免疫応答やスリープ中の定量的測定ショウジョウバエ

次の実験の全体的な目標は、ショウジョウバエの睡眠と免疫機能を評価することです。これは、感染したハエが均質化され、希釈され、LB寒天プレートに広がった後の第2ステップとして、感染したハエの自発運動活動を記録して睡眠と生存を測定することによって最初に達成されます。成長するコロニー形成ユニットの数は、ハエが感染をクリアする能力を示しています。

次に、NFκbルシフェラーゼレポーターを含む導入遺伝子を発現する感染したハエを、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリアンを含む96ウェルプレートに加える。κbルシフェラーゼのリアルタイム測定は、感染中のNFκBシグナル伝達経路の活性化と睡眠生存結果を示しています。バクテリアクリアランスとNF KBレポーター活性は、免疫機能と免疫行動の間の分子的関連性に関するメカニズムの洞察を提供する測定値です。

一般的に、この方法に不慣れな人は、ハエに手動で一貫して感染させる方法を学ぶのに時間と練習が必要なため、苦労しています。ルシファー報告技術がQPCRなどの既存の方法よりも優れている点は、NF Kappa B活性を生活の中でリアルタイムで連続的に測定できることです。ハエは、成虫が環境条件に適応するように、後期瞳孔のショウジョウバエ培養物を3〜4日間孵化させることから始まります。

ここでは、ハエを一定の光の下に置き、概日時計が免疫応答と行動に与える影響を排除します。次に、1〜4日齢のハエをアクティビティにロードします。モニターは、感染予定日の1日前の少なくとも3日間の活動を記録します。

滅菌ピペットチップを備えたSIAコロニーを1つ選択し、チップを5ミリリットルのLB培地を含む培養チューブに浸して、滅菌技術を確認します。バクテリアのないコントロールモックカルチャーを作ることを忘れないでください。翌日、指数関数的な成長段階に達するまで、バクテリアを一晩で成長させます。

600ナノメートルで培養物の吸光度を測定します。2 番目の Q 獣医をブランクとして含めます。濃度が0.5〜1吸光度単位の継代培養の間にあるとき、または必要に応じて培養時間を延長するときに準備が整います。

次に、ハエに感染するための細菌溶液を準備します。バクテリアをPBSで希釈し、600ナノメートルで0.1の期待吸光度にします。次に、インジェクションコントロール用の食品着色料を追加します。

細菌をLB培地と交換します。両方の溶液を氷上に保存します。次に、マイクロピペットプーラーを使用して、解剖顕微鏡下で先端が細い注射針を作成します。

細い鉗子を使用して各針の先端を折って、吸引を使用して注入液で満たすのに十分な大きさの開口部だけでなく、フライへのダメージを最小限に抑えるのに十分な小ささにします。シリンジを使用して、長さのチューブを備えた3ccのプラスチックシリンジにガラス針を取り付けます。注入媒体の流れは手動で制御されます。

シリンジ装置は感染性注射と制御注射の両方に使用されるため、ゴムチューブを注射液で汚染しないでください。キムワイプティッシュを使用して注射剤の流れを確認します。注射を成功させるための2つの重要な詳細は、最適な針のサイズと針とシリンジの間の安全なシールを使用することです。

注入システムが完全に準備されたら、二酸化炭素の流れを最小限に抑えてハエに麻酔をかけ、ハエが5分以上麻酔をかけないように迅速に進めます。次に、背側胸部の斜めのテルムの上の領域にガラス針を突き刺してハエを注入します。フライへの注射用媒体の通過は、注入された溶液が広がるにつれて見ることができる食品着色料によって確認されます。

始める前に、この手順に使用されるすべての材料が少なくとも1日前にオートクレーブされていることを確認してください。LV寒天培地で10センチのシャーレを準備します。実験当日は、麻酔をかけ、ハエを1.5ミリリットルの遠心チューブに入れます。

実験条件ごとに、それぞれ10匹のハエを最低2グループ準備します。また、特に抗生物質耐性のない細菌株を使用する場合は、感染のないハエの対照群を準備します。ロードされたすべてのチューブを氷上に保管します。

次に、フライロードされた各チューブに400マイクロリットルのLBミディアムを追加します。小さなピールを使用してハエを均質化し、これを炎の近くで行って汚染を防ぎます。カットしたピペットチップを使用して、ホモジネートを200マイクロリットルの容量で10倍に連続希釈します。

ホモジネートがシアによる感染直後に作られるならば、1000までdiluを作りますが、しかし24時間、感染後ホモジネートは、100、000まで作ります。次のシードは、ガラス球を使用して均一な分布を確保するためにガラス球を使用して10センチメートルのプレート上の最大の2つのディルであり、プレートを一晩インキュベートします。翌日、プレート上のコロニーの数を直接観察するか、コロニーカウントソフトウェアを使用してカウントします。

