Name: ゲノムワイドな遺伝子欠失でストレプトコッカス血統ハイスループットPCRによる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: 学ぶ、Streptococcus sanguinisを用いたゲノムワイドな遺伝子欠失法。ハイスループットPCRと形質転換で効率的に変異体を作製し、コロニーPCRとDNAシーケンスで検証する細菌遺伝学の手法です。

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この作品は、バージニアコモンウェルス大学研究所理事長奨励プログラム（PRIP）144602から3（PX）で、国立衛生研究所（PX）からの助成金によってR01DE018138と部分的にサポートされていました。我々は博士に感謝します。レイ·チェン、Yuetanドウとゲノムワイド変異体の構築をサポートするため、王をXiaojing。我々はまた、DNAシークエンシングのためにバージニアコモンウェルス大学でDNAの中核施設に感謝します。

1。プライマー設計<ol><li>プライマーはS.に基づいて家のスクリプトで使用して設計されてい血統 SK36ゲノム配列。プライマー、F1/R1、F2/R2、F3/R3と、3組の標的遺伝子の1-kbの上流配列を増幅するために設計されており、APHA-3をコードする遺伝子、カナマイシン耐性（キロr）はタンパク質3と1それぞれの標的遺伝子の-kbの下流配列、（ 図1）。これらのプライマーのうち、F1およびR3は、プログラムのEMBOSSスイート（でePrimer3を使用して設計されて<a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a>ターゲットの上流または下流隣接領域を増幅するために）遺伝子。遺伝子特異的プライマー、R1とF3は、標的遺伝子の5 &#39;および3&#39;配列に基づいて設計されています。 R1とF3プライマーはAPHA-3に相補的であり、それらの5 &#39;末端の25-bpのアダプター配列を含んでいる遺伝子。各プライマーの融解温度は、できるだけ近い60になるように設計されました°C、96ウェルフォーマットで、すべてのPCR反応のため均一なアニール温度の使用を可能にする。 </li><li> F1、R1、F3とR3プライマーは遺伝子の順序に基づいて、96ウェルプレート内で合成される。各プレートは、同じ遺伝子の順序におけるプライマーの1種類が入っています。マルチチャンネルピペットを用いてPCR増幅のための10μMの最終濃度になるように96ウェルワーキングプライマープレート内のプライマーを希釈します。 </li></ol> 2。ハイスループットPCR増幅および精製<ol><li>ターゲットSの1-kbの上流または下流を増幅する高スループットへ血統の遺伝子は、1640μlのddH 2 Oを、250μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液200μl、50mMのMgSO 4を 、100μlの100μlを含む15 mlコニカルチューブ内の氷の上でPCRカクテル混合物を組み立てる10 ng /μlにS.血統 SK36ゲノムDNAおよび10μlのプラチナTaq DNAポリメラーゼpolyme撃つ高忠実度やマルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルPCRプレートに各ウェルに23μlの混合物を転送します。マルチチャンネルピペットを用いて、PCRプレートにプライマープレートを作業10μMから各F1とR1（またはF3およびR3）の1μLを。 PCRプレートを密封し、1.5分間、30秒、68℃で30秒間、1分間、及び94℃の30サイクル、54℃、94℃で増幅を行う。 </li><li> 48ウェルフィッティングマルチチャンネルピペットのロードとエチジウムブロマイドを含む1％アガロースゲルを準備します。 96ウェルプレートに5xDNAローディングバッファー1μlを4μlのPCR産物を混合し、10μlのマルチチャンネルピペットを用いてアガロースゲルにサンプルをロードします。 30分間135 Vで電気泳動を実行します。 UVPのマニュアルおよび解析システムでゲル上のバンドを調べます。 </li><li>製造業者の指示に従って遠心分離を用いPureLink 96 PCR精製キットでPCR産物を精製する。 DNAを溶出するために、bのウェルに40μlの滅菌蒸留H 2 Oを追加プレートをinding。 </li><li>ランダム光度計、分光光度計を用いてDNA濃度を調べるために板の上にいくつかの精製されたアンプリコンを選ぶ。 〜10 ng /μlに、プレート上のアンプリコンの濃度を調整します。 </li><li>プラスミドを含むキロRカセットは PCR鋳型としてEcoRIにて Iを用いて消化される。消化したプラスミドをQIAquick PCR精製キットにより精製されており、線状プラスミドDNAは最終DNA濃度が10 ng /μlに調整されます。 