のためのウイルス粒子腫瘍イメージング
2012年11月16日
植物ウイルス粒子（VNPs）は生物医学への応用のための有望なプラットフォームです。ここでは、植物VNP伝播、精製、特性評価、バイオコンジュゲーションするための手順について説明します。最後に、我々は腫瘍ホーミングとマウス異種移植モデルおよび蛍光イメージングを用いたイメージング用VNPsの応用を示す。
この手順の全体的な目標は、蛍光標識されたウイルスナノ粒子のin vivo腫瘍ターゲティングと生体内分布を研究することです。マウス腫瘍モデルでは、最初にウイルスを増殖させて精製し、次に色素を結合して粒子にペグします。官能基化された粒子を特徴付けた後、それらを腫瘍異種移植片を有するマウスに注入する。
マエストロイメージング、蛍光強度、均質組織の測定、免疫蛍光の結果は、腫瘍や全身のさまざまな臓器におけるウイルスナノ粒子の局在を示しています。プラットホーム。ナノ粒子またはBMPは、生物医学への応用が期待されているプラットフォームです。ここでは、PLA VMP、増殖、精製特性評価、および腸結合の手順について説明します。
最後に、マリノグラフトモデルと蛍光イメージングを使用した腫瘍ホーミングとイメージングへのV mpsの応用を示します。現在、イメージングや治療への応用について、さまざまなナノ粒子が研究されています。金属や高分子ナノ材料などの合成材料よりもバイオナノ粒子を使用する主な利点は、植物由来のBMPがモニター分散されており、その構造が原子分解能で知られていることです。
植物ウイルスは、分子農法によって大規模に生産することができ、遺伝子工学と化学工学の両方に修正可能です。このデモンストレーションでは、Fluor foursとpegを使用したウイルスナノ粒子の化学修飾を示します。Fluor 4 はイメージングの強化に使用され、PEG は薬物動態の改善に使用されます。
化学修飾を拡張して、ウイルスナノ粒子にMRIなどの臨床イメージング用の治療法や造影剤をロードすることができます。ここでは、他のナノ粒子と同様に、ウイルスナノ粒子の生体内分布研究を実証しました。V NPSの腫瘍ハミングは、透過性と保持性の向上に基づいており、これは受動的な腫瘍のホームメイキングと呼ばれます。
最近、さまざまな植物ウイルスの生体内分布プロファイルが異なることがわかりました。このデモンストレーションでは、ウイルスNテクノロジーのゴールドスタンダードと考えられているコピーモサウイルスを使用します。私たちは、植物ウイルスからのナノ材料の開発、エンジニアリング、研究に特に関心を持っています。
私の研究室では、エドウシPモザイクウイルスブロモザイクウイルス、岩形バッカモザイクウイルス、糸状ジャガイモウイルスXが哺乳類システムとどのように相互作用するかについての基本的な理解を得ることに焦点を当てています。具体的には、形状や柔軟性がEVO特性にどのように影響するか、また、組織特異的イメージングや薬物送達などのアプリケーションに最適な方法を学びたいと考えています。この原稿では、カルプモザイクウイルス、ジャガイモウイルスX、ブラウンモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスの調製について詳しく説明しています。
Vic、Gil、Nicotianaから、前臨床マウスモデルにおけるそれらの機能化と応用について説明します。このデモンストレーションでは、屋内のインキュベーションチャンバーでウシPモザイクウイルスを使用します。ポットごとに3つの牛のPシードを植えます。
10日目に、CALUMの軽いダスティングとそれに続く葉の軽い摩擦を使用した機械的接種により、各葉にCPMVのマイクロリットルあたり0.1マイクログラムを感染させます。10日後、葉を収穫し、摂氏マイナス80度で保存します。標準的なブレンダーで、2つの容量の冷たい0.1モルリン酸カリウム緩衝液pH 7で100グラムの冷凍葉を均質化し、3層のチーズクロスでホモジネートをろ過し、5,500Gで20分間遠心分離します。
上清を収集し、次に0.7容量の1対1のクロロホルムと1つのブタノールで植物材料の有機抽出を行い、混合物を少なくとも30分間攪拌します。溶液を5,500Gで20分間遠心分離した後。上部水相と超遠心分離機を回収します。
160, 000 G を 3 時間追加します。次に、ペレットを5ミリリットルのリン酸緩衝液に再懸濁し、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。また、バッファー中の等量の10、20、30、および40%のスクロースを使用して、10〜40%のスクロースグラジエントを調製します。