次に、フライあたりのコロニー形成単位の数を計算します。このアッセイでは、適切なタイミングでκbルシフェラーゼレポーターを運ぶトランスジェニックフライを使用します。このアッセイでは、前のセクションで説明したように、注射用に調製されたSCIAなどの培養細菌も必要です。

ハエを実験的な照明条件に合わせます。この例では、生後1〜4日齢のκbルシフェラーゼハエを5%ショ糖、2%寒天培地を含むバイアルに収容し、2日間一定の光の下に置きます。次に、ハエ用の96ウェルマイクロプレートを準備します。

各ウェルに2層の食品を入れます。中程度まず、それぞれに300マイクロリットルの5%スクロース、2%寒天溶液を加えます。プレートを細かいメッシュの布でしっかりと覆い、プレートを最大1時間完全に乾かします。

次に、50マイクロリットルの最上層を、5%のスクロース、1%の寒天、および2ミリモルのLuciferを含む各ウェルに加えます。ルシファーは光に敏感であるため、プレートを暗闇で乾燥させて前進させます。プレートの光への露出を最小限に抑えます。

寒天が冷めたら、プレートを透明な粘着フィルムで覆います。次に、細い針を使用して、各ウェルにフィルムを2回穴を開けます。これらの穴は、空気交換とガス状麻酔を可能にします。

次に、フライローディングを容易にするために、鋭利なブレードとストレートエッジを使用して、各コラムの間に切り込みを入れます。ハエに二酸化炭素を麻酔し、各ウェルに1つずつカラムごとにロードします。ハエが映画に引っかかった場合は、介入する前にハエが自分自身を解放する機会を与えてください。

マイクロウェルプレートをインキュベーターに戻し、常時光の下で8〜24時間放置します。よく結合したハエに麻酔をかけるには、低圧二酸化炭素ラインに取り付けられたマイクロピペットチップを使用します。ガスが無害な低圧であることを確認し、マイクロピペットの先端を通気孔の真上に置き、ハエを8個ずつのグループで麻酔します。

各ハエをCO2パッドに移し、以前と同様にバクテリアに感染させます。その後、各フライを元のウェルに戻し、マイクロプレートを再シールします。定義された照明スケジュールの下で温度管理された部屋に収容されたルミノメーターを使用して、各フライの発光を測定します。

プレートをスタッキングカセットにロードし、フライを含むプレートを透明なブランクプレートの間に積み重ねてください。メーカーの仕様に従ってルミノメーターをプログラムし、最低24時間、毎時測定値を収集します。この例では、検出器は各ウェルを 10 秒間読み取るようにプログラムされています。

完了したら、データ ファイルをスプレッドシートにエクスポートし、結果をグラフ化する標準分析を実行します。サンプルデータを分析できます。1秒あたりの割引は、井戸ごとに3回の読み取り値から平均されました。

カントンS野生型は飛んで楽しんでいます。NF κB遺伝子を欠損したE 20の突然変異バエを、常光下で2つの活性モニターにロードし、siaに感染させた。この例では、感染によって睡眠が促進されました。

レリッシュE 20変異体は、感染後のカントンのハエよりも睡眠が少なかったことは明らかでした。これまでの知見と同様に、レリッシュE 20変異体も野生型ハエと比較して急速に感染に屈しました。

ほとんどのハエは無菌制御注射を生き延び、ハエが注射による損傷ではなく感染に屈したことを示しています。レリッシュ変異体は非常に早く死滅したため、感染後に細菌負荷を示すためにカントンのハエのみが使用されました。Siaは感染後24時間後もハエで増殖し続けました。

ルシファーのレポーター活動は、個々のハエ間およびデータポイントの成功間で大きなばらつきを示しました。シグナルはハエ内のすべての組織から得られますが、すべての組織が同じ量のシグナルを放出し、ハエが動くにつれて検出器に対する組織の可視性が変化するとは予想されません。この例では、ハエが感染し、処理された対照群と比較されました。

死んだハエは、ハエのグループ全体で分析から除外されました。Kappa b Luciferaseのレポーターの活動は、感染後に着実に上昇します。Kappa b Luciferaseの記者の活動も、無菌傷害後、着実に上昇しました。

活動のピークは、損傷後と感染後の両方で約12時間でした。このビデオを見れば、感染後のSSOで免疫機能と睡眠を定量化する方法についてよく理解できるはずです。un copy transcription reporterの睡眠、生存率、時間、細菌クリアランス、およびリアルタイムの活動を測定できます。