4、10μM、F2、1μlの1μlのSO 16.4μlのddH 2 Oを、2.5μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液2μl、50mMのMgの1μlを含むキロRカセットリコン用の25μlの混合物を組み立てる10μMのR2は、1μlの線状プラスミドDNAを、0.1μlのプラチナTaq DNAポリメラーゼハイファイ。 ℃で1分間、30秒、68のために30秒で1分、そして94℃の30サイクル、55℃、94℃でPCR増幅を行う。 1％アガロースゲル上で電気泳動によりPCR産物を調べます。うんちQIAクイックPCR精製キットで10個々のPCR精製からキロRカセットリコンのラバルク。 10 ng /μlにするアンプリコンの濃度を調整します。 </li><li>最後の直線換えPCRアンプリコンを取得するには、3つのPCRアンプリコンはウェルPCRテンプレートとして1 PCRプレートの各1μlを（ほぼ等しいモル量で）と結合されます。他のPCRコンポーネント4、10μMのF1を1μl、10μMR3の1μlのは、SO 14.4μlのddH 2 Oを、2.5μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液2μl、50mMのMgの1μlを含めて追加されます0.1μLプラチナTaq DNAポリメラーゼハイファイ。 PCR増幅は4分間3.5分、最後に68℃で30秒、68℃30秒55℃2分間、94℃で30サイクル、94℃で行われる。 </li><li>アガロースゲル上のPCR増幅産物を調べます。上記のように、PCR産物を精製し、定量化する。 -20℃で再結合されたPCRアンプリコンを凍結</li></ol> 3。 COMpetent細胞の調製<ol><li>トッドヒューイットブロスを作製し、室温まで冷却し、0.22μmのポリスチレンフィルタ4を用いて滅菌した後沸騰するまで加熱10NのNaOHを用いてpHを7.6に調整。 TH + HS媒体を補うために、15 mlコニカルチューブに11.7ミリリットルトッドヒューイットブロスに300μlの熱不活化ウマ血清（2.5％最終濃度）を追加します。アリコートのTH + HS培地2ml及びチューブ内に10ミリリットル。 </li><li>株式Sの5μlを接種血統 SK36は2ミリリットルのTH + HS培地中に-80℃で凍結し、37℃でしっかりとプレインキュベート10ミリリットル-TH + HSチューブ伴う℃をキャッピングで一晩培養した培養液をインキュベートする。 </li><li>一晩後、10ミリリットルのTH + HSに50μlの培養を転送し、3時間（0.07から0.08のOD 660に対応）37℃でチューブをインキュベート、直ちに形質転換のために使用します。 </li></ol> 4。細胞の形質転換と抗生物質選択<ol><li> 70 ngのSの2μlを加え血統 SK36コンペタンス刺激ペプチド（CSP）および37のブロック96ウェル、それらプリ暖かい上のエッペンドルフチュー​​ブに2μlの線形リコンビナントPCRアンプリコン（〜50 ngの）℃各試験管に3時間インキュベートしたSK36文化の330μlを。 1時間37℃でインキュベートする。制御などの滅菌ddH 2 OでDNAを交換してください。 </li><li>氷の上にブロックを配置し、500μg/ mlのカナマイシンをブレインハートインフュージョン（BHI）寒天プレート上でそれぞれの変換の100μlを広げた。微好気条件下で2日間37℃でプレートをインキュベートする。 </li></ol> 5。変異体の確認とストレージ<ol><li>それぞれの置換変異体は、ランダムに、2個のコロニーを拾う500μg/ mlのカナマイシンを含む5mlのBHI培地にコロニーを接種し、37℃で一晩microaerobically接種をインキュベート℃に-80℃で30％グリセロールで各文化を凍結保存°C </li><li> 、予想される遺伝子置換を含む変異体は、それぞれの変異体を使用してF1とR3にはコロニーPCRを行うかどうかを調べるために、96ウェルPCRプレートのプライマー。個々のコロニーから約1μlの一晩培養物を25μlのPCR-増幅反応におけるDNA鋳型として使用されます。 PCRは℃で3.5分、最後に68℃で4分間、30秒、68で30秒、55℃で5分、94、35サイクルの°Cのために94℃で行われる。 </li><li>正確にはダブルバンド変異体又は汚染PCRアンプリコンを識別するには、エチジウムブロマイド染色で&gt; 12センチ2％アガロースゲル上で4時間電気泳動によってPCRアンプリコンを調べます。このアガロースゲル電気泳動条件の下で、≥100 bpの差を持つ任意のアンプリコンが明確に特定された。キロr のカセットと、野生型遺伝子の増幅に起因するバンドが&lt;100 bpによって異なることが予想されている場合、内部のT1プライマーは、野生型遺伝子をPCRにより検出することができるかどうかを判断するために使用されます。 </li><li>さらに削除を確認するには、アンプリコンはPureLink 96 PCR精製キットで精製し、そのP1プライマーを用いて配列決定されるキロRカセットに結合する。配列決定によって確認のみ正しい変異を保持します。 </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

