マウスの心臓から初代メラノサイト様細胞を単離する

この手順の全体的な目標は、マウスの心臓から生存可能な心臓メラノサイト様細胞を単離することです。これは、最初に安楽死させたマウスから心臓を採取することによって達成されます。2番目のステップは、酵素消化と機械的攪拌を使用して心臓をミンチにし、細胞を解離することです。

次に、細胞のスラリーを遠心分離し、心筋細胞とメラノサイト様細胞を含むペレットを懸濁します。最後のステップは、プレートと培養です。最終的に単離された心臓メラノサイト様細胞は、細胞の興奮性やトランスクリプトームの状態を評価するための病態生理学的ストレッサーに応答したパッチ研究やマイクロアレイ解析に使用することができます。

心筋細胞を単離して培養するために設計された既存の方法に対するこの技術の主な利点は、細胞のような多くのウェアラブル心筋メラノサイトの単離をもたらすことです。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、新しい細胞集団であるマウスの心臓を発見し、その生理機能を調べたいと思ったときでした。まず、心臓を解剖するためのものと、組織を細かく刻むためのものの、滅菌された手術器具の2セットを準備します。

次に、培地サプリメントを調製しますが、細胞をプレーティングする直前まで培地に加えるのを待ちます。組織培養フードで作業しながら溶液を滅菌するための培地フィルターを調製した後、培地を摂氏4度で保存します。0.05グラムのDNA、10%FBSと抗生物質を含む1〜100ミリリットルのDPBSを追加して、DNAの1つの溶液を準備します。

次に、100ミリリットルのDPBSと抗生物質に0.5グラムのトリプシンを加えて、0.5%トリン溶液を調製します。最後に、ペトリ皿、50ミリリットルのコニカルチューブ、40ミクロンの細胞ストレーナー、DPBSと抗生物質、60ミリメートルと35ミリメートルの培養皿など、手順を完了するために必要な他の機器を集めます。PゼロからP2の新生児マウスの子を安楽死させた後、アルコールで胸を拭き、10センチメートルのPツーディッシュに入れます 実体顕微鏡下でDPBSを働かせて、胸腔を慎重に開き、心房を付着させた状態で心臓全体を切除します。

DPBSで心臓を洗い、新しい10センチのシャーレに移します。切除した心臓を入れたペトリ皿を組織培養フードに移し、次の手順で滅菌技術に従います。まず、滅菌DPBSと抗生物質で心臓を3回洗います。

心臓を60ミリメートルの培養皿に入れ、溶液に0.5%tripsの6〜8ミリリットルを追加します。次に、心臓を細かく切り、摂氏37度で30分間インキュベートします。インキュベーションが完了したら、得られた溶液を皿から滅菌済みの10ミリリットルの円錐管に引き抜きます。

10ミリリットルの滅菌ピペットを使用して、溶液を30〜50回迅速かつ穏やかに再評価し、得られた懸濁液を40ミクロンのセルストレーナーで新しいきれいな50ミリリットルのコニカルチューブにろ過します。遠心分離後、仰臥位を穏やかに吸引し、残りのペレットを6〜8ミリリットルの滅菌DPBSに再懸濁します。この手順をさらに 2 回繰り返します。

遠心分離後の3回目のすすぎ後、洗浄液を慎重に排出または吸引し、ペレットを6ミリリットルの補充培地に再懸濁します。次に、再懸濁した溶液を滅菌済みトランスファーピペットに引き込み、細胞を35mmの皿に入れます。一晩のインキュベーション後に3匹の新生児マウスから単離された心臓細胞を取り出し、付着していない細胞とともに培地を吸引し、DPBSでプレートを一度すすぎ、プレートに新鮮な培地を加えて培地を交換します。

新生児または胚の心臓から単離された細胞は、2日ごとに最大3週間培養に保持できますが、成体の心臓から分離された細胞は、最大10日間培養に保持できます。成体マウスの心臓からメラノサイト様細胞を単離するには、まず、切除した心臓を抗生物質を含む無菌DPBSで組織培養フードで洗浄します。湾曲した解剖鉗子で心臓をわずかに絞って残っている血液を取り除き、次にDPBSでもう一度心臓をすすぎます。

次に、心房と心房心室輪を心臓から取り出し、切除組織標本を35ミリメートルの皿に入れます。湾曲したハサミと鉗子を使用して心臓を細かく切ります。0.5%trips溶液の6〜8ミリリットルを皿に加え、摂氏37度で45〜60分間インキュベートします。

インキュベーション後、前に示した手順を繰り返して、前に成体心筋細胞とプラッターの懸濁液を取得します。この例では、白い矢印は両方のパネルの心臓メラノサイトを示しています。蛍光マーカーの助けがなければ、心メラノサイトは、皿に付着した心房筋細胞と識別し、区別することが困難であること、水色の矢印は、ここに示されている皿によく付着していない心房細胞を指し、新生児マウスの心臓から単離された健康な心臓メラノサイトであることに注意してください。

それらは広範な樹状突起を発達させ、皮膚メラノサイトによく似ています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば数時間で完了します。このビデオを見れば、心臓から生存可能なメラノサイト細胞を単離する方法を十分に理解できるはずです。

これは、生理学的および分子学的分析に適しています。