ゲノムワイドな遺伝子欠失で

本手順の全体的な目的は、ハイスループットPCRを用いて、streptococcus sanguineにおいてゲノムワイドな単一遺伝子欠損を作成することです。これは、まずハイスループットPCR増幅により、抗生物質耐性遺伝子、および標的遺伝者の上流および下流のDNA配列を含む3つのアンプリコンを取得することで達成されます。第2のステップでは、これら3つのPCRアンプリコンをテンプレートとして用いて、線状の組換えPCRアンプリコンを取得します。

次に、コンピテントs sanguine細胞を調製します。最終ステップは、線状の組換えPCRアンプリコンをコンピテントs sanguine細胞に形質転換することです。最終的に、コロニーPCR増幅とDNAシーケンシングを用いて、正しい変異体であることを確認します。

自殺プラスミドによるノックアウトなどの既存の他手法に対する本手法の主な利点は、ハイスループットを用いてゲノムワイドな欠損変異体を直接的に作製できることです。PCRプライマーは、streptococcus sanguineous SK 36のゲノム配列に基づいた社内スクリプトを用い、書面プロトコルに従って設計および合成することが可能です。標的遺伝子の1 kb上流配列、A PHA 3 遺伝子のENCコード領域、カナマイシン耐性タンパク質、および標的遺伝子の1 kb下流配列を増幅するために、3セットのプライマーを設計しました。

遺伝子特異的プライマー。R1およびF3は、標的遺伝子の5'端および3'端の配列に基づいて設計されており、標的とするs sanguine遺伝子の1 kb上流または下流領域を高スループットで増幅します。まず、15 mLコニカルチューブ内でPCRカクテル混合物を氷上で調製します。

s sanguineousゲノムDNAを含むPCR混合液の組成については本文を参照してください。マルチチャンネルピペットを用いて、この混合液23 µLを96ウェルPCRプレートの各ウェルに分注します。標的遺伝子のアップストリーム配列について、10 µMのワーキングプライマープレートからF1およびR1をそれぞれ1 µLずつマルチチャンネルピペットでPCRプレートに分注します。同様に、標的遺伝子のダウンストリーム配列を増幅させるため、F3およびR3プライマーについても同様の操作を行います。PCRプレートを封印し、94 °Cで1分間加熱した後、94 °Cで30秒間のサイクルを30回繰り返して増幅を行います。

54 °Cで30秒間、および68 °Cで1.5分間保持します。増幅後、マルチチャンネルピペットでのロードに適した48ウェルを持つ、臭化物を添加した1%アガロースゲルを調製します。PCR産物4 µLと5X DNAローディングバッファー1 µLを混合します。

96ウェルプレート上のarosゲルのサンプルを、10 µLのマルチチャンネルピペットを用いてロードします。135 Vで30分間、電気泳動を行います。UVPドキュメンテーションおよび解析システムを用いて、ゲル上のバンドを確認します。

メーカーのDNA溶出指示に従い、遠心分離を用いてPureLink 96 PCR purification kitでPCR産物を精製します。結合プレートの各ウェルに40 µLの滅菌2回蒸留水を加えます。プレート上の精製済みアンプリコンをいくつかランダムに選び、DNA濃度を確認します。

NanoDrop分光光度計を使用して、プレート上のアンプリコンの濃度を約10 nanograms per microliterに調整します。次に、EcoR Iを用いて、PCRテンプレートとして使用するためにカナマイシン耐性カセットを含むプラスミドを消化します。消化したプラスミドをQIAquick PCR purification kitを用いて精製し、直鎖状プラスミドDNAを最終DNA濃度10 nanograms per microliterに調整します。

書面の手順に従い、F2およびR2プライマーを含む、カナマイシン耐性カセットアンプリコン用の25 µLのPCR混合液を調製します。本ビデオに添えて、ここに記載された手順通りにPCR増幅を行ってください。PCR産物を確認するために、1%アガロースゲルでゲル電気泳動を行います。

次に、10個のPCR精製済み個体から得られたcany耐性カセットアンプリコンをまとめてプールします。アンプリコン濃度を10 nanograms per microliterに調整します。この手順において最も困難な点は、3つのPCRアンプリコンから最終的な線状コンピテントPCRアンプリコンを得ることです。

成功を確実にするため、3種類のPCR産物の量をほぼ等量に調整します。10 ng/µLのPCR産物3種類を各1 µLずつ、PCRテンプレートとともにPCRプレートに加えます。次に、記載の手順に従い、F1およびR3プライマーを含むPCR混合液を調製します。

次に、サンプルのPCR増幅を行います。PCR増幅産物を精製および定量した後、アガロースゲルでPCR増幅産物を確認します。前回と同様に、再結合したPCR増幅産物を−20 °Cで凍結保存します。

まず、本ビデオに付随する書面の手順に従って、Todd Hewittおよび馬血清培地を調製します。15 mLコニカルチューブ2本に、培地をそれぞれ2 mLと10 mLずつ分注します。-80 °Cで冷凍保存されていた融解済みのS. sanguine SK 36ストック5 µLを、2 mLの培地に接種します。キャップをしっかりと閉めた培養液を、37 °Cで一晩培養します。