最も重いものを最初に配置し、室温で一晩グラジエントを平衡化します。スクロース勾配の上に再懸濁パレットを重ね、100, 000 G で 2 時間遠心分離します。光散乱バンドを収集し、バッファーに対して透析して、蛍光色素を結合させ、2, 500モル相当のFluorおよび4, 500相当のNHS PEGからCPMVへの表面リジン残基にペグします。
反応を精製した後、ナノ液滴を使用して2マイクロリットルのサンプルの吸光度スペクトルを測定し、260、280、および651ナノメートルの値に注意してください。粒子のサイズ、排除、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによるスーパーOHシックスサイズ排除カラムの分析に進み、ACTA ExplorerはVNPサンプルを50〜100マイクログラムロードします。200マイクロリットルの0.1モルリン酸カリウム緩衝液。
pH 7.0は、検出器を核酸の場合は260ナノメートル、タンパク質の場合は280ナノメートルに設定します。また、付着する色素の吸光度波長も設定します。毎分 0.5 mL の流速で 72 分間、分離を実行します。
2 62 80 比のエルシアンプロファイルは、反応が純粋であるかどうか、および V NPS が完全に組み立てられて無傷であるかどうかを示します。次に、変性SDSゲル電気泳動を調製して、個々のコートタンパク質への結合を解析します。各サンプルについて、4つのXLDSサンプルバッファーの3マイクロリットルを、9マイクロリットルのリン酸カリウムバッファーの粒子10マイクログラムに加えて、摂氏100度で5分間ヒートブロックで変性させます。
サンプルをSDSゲルにロードし、200ボルトで1時間運転します。1つのXモップランニングバッファーで、白色光の下でゲルを文書化します。染色後、これらのウイルスナノ粒子は、異種移植マウスモデルを用いた腫瘍の標的化およびイメージングの準備が整います。
通常、尾静脈注射を使用してこれらの粒子を投与し、静脈内投与します VN psの腫瘍ホーミングを評価します。800ミリ秒の露光で黄色の励起フィルターと蛍光フィルターを使用して、VN PSに結合したA 6 47標識に由来する蛍光シグナルの存在を検出し、蛍光定量化を行います。
PBSで2〜3分間組織を均質化します。次に、各PBSおよびVNP製剤ごとに均質なフージチューブに均質なものを移し、100マイクロリットルのサンプルSennaを384ウェルブラックUVプレートに移します。6ナノメートルと665ナノメートルの励起波長と発光波長を使用して蛍光強度を測定します。
VNPの増殖が成功するかどうかは、機械的接種から約1週間後に葉にモザイク症状が現れるかどうかで判断できます。UV可視分光法を使用して、粒子の純度を評価できます。260ナノメートルでの吸光度は核酸濃度に比例し、280ナノメートルでの吸光度はタンパク質濃度に比例します。
VN PSのこれらのサイズ排除溶出プロファイルは、Superos 6カラムとACTA精製器を使用して取得しました。UV可視スペクトルと同様に、A two 60対a two 80の比率を使用して、VNP調製物の純度を評価できます。さらに、elucianプロファイルを使用して、粒子の純度を決定できます。
SDSゲル電気泳動は、変性したコートタンパク質サブユニットを分離します。CPMV粒子は、大きな42キロダルトンのタンパク質と小さな24キロダルトンのタンパク質の2つのタンパク質によって形成されます。手記。小さい方のタンパク質は、ウイルス粒子のこれらのTEM画像で2つの電気泳動形態を持っています。
TEMグリッドは2%の小便器アセテートで負に染色されているため、粒子は暗い背景に明るく見えます。CPMV粒子のサイズは30ナノメートルです。その後、V NPSはバイオコンジュゲートケミストリーを介して官能基化することができます。
例えば、CPMVにはリジンがあり、官能基化されたNHSエステルと反応して、精製された粒子に対して以前と同じ方法を使用してV NPS特性評価の機能化を確認できます。これらは、蛍光標識およびペグ化VN psの代表的なデータです。官能基化された粒子は、その後、ペグ化および大腿部標識VN psによる生体内分布や腫瘍ホーミングの調査などの下流アプリケーションに利用できます。
ここでは、CPMVの生体分布をヒトHT 29異種移植片を移植したヌードマウスで評価し、組織のマエストロイメージングを使用して腫瘍ホーミングを評価します。ex vivoでは、PBSコントロールでは蛍光は観察されませんでした。CPMVの場合、6 47とPEGで結合したCPMVでは、細網内皮系による透明化により、肝臓と脾臓の一部に顕著な蛍光が見られました。
腫瘍の顕著な蛍光は、強化された透過性と保持効果による腫瘍のホーミングを示しています。これらの定量データは、組織重量で正規化された均質化された組織の蛍光測定によって取得されました。予想通り、データは肝臓と脾臓によるCPMVのクリアランスを示しています。