初期のプライマーが設計しながら、隣接する遺伝子の外因性の抗生物質遺伝子と1標的遺伝子の交換の可能性極性効果を最小限に抑えるためには、2つのステップがとられる。削除された遺伝子のほとんどは、プライマーR1とF3は前に終止コドンから30 bpに開始コドンに続く6 BPからコーディング領域を削除するために設計されています。最後の30塩基対は、隣接する下流遺伝子によって使用される潜在的なリボソーム結合部位を保護するために保持されます。彼らは反対の向きと両方のタンパク質のN末端に位置していたときに隣接する二つの遺伝子間の保持領域は100塩基対まで拡張され潜在的なプロモーター領域を削除を防ぐために互いに近接しています。 APHA-3遺伝子のプロモーターは、遺伝子欠失5の組換え構築物で除外されている。リボソーム結合部位は、翻訳用のAPHA-3遺伝子に導入される。私たちの戦略をテストするために、我々は、ランダムに10、次に96対立遺伝子交換変異体を構築した。我々OプロモーターレスはAPHA-3遺伝子はほとんどのケースでうまく表現されたことを示唆し、カナマイシン選択プレート上にそ...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt;名前</strong</td&gt;<td<strong&gt;会社概要</strong</td&gt;<td<strong&gt;カタログ＃</strong</td&gt;<td<strong&gt;コメント（オプション）</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーF2</td&gt;<td&gt;統合DNA技術</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; TGACTAACTAGGAGGAATAAATGGCTAAAATGAGAATAT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーR2</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAACAATTCATCCAGT</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーF2P</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーP1</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーP2</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーの5 &#39;end_R1_seq</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーの5 &#39;end_F3_seq</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;プライマーの5 &#39;end_R1p_seq</td&gt;<td&gt;同上</td&gt;<td</td&gt;<td&gt; CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; CSP</td&gt;<td&gt; Synprep</td&gt;<td</td&gt;<td&gt;シーケンス：NH2-DLRGVPNPWGWIFGR、-COOH</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNAポリメラーゼ</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; 11304-102</td&gt;<td&gt;プラチナTaq DNAポリメラーゼハイフィデリティ</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;をEcoRI</td&gt;<td&gt;ニューイングランドバイオラボ社</td&gt;<td&gt; R0101S</td&gt;<td&gt;制限酵素</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;寒天</td&gt;<td&gt;アメリカン·バイオ分析</td&gt;<td&gt; AB01185</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;アガロース</td&gt;<td&gt;プロメガ</td&gt;<td&gt; V3125</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; BHI</td&gt;<td&gt; BD Biosciences社</td&gt;<td&gt; 237500</td&gt;<td&gt;ブレインハートインフュージョン</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;馬血清</td&gt;<td&gt;フィッシャー·サイエンティフィック</td&gt;<td&gt; SH3007403</td&gt;<td&gt;馬血清</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;キロ</td&gt;<td&gt;フィッシャー·サイエンティフィック</td&gt;<td&gt; BP906-5</td&gt;<td&gt;カナマイシン</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; THブロス</td&gt;<td&gt; BD Biosciences社</td&gt;<td&gt; 249240</td&gt;<td&gt;トッドヒューイットブロス</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PureLink 96</td&gt;<td&gt;インビトロジェン</td&gt;<td&gt; K310096</td&gt;<td&gt; PureLink 96 PCR精製キット</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; QIAクイック</td&gt;<td&gt;キアゲン</td&gt;<td&gt; 28106</td&gt;<td&gt; QIAクイックPCR精製キット</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;フィルター</td&gt;<td&gt;コーニング</td&gt;<td&gt; 431117</td&gt;<td&gt;0.22μmのポリスチレンフィルター</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anoxomatシステム</td&gt;<td&gt;マート微生物BV</td&gt;<td&gt; AnoxomatマークII</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ベンチトップ遠心分離機</td&gt;<td&gt;サーモサイエンティフィック</td&gt;<td&gt; 75004377</td&gt;<td&gt;ソーバル伝説RTプラスマイクロローター</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;ゲルドキュメンテーション</td&gt;<td&gt; UVP LLC</td&gt;<td&gt; BioDocイット210</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;インキュベーター</td&gt;<td&gt;フィッシャー·サイエンティフィック</td&gt;<td&gt; 11から690-625D</td&gt;<td&gt; Isotemp</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; LabnetのジェルXL</td&gt;<td&gt; Labnet</td&gt;<td&gt; E0160</td&gt;<td&gt; LabnetのジェルXL</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;マイクロ遠心機</td&gt;<td&gt;エッペンドルフ</td&gt;<td&gt; 22621408</td&gt;<td&gt;マイクロ遠心機5415 R</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;マルチチャンネルピペット</td&gt;<td&gt;サーモScientfic</td&gt;<td&gt; 4661040、4661020</td&gt;<td&gt;フィンピペットF1]</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;サーマルサイクラー</td&gt;<td&gt;アプライドバイオシステムズ</td&gt;<td&gt; N805-0200</td&gt;<td&gt;ジーンアンプPCRシステム9700</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットpcrによる

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

トランスポゾン突然変異誘発及び単一遺伝子欠失は細菌1,2におけるゲノムワイドな遺伝子ノックアウトで適用2つの方法です。トランスポゾン突然変異誘発は、低コスト、時間の無駄であり、完成したゲノム情報を必要としませんが、この方法で2つの弱点がありますが：低下競争を有する変異体をカウンターで選択された混合された変異体ライブラリー内の異なる変異体（1）の可能性が;と、（2）部分的な遺伝子の不活性化の可能性はそれによって遺伝子が完全にトランスポゾンの挿入後に、その機能を失うことはありません。単一遺伝子欠失解析は、トランスポゾン突然変異誘発に付随する欠点を補償することができる。ゲノムワイドな単一遺伝子欠失の効率を改善するために、私たちはモデル生物として連鎖球菌血統を使ってゲノムワイドな単一遺伝子欠失のためのハイスループット技術を確立しようとします。各遺伝子の欠失は、Sで構築血統ゲノムは1を備えるように設計されています標的遺伝子の-kbの上流に、標的遺伝子のカナマイシン耐性タンパク質をコードAPHA-3遺伝子、および1-kbの下流。それぞれのプライマーF1/R1、F2/R2、F3/R3と、、の3つのセットを設計し、各欠失構築物のこれらの3つのコンポーネントのPCR増幅のための96ウェルプレートフォーマットで合成される。プライマーR1とF3はそれらの5 &#39;末端APHA-3遺伝子の領域に相補的な25塩基対の配列を含む。 APHA-3遺伝子の大規模PCR増幅はすべて単一遺伝子欠失構築物を作成するために一回行われます。 APHA-3遺伝子のプロモーターは、当初カナマイシンカセットの潜在的な極性の影響を最小限に抑えるために除外されます。遺伝子欠失構築物を作成するには、ハイスループットPCR増幅および精製は、96ウェルプレートフォーマットで行われます。各遺伝子欠失のための線形換えPCRアンプリコンは、高忠実度DNAポリメラーゼを用いて4つのPCR反応を介して構成されます。初期EXPONSの動増殖期トッドヒューイットブロス中で培養した血統は、不活化ウマ血清をPCR-換え構築物の形質転換のために能力を高めるために使用される2.5％を補足。この条件では、Sの最大20％ 血統細胞は DNAの約50 ngを使用して変換することができます。このアプローチに基づいて、単一遺伝子欠失を持つ2048の変異体は、最終的にSの2270の遺伝子から得られたSに他のORF内に完全に含まれる4つの遺伝子のORFを除く血統血統 SK36と218潜在的な必須遺伝子。遺伝子欠失構築物を作成するための技術は、高スループットであり、任意の形質転換可能な細菌のゲノムワイドな単一遺伝子欠失で使いやすいかもしれません。