また、一晩の培養後、10 mLの培地チューブを同様の条件下でプレインキュベートします。培養液50 µLをその10 mL培地チューブに分注します。チューブを37 °Cで3時間インキュベートします。

インキュベーション直後に、70 ng/mLのs sanguineous SK 36コンピテンス刺激ペプチド 2 µLと、リニア recombinant PCRアンプリコン 2 µLを96ウェルブロック上の各チューブに加え、37 °Cで予熱します。3時間インキュベートしたSK 36培養液 330 µLを各チューブに分注します。コントロールとして、DNAの代わりに滅菌二重蒸留水を使用してください。

インキュベーション後、チューブを37 °Cで1時間インキュベートします。ブロックを氷上に置き、各形質転換液100 µLを、500 µg/mLのカナマイシンを含む脳心浸出液（BHI）寒天培地に塗布します。プレートを微好気条件下、37 °Cで2日間インキュベートします。各置換突然変異体について、2つの個別のコロニーをランダムに選び、各コロニーを500 µg/mLのカナマイシンを含む5 mLのBHIに接種します。各接種物を微好気条件下、37 °Cで一晩インキュベートします。

各培養物を30% glycerolを用いて-80°Cで凍結保存します。変異体に期待通りの遺伝子置換が含まれているかを確認するため、96ウェルPCRプレートを用いて、F1およびR3プライマーによる各変異体のコロニーPCRを実施します。

各コロニーから約 1 µL の overnight culture を DNA テンプレートとして用い、25 µL の PCR 増幅反応を行います。変異遺伝子の置換を確認するための PCR 増幅を行い、ダブルバンドの変異体やコンタミネーションによる PCR 増幅産物を正確に特定します。得られた PCR 増幅産物を、12 cm 以上の長さのゲルを用いて 4 時間、ゲル電気泳動で解析します。

このアガロースゲル電気泳動条件下において、臭化エチジウム染色を施した2%アガロースゲルを使用します。100塩基対以上の差があるアンプリコンは明確に識別可能です。あるいは、カナマイシン耐性カセットと野生型遺伝子の増幅によって得られるバンドの差が100塩基対未満になると予想される場合は、標的遺伝子の内部T1プライマーを用いて、PCRにより野生型遺伝子が検出可能かを確認してください。

欠失をさらに確認するため、pure link 96 PCR purification kitを用いてアンプリコンを精製し、カナマイシン耐性カセットに結合するP oneプライマーを用いてシーケンシングを行います。PCR増幅後、上流配列用のF1およびR oneプライマー、ならびに下流配列用のF threeおよびR threeプライマーを用いてシーケンシングにより確認された正しい変異体のみを保持します。設計したプライマーを用い、PCR条件下で96ウェル形式にて、各s sanguineous遺伝子の上流および下流約1kbが得られました。

各PCR反応において、s sanguineのゲノムDNAから特異的な産物が増幅されました。これは、プライマーF1およびR3を用いてPCR再増幅を行い、3つのアンプリコンをDNAテンプレートとして用いた結果、プライマーがs sanguineの標的に対して高い特異性を持つことが示されたためです。線状のリコンビナントPCRコンストラクトをハイスループットで作成しました。各標的遺伝者の上流領域、canyカセット、および下流領域がこの順に構成された96ウェルプレート上のリコンビナントPCRコンストラクトを、s sanguine SK 36に形質転換し、BHI寒天培地上でcanyにより選別しました。

ほとんどの形質転換において、微好気状態で2日間培養した後、各プレート上に1,000個以上のコロニーが得られました。これらのコロニーをF1およびR3を用いてPCR増幅し、電泳法で確認したところ、潜在的な必須遺伝子の欠損を試みた場合に、期待される変異体サイズに相当する単一のDNAバンドが観察されました。一部の必須遺伝子の欠損を目的とした形質転換では、ほとんどの場合、コロニーは得られません。

しかしながら、これらのコロニーを用いてF1およびRプライマーでPCR増幅を行い、形質転換後のコロニーを確認したところ、ゲル電気泳動により、期待される変異体サイズおよび野生型サイズに対応する3つの2D NAバンドが認められました。一部の変異体では、PCR増幅産物の期待される変異体サイズと野生型サイズが非常に近く、長時間のアガロースゲル電気泳動では分離できませんでした。このような場合には、野生型遺伝子の配列に基づき、標的遺伝子の内部T oneプライマーを設計しました。

内部T oneプライマーおよびF1プライマーを用いてPCRを行った。このPCRの陽性対照株として、野生型SK 36を使用した。内部プライマーを用いて変異株から期待されるサイズのバンドが増幅された場合、その遺伝子を必須遺伝子として同定した。

変異体におけるカナマイシンカセットの存在は、すでにP1プライマーを用いたDNAシーケンシングによって確認されています。このプロトコルに基づき、2048個の非必須的なS. sanguineous遺伝子変異体を収集しました。なお、他のオープンリーディングフレームに完全に含まれている4つのオープンリーディングフレームは除外しています。

実験条件下で、s sanguineの生存に不可欠な218個の遺伝子が特定されました。これらのビデオを視聴することで、ハイスループットPCRを用いてゲノムワイドな遺伝子ノックアウトを行う方法について十分に理解できたと思います。