。これにより、V NPはバイオコンジュゲート化学を用いて機能化することが可能です。例えば、CPMVにはリシンが含まれており、これを利用して機能化NHSエステルと反応させることで、V NPSの機能化を確認できます。精製粒子に対して以前に用いた方法と同様の手法でキャラクタライゼーションを行います。これらは、蛍光標識およびペグ化されたVN psの代表的なデータです。機能化された粒子は、ペグ化および蛍光標識VN psを用いたバイオディストリビューションや腫瘍ホーミングの調査など、その後のアプリケーションに利用することが可能です。ここでは、ヒトHT 29異種移植片を植え込んだヌードマウスにおけるCPMVの生体分布を評価し、組織のMaestroイメージングを用いて生体分布および腫瘍へのホーミングを評価します。PBSコントロールでは、ex vivoで蛍光は観察されませんでした。一方、Cy5.5およびPEGを結合させたCPMVでは、網内系によるクリアランスのため、肝臓に顕著な蛍光が認められ、脾臓にも一部認められました。腫瘍における顕著な蛍光は、高透過性・持続性（EPR）効果を介した腫瘍へのホーミングを示しています。これらの定量データは、組織重量で標準化した均質化組織の蛍光測定によって得られました。予想通り、データは肝臓および脾臓によるCPMVのクリアランスを示しています。CPMVは腫瘍内でも検出されました。凍結切片組織を用いた免疫染色のさらなる腫瘍内局在解析により、CPMVの腫瘍内局在が示されました。CPMVは赤色で示されています。青色は核を、緑色はanti CD 31で染色された血管を示しています。CPMVは主に腫瘍の血管付近で検出されました。記述されたこれらの手法は、さまざまなバイオナノ粒子システムへの適用を可能にしました。Stein研究室では、ウシモザイクウイルス、ブロモザイクウイルス、ジャガイモウイルスX、タバコモザイクウイルスなどのVMPを研究しています。しかし、これらの手法は、他のウイルスナノ粒子や、ヒートショックタンパク質などのタンパク質ナノ構造にも適用可能です。本手順に続き、独立した手法としてR-T-P-C-Rやウェスタンブロットなどの追加的な解析を行うことができます。凍結切片作成および免疫組織化学染色を用いることで、腫瘍内におけるウイルス粒子（v ps）の局在や、腫瘍関連マクロファージまたはその他のオルガネラとの共局在に関するさらなる情報を得ることができます。このビデオを視聴することで、機能性ウイルスナノ粒子の増殖、精製、機能化、および特性評価の方法と、腫瘍マウスモデルを用いた生体内分布の解析方法について深く理解できるはずです。

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

出典: Kim, B. D., et al.多形性膠芽腫動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達J. Vis.

マウス神経膠芽腫モデルにおける治療用ナノ粒子の静脈内投与

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マウス腫瘍異種移植モデルにおける抗体局在化のためのin vivo蛍光イメージング

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インビトロおよびインビボでの鼻自己組織化ナノエマルジョン腫瘍ワクチンの調製、特性、毒性、および有効性評価

マウスモデルにおける膠芽腫への蛍光標識酸化鉄ナノ粒子の腫瘍送達の2光子顕微鏡法の新しいアプローチを紹介します。...

マウスモデルにおける神経膠芽腫の2光子生体内顕微鏡

血液脳関門は、治療法がない病気である膠芽腫の治療を提供する上で大きなハードルです。ここでは、サイズによってこの生理学的障壁を回避し、腫瘍に蓄積できる in vivo 画像誘導酸化鉄治療用ナノプラットフォームを報告します。...

神経膠芽腫多形動物モデルにおけるオリゴヌクレオチドペイロードのナノ粒子送達

学ぶウイルスナノ粒子を用いたマウス異種移植腫瘍モデルでのin vivo腫瘍標的化とイメージング手法。蛍光標識とPEG修飾によるナノ粒子の機能化と生体内分布評価を解説。

のためのウイルス粒子

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