後のPCRプライマーF1とR1を使用して増幅し、F3およびR3は、それぞれSの約1 kbの上流および下流血統遺伝子は、96ウェルフォーマットであった（ 図2A）で得られた。私たちのPCR条件と使用して設計されたプライマーの下では、特定の製品はSから増幅した各PCR反応における血統ゲノムDNA。この結果は、プライマーがSのターゲットに非常に特異的であった示された血統 。 PCRの再増幅はDNAを鋳型としてプライマーF1およびR3と3リコンを使って通って、線形リコンビナントPCRコンストラクト（〜3キロバイト）は、高スループットの各標的遺伝子の上流領域からなる96ウェルプレート、カナマイシンで作成されたカセット、その順序で各標的遺伝子の下流の領域（ 図2B）。リコンビナントPCRコンストラクトは次にSに転換した血統 SK36とBHI寒天プレート上にカナマイシンで選択されています。 transfoの大半を1000年コロニー以上rmat...

効率的なゲノムワイドな単一遺伝子突然変異法は使用して確立されている<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;モデル生物として。この方法は、高スループット換えPCRとの変換を介して実現しています。

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

トランスポゾン変異導入法と単一遺伝子欠損法は、細菌のゲノムワイドな遺伝子ノックアウトに適用される2つの手法である1,2。トランスポゾン変異導入法は...

