マウスの心臓から初代メラノサイト様細胞を単離する
2014年9月29日
このプロトコルでは、W eは心房性不整脈に貢献したマウスとヒトの心の中に（また、心臓メラノサイトとも呼ばれます）メラニン細胞様細胞の新規な集団を同定したマウスでトリガします。
本手順の全体的な目的は、マウスの心臓から生存可能な心臓メラノサイト様細胞を単離することです。まず、安楽死させたマウスから心臓を採取します。次に、心臓を細切し、酵素消化と機械的攪拌を用いて細胞を分散させます。
次に、細胞のスラリーを遠心分離し、心筋細胞とメラノサイト様細胞を含むペレットを再懸濁します。最終ステップは、播種および培養です。最終的に単離された心臓メラノサイト様細胞は、パッチクランプ研究や、病態生理学的ストレス因子に対するマイクロアレイ解析に用いられ、細胞の興奮性やトランスクリプトームの状態を評価することができます。
心筋細胞を単離・培養するために設計された既存の手法に対する本手法の主な利点は、多くのウェアラブルな心臓メラノサイト様細胞を単離できることです。もともと、マウスの心臓で新しい細胞集団を発見し、その生理学的特性を調査したいと考えたときに、この手法のアイデアを得ました。まず、心臓を摘出するためのセットと、組織を細切するためのセットの、2組の滅菌済み手術器具を用意します。
次に、培地サプリメントを調製しますが、細胞を播種する直前まで培地への添加は控えてください。組織培養フード内で作業を行い、培地を調製した後にフィルター滅菌し、4 °Cで保存します。10% FBSおよび抗生物質を含むDPBS 100 mLに、DNAse I 0.05 gを添加してDNAse I溶液を調製します。
次に、0.5 gのtrypsinを100 mLの抗生物質添加DPBSに加えて、0.5% trypsin溶液を調製します。最後に、ペトリ皿、50 mLコニカルチューブ、40 µmセルストレーナー、抗生物質添加DPBS、60 mmおよび35 mm培養皿など、手順の完了に必要なその他の器具を揃えます。P0からP2の新生マウスを安楽死させた後、胸部をアルコールで拭き、DPBSを入れた10 cm P2皿に置きます。実体顕微鏡下で慎重に胸腔を開き、心房が付着した状態で心臓全体を取り出します。
心臓をDPBSで洗浄し、新しい10 centimeterのペトリ皿に移します。摘出した心臓が入ったペトリ皿を組織培養フード内に移動させ、以下の手順では無菌操作に従ってください。まず、抗生物質を含む滅菌済みDPBSで心臓を3回洗浄します。
心臓を60 mmの培養皿に入れ、0.5%トリプシン溶液を6〜8 mL加えます。次に、心臓を細かく切断し、37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション終了後、皿の中の溶液を滅菌済みの10 mLコニカルチューブに回収します。
10 mLの滅菌ピペットを用い、迅速かつ穏やかに溶液を30〜50回ピペッティングし、得られた懸濁液を40 µmのセルストレーナーでろ過して、新しい清潔な50 mLコニカルチューブに回収します。遠心分離後、上清を穏やかに吸引除去し、残ったペレットを6〜8 mLの滅菌DPBSで再懸濁します。この工程をさらに2回繰り返します。
遠心分離後の3回目の洗浄の後、洗浄液を注意深く排液または吸引し、ペレットを6 mLの添加物入り培地で再懸濁します。次に、再懸濁液を滅菌転送ピペットで吸い上げ、細胞を35 mmディッシュに移します。一晩のインキュベーション後、新生マウス3匹から単離した心筋細胞を回収し、未接着細胞とともに培地を吸引除去します。その後、プレートをDPBSで1回洗浄し、新鮮な培地を加えて培地を交換します。
新生児または胎児の心臓から単離した細胞は、2日ごとの継代により最大3週間まで培養を維持できますが、成体心臓から単離した細胞は最大10日までとなります。成体マウスの心臓からメラノサイト様細胞を単離するには、まず、組織培養フード内で、抗生物質を含む滅菌DPBSを用いて摘出した心臓を洗浄します。湾曲ピンセットで心臓を軽く絞り、残存血液を除去した後、再びDPBSで心臓をすすぎます。