CPMVは腫瘍でも検出されます。クライオ切片組織の免疫染色を用いたさらなる腫瘍内局在は、CPMVの腫瘍内局在を示す。CPMV は赤で表示されます。
青色が核で、緑色が抗CD31で染色された血管です。CPMVは主に腫瘍の血管系の近くに見られました。記載された技術は、さまざまなバイオナノ粒子システムへの適用性をもたらしました。
スタイン研究室では、ウシモザイクウイルス、ブロモザイクウイルス、ジャガイモウイルスX、タバコモザイクウイルスなどのVMPを研究しています。ただし、この方法論は、熱ショックタンパク質などの他のウイルスナノ粒子またはタンパク質ナノ構造に適用できます。この手順に従うと、R-T-P-C-R や Western Block などの追加の方法を独立した方法として実行できます。
凍結切片および免疫組織化学は、v psの腫瘍内位置および腫瘍関連マクロファージまたは他のオルガネラとの潜在的な共局在に関する追加情報を得るために用いることができる。このビデオを見れば、ウイルスナノ粒子の増殖、精製、機能化、および特性評価の方法と、腫瘍マウスモデルを使用したin vivoでの分布の研究方法について十分に理解できるはずです。
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概要
この研究は、マウス異種移植モデルにおける腫瘍標的化とイメージングのための植物ウイルス性ナノ粒子（VNP）の使用を探っています。VNPの繁殖、精製、特性評価の手順が詳述されており、これらのナノ粒子の生物医学への応用についても説明しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生物医学
- ナノテクノロジー
- 腫瘍学
背景
- 植物ウイルス性ナノ粒子（VNP）は、医療応用において多用途なツールとして登場しています。
- これらの生体内分布と腫瘍標的化能力を理解することは、治療法開発にとって重要です。
- 蛍光標識により、生物学的システム内でのVNPの追跡が可能になります。
- この研究では、VNPの効果を評価するためにマウス腫瘍モデルを使用しています。
研究目的
- 蛍光標識されたVNPの体内腫瘍への標的化を調査すること。
- 様々な器官におけるこれらのナノ粒子の生体内分布を評価すること。
- 機能化したVNPを潜在的な治療応用のために特性評価すること。
使用した方法
- 植物ウイルス性ナノ粒子の繁殖と精製。
- ナノ粒子への蛍光染料とPEGの結合。
- 機能化したナノ粒子の特性評価。
- イメージング研究のために腫瘍異種移植マウスへのVNPの注入。
主な結果
- 腫瘍組織におけるVNPの局在化が成功しました。
- 蛍光イメージングにより、様々な器官におけるVNPの生体内分布が示されました。
- 特性評価により、結合したナノ粒子の効果が確認されました。
- 結果は、標的型がん治療のためのVNPの可能性を支持しています。
結論
- 植物ウイルス性ナノ粒子は、腫瘍の標的化とイメージングに効果的です。
- 蛍光標識により、VNP分布の視覚化が向上します。
- この研究は、がん治療におけるVNPの将来的な応用のための基礎を提供しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Viral nanoparticles (VNPs) derived from plant viruses offer a programmable, monodisperse platform for in vivo tumor imaging and drug delivery, enabling precise spatial control at atomic resolution. Their biocompatibility, scalability in planta, and tunable surface chemistry support mechanistic de-risking in oncology target validation and preclinical model development. This approach enhances predictive confidence in biodistribution studies and informs go/no-go decisions for nanotherapeutic advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of tumor homing mechanisms via passive targeting through the enhanced permeability and retention (EPR) effect.