本手順の全体的な目的は、ハイスループットPCRを用いて、streptococcus sanguineにおいてゲノムワイドな単一遺伝子欠損を作成することです。これは、まずハイスループットPCR増幅により、抗生物質耐性遺伝子、および標的遺伝者の上流および下流のDNA配列を含む3つのアンプリコンを取得することで達成されます。第2のステップでは、これら3つのPCRアンプリコンをテンプレートとして用いて、線状の組換えPCRアンプリコンを取得します。次に、コンピテントs sanguine細胞を調製します。最終ステップは、線状の組換えPCRアンプリコンをコンピテントs sanguine細胞に形質転換することです。最終的に、コロニーPCR増幅とDNAシーケンシングを用いて、正しい変異体であることを確認します。自殺プラスミドによるノックアウトなどの既存の他手法に対する本手法の主な利点は、ハイスループットを用いてゲノムワイドな欠損変異体を直接的に作製できることです。PCRプライマーは、streptococcus sanguineous SK 36のゲノム配列に基づいた社内スクリプトを用い、書面プロトコルに従って設計および合成することが可能です。標的遺伝子の1 kb上流配列、A PHA 3 遺伝子のENCコード領域、カナマイシン耐性タンパク質、および標的遺伝子の1 kb下流配列を増幅するために、3セットのプライマーを設計しました。遺伝子特異的プライマー。R1およびF3は、標的遺伝子の5'端および3'端の配列に基づいて設計されており、標的とするs sanguine遺伝子の1 kb上流または下流領域を高スループットで増幅します。まず、15 mLコニカルチューブ内でPCRカクテル混合物を氷上で調製します。s sanguineousゲノムDNAを含むPCR混合液の組成については本文を参照してください。マルチチャンネルピペットを用いて、この混合液23 µLを96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注します。標的遺伝子のアップストリーム配列について、10 µMのワーキングプライマープレートからF1およびR1をそれぞれ1 µLずつマルチチャンネルピペットでPCRプレートに分注します。同様に、標的遺伝子のダウンストリーム配列を増幅させるため、F3およびR3プライマーについても同様の操作を行います。PCRプレートを封印し、94 °Cで1分間加熱した後、94 °Cで30秒間のサイクルを30回繰り返して増幅を行います。54 °Cで30秒間、および68 °Cで1.5分間保持します。増幅後、マルチチャンネルピペットでのロードに適した48ウェルを持つ、臭化物を添加した1%アガロースゲルを調製します。PCR産物4 µLと5X DNAローディングバッファー1 µLを混合します。96ウェルプレート上のarosゲルのサンプルを、10 µLのマルチチャンネルピペットを用いてロードします。135 Vで30分間、電気泳動を行います。UVPドキュメンテーションおよび解析システムを用いて、ゲル上のバンドを確認します。メーカーのDNA溶出指示に従い、遠心分離を用いてPureLink 96 PCR purification kitでPCR産物を精製します。結合プレートの各ウェルに40 µLの滅菌2回蒸留水を加えます。プレート上の精製済みアンプリコンをいくつかランダムに選び、DNA濃度を確認します。NanoDrop分光光度計を使用して、プレート上のアンプリコンの濃度を約10 nanograms per microliterに調整します。次に、EcoR Iを用いて、PCRテンプレートとして使用するためにカナマイシン耐性カセットを含むプラスミドを消化します。消化したプラスミドをQIAquick PCR purification kitを用いて精製し、直鎖状プラスミドDNAを最終DNA濃度10 nanograms per microliterに調整します。書面の手順に従い、F2およびR2プライマーを含む、カナマイシン耐性カセットアンプリコン用の25 µLのPCR混合液を調製します。本ビデオに添えて、ここに記載された手順通りにPCR増幅を行ってください。PCR産物を確認するために、1%アガロースゲルでゲル電気泳動を行います。次に、10個のPCR精製済み個体から得られたcany耐性カセットアンプリコンをまとめてプールします。アンプリコン濃度を10 nanograms per microliterに調整します。この手順において最も困難な点は、3つのPCRアンプリコンから最終的な線状コンピテントPCRアンプリコンを得ることです。成功を確実にするため、3種類のPCR産物の量をほぼ等量に調整します。10 ng/µLのPCR産物3種類を各1 µLずつ、PCRテンプレートとともにPCRプレートに加えます。次に、記載の手順に従い、F1およびR3プライマーを含むPCR混合液を調製します。次に、サンプルのPCR増幅を行います。PCR増幅産物を精製および定量した後、アガロースゲルでPCR増幅産物を確認します。前回と同様に、再結合したPCR増幅産物を−20 °Cで凍結保存します。まず、本ビデオに付随する書面の手順に従って、Todd Hewittおよび馬血清培地を調製します。15 mLコニカルチューブ2本に、培地をそれぞれ2 mLと10 mLずつ分注します。-80 °Cで冷凍保存されていた融解済みのS. sanguine SK 36ストック5 µLを、2 mLの培地に接種します。キャップをしっかりと閉めた培養液を、37 °Cで一晩培養します。また、一晩の培養後、10 mLの培地チューブを同様の条件下でプレインキュベートします。培養液50 µLをその10 mL培地チューブに分注します。チューブを37 °Cで3時間インキュベートします。インキュベーション直後に、70 ng/mLのs sanguineous SK 36コンピテンス刺激ペプチド 2 µLと、リニア recombinant PCRアンプリコン 2 µLを96ウェルブロック上の各チューブに加え、37 °Cで予熱します。