- Operational Value: Provides quantifiable fluorescence readouts for assessing nanoparticle localization in tumor and off-target tissues.
- Predictive Value: Supports structure-function relationship studies linking viral nanoparticle shape and flexibility to biodistribution profiles.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Chemically labeled VNPs with Alexa Fluor 647 and PEG generate standardized fluorescent signals detectable by Maestro Imaging System and fluorescence quantification in homogenized tissues.
- Reproducibility: Size-exclusion chromatography and UV-Vis spectroscopy (A260/A280 ratio) ensure batch-to-batch consistency of purified and functionalized VNPs.
- Scalability: Plant-based production in Nicotiana benthamiana and Vigna unguiculata enables large-scale generation of VNPs for downstream screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Xenograft mouse models with HT29 tumors allow evaluation of VNP tumor homing and clearance via the reticuloendothelial system (RES).
- Translational Continuity: Confocal microscopy and immunostaining of cryosectioned tissues enable intratumoral localization studies near vasculature, supporting mechanistic de-risking.
- Risk-Adjusted Advancement: Biodistribution data inform decisions on PEGylation to reduce immunogenicity and enhance pharmacokinetics prior to therapeutic cargo loading.
Pipeline & Workflow Integration
VNP functionalization fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting early-stage target validation through imaging-enabled biodistribution assessment and informing lead identification for nanotherapeutic design.
- Discovery Biology: Fluorescent labeling and PEG conjugation allow hypothesis testing of shape-dependent tumor targeting and RES clearance mechanisms.
- Screening: Standardized purification and characterization workflows enable reproducible production of VNP libraries for comparative screening.
- Analytics: Fluorescence intensity measurements in homogenized tissues, normalized by weight, provide quantitative outputs for comparative biodistribution analysis.
- Translational Research: Intratumoral localization near vasculature, confirmed by immunostaining, supports alignment with vascular-targeted therapeutic strategies.
- Enterprise Reuse: The plug-and-play nature of VNPs allows adaptation for drug cargo loading, clinical imaging moieties, and tissue-specific ligand conjugation across oncology and cardiovascular indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Atomic-level structural knowledge and site-specific conjugation reduce mechanistic ambiguity in nanobio interactions.
- Operational Value: Plant-based production and standardized purification ensure scalable, reproducible supply of monodisperse VNPs.
- Strategic Value: Quantitative tumor homing and organ clearance data improve go/no-go decisions, reducing late-stage biological risk in nanotherapeutic development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of VNP scaffolds based on shape-dependent biodistribution enables informed resource allocation across preclinical programs.
Implementation Considerations
- Expertise in plant virology, protein bioconjugation, and fluorescence-based imaging is required for VNP propagation and functionalization.
- Instrumentation includes ultracentrifuges, size-exclusion chromatography systems (e.g., Superose 6), Maestro Imaging System, and fluorescence plate readers for quantification.
- Cross-team standardization requires harmonized protocols for VNP purification, labeling efficiency assessment (e.g., NHS-PEG conjugation ratios), and biodistribution analysis.
- Adaptation considerations include evaluating shape-dependent differences among icosahedral (CPMV, BMV), rod-shaped (TMV), and filamentous (PVX) VNPs for tissue-specific targeting.
- Practical limitations include RES-mediated clearance in liver and spleen, which may necessitate PEGylation or surface engineering to prolong circulation time for enhanced tumor accumulation.