3時間インキュベートしたSK 36培養液 330 µLを各チューブに分注します。コントロールとして、DNAの代わりに滅菌二重蒸留水を使用してください。インキュベーション後、チューブを37 °Cで1時間インキュベートします。ブロックを氷上に置き、各形質転換液100 µLを、500 µg/mLのカナマイシンを含む脳心浸出液（BHI）寒天培地に塗布します。プレートを微好気条件下、37 °Cで2日間インキュベートします。各置換突然変異体について、2つの個別のコロニーをランダムに選び、各コロニーを500 µg/mLのカナマイシンを含む5 mLのBHIに接種します。各接種物を微好気条件下、37 °Cで一晩インキュベートします。各培養物を30% glycerolを用いて-80°Cで凍結保存します。変異体に期待通りの遺伝子置換が含まれているかを確認するため、96ウェルPCRプレートを用いて、F1およびR3プライマーによる各変異体のコロニーPCRを実施します。各コロニーから約 1 µL の overnight culture を DNA テンプレートとして用い、25 µL の PCR 増幅反応を行います。変異遺伝子の置換を確認するための PCR 増幅を行い、ダブルバンドの変異体やコンタミネーションによる PCR 増幅産物を正確に特定します。得られた PCR 増幅産物を、12 cm 以上の長さのゲルを用いて 4 時間、ゲル電気泳動で解析します。このアガロースゲル電気泳動条件下において、臭化エチジウム染色を施した2%アガロースゲルを使用します。100塩基対以上の差があるアンプリコンは明確に識別可能です。あるいは、カナマイシン耐性カセットと野生型遺伝子の増幅によって得られるバンドの差が100塩基対未満になると予想される場合は、標的遺伝子の内部T1プライマーを用いて、PCRにより野生型遺伝子が検出可能かを確認してください。欠失をさらに確認するため、pure link 96 PCR purification kitを用いてアンプリコンを精製し、カナマイシン耐性カセットに結合するP oneプライマーを用いてシーケンシングを行います。PCR増幅後、上流配列用のF1およびR oneプライマー、ならびに下流配列用のF threeおよびR threeプライマーを用いてシーケンシングにより確認された正しい変異体のみを保持します。設計したプライマーを用い、PCR条件下で96ウェル形式にて、各s sanguineous遺伝子の上流および下流約1kbが得られました。各PCR反応において、s sanguineのゲノムDNAから特異的な産物が増幅されました。これは、プライマーF1およびR3を用いてPCR再増幅を行い、3つのアンプリコンをDNAテンプレートとして用いた結果、プライマーがs sanguineの標的に対して高い特異性を持つことが示されたためです。線状のリコンビナントPCRコンストラクトをハイスループットで作成しました。各標的遺伝者の上流領域、canyカセット、および下流領域がこの順に構成された96ウェルプレート上のリコンビナントPCRコンストラクトを、s sanguine SK 36に形質転換し、BHI寒天培地上でcanyにより選別しました。ほとんどの形質転換において、微好気状態で2日間培養した後、各プレート上に1,000個以上のコロニーが得られました。これらのコロニーをF1およびR3を用いてPCR増幅し、電泳法で確認したところ、潜在的な必須遺伝子の欠損を試みた場合に、期待される変異体サイズに相当する単一のDNAバンドが観察されました。一部の必須遺伝子の欠損を目的とした形質転換では、ほとんどの場合、コロニーは得られません。しかしながら、これらのコロニーを用いてF1およびRプライマーでPCR増幅を行い、形質転換後のコロニーを確認したところ、ゲル電気泳動により、期待される変異体サイズおよび野生型サイズに対応する3つの2D NAバンドが認められました。一部の変異体では、PCR増幅産物の期待される変異体サイズと野生型サイズが非常に近く、長時間のアガロースゲル電気泳動では分離できませんでした。このような場合には、野生型遺伝子の配列に基づき、標的遺伝子の内部T oneプライマーを設計しました。内部T oneプライマーおよびF1プライマーを用いてPCRを行った。このPCRの陽性対照株として、野生型SK 36を使用した。内部プライマーを用いて変異株から期待されるサイズのバンドが増幅された場合、その遺伝子を必須遺伝子として同定した。変異体におけるカナマイシンカセットの存在は、すでにP1プライマーを用いたDNAシーケンシングによって確認されています。このプロトコルに基づき、2048個の非必須的なS. sanguineous遺伝子変異体を収集しました。なお、他のオープンリーディングフレームに完全に含まれている4つのオープンリーディングフレームは除外しています。実験条件下で、s sanguineの生存に不可欠な218個の遺伝子が特定されました。これらのビデオを視聴することで、ハイスループットPCRを用いてゲノムワイドな遺伝子ノックアウトを行う方法について十分に理解できたと思います。

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Biology

生物学

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学ぶ、Streptococcus sanguinisを用いたゲノムワイドな遺伝子欠失法。ハイスループットPCRと形質転換で効率的に変異体を作製し、コロニーPCRとDNAシーケンスで検証する細菌遺伝学の手法です。

ゲノムワイドな遺伝子欠失で

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