次に、心臓から心房および房室環を除去し、切り出した組織検体を35 millimeterのディッシュに入れます。曲剪とピンセットを用いて、心臓を細かく切断します。0.5%trips in溶液を6～8 milliliters加え、37 degrees Celsiusで45～60分間インキュベートします。
インキュベーション後、前述の手順を繰り返し、成体心臓細胞の懸濁液を作成し、以前と同様にプレートに播種します。この例では、両方のパネルにおいて白い矢印が心臓メラノサイトを示しています。蛍光マーカーの助けがなければ、心臓メラノサイトを特定し、ディッシュに付着している心房筋細胞と区別することは困難であることに注意してください。水色の矢印頭は、新生マウス心臓から単離された健康な心臓メラノサイトを示すこの図において、ディッシュに十分に付着していない心房細胞を指しています。
それらは広範な樹状突起を発達させており、皮膚メラノサイトに酷似しています。この手法を習得し、適切に実施すれば、数時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、心臓から生存可能なメラノサイト細胞を単離する方法について十分に理解できるはずです。
これにより、生理学的および分子生物学的解析に適した状態になります。
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概要
本プロトコルでは、心房性不整脈に関与するマウス心臓からの心臓メラノサイト様細胞の分離について概説します。この手法では、心臓組織を採取し、細切し、酵素消化することで、さらなる解析に供するための生存細胞を得ます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 心臓生物学
- 細胞生理学
- 不整脈研究
背景
- 心臓メラノサイト様細胞は、新しい細胞集団である。
- これらの細胞は、不整脈の誘因において役割を果たしている可能性がある。
- その機能を理解することは、心疾患に関する知見を得るにつながる可能性がある。
- これらの細胞を単離することで、その特性の詳細な研究が可能となる。
研究目的
- マウス心臓から生存可能な心臓メラノサイト様細胞を単離する。
- 心房不整脈におけるこれらの細胞の役割を評価する。
- 細胞の興奮性とトランスクリプトーム状態に関するさらなる研究を可能にする。
使用方法
- 安楽死させたマウスから心臓を採取する。
- 心臓を細切し、酵素消化により細胞を分散させる。
- 細胞懸濁液を遠心分離し、ペレットを回収する。
- 分離した細胞を播種および培養し、さらなる解析に供する。
主な結果
- 心臓メラノサイト様細胞の単離に成功。
- これらの細胞は、パッチクランプ法による研究やマイクロアレイ解析に使用可能。
- 病理生理学的ストレス下における細胞興奮性に関する知見。
- 心房不整脈のメカニズム解明への潜在的な寄与。
結論
- 心臓メラノサイト様細胞は、心臓における重要な細胞集団である。
- これらの細胞は、マウスにおける不整脈の誘因に関与している可能性がある。
- ヒトの心臓の健康における役割を解明するためには、さらなる研究が必要である。
よくある質問
業界における重要性
心臓メラノサイト様細胞を単離することで、病態生理学的ストレス下における細胞興奮性とトランスクリプトーム応答を研究するための疾患関連システムが提供され、不整脈関連ターゲットのメカニズム的なリスク低減が可能になります。これにより、アッセイ開発およびリード化合物同定のための精製細胞集団が得られるため、心血管系の創薬プログラムにおけるターゲットバリデーションおよび表現型スクリーニングの取り組みがサポートされます。本手法は、新規の細胞表現型を心房不整脈のメカニズムに関連する機能的アウトカムに結びつけることで、初期探索における予測信頼性を向上させます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 新しい心細胞集団の単離により、不整脈のトリガーに関連する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値： 細胞興奮性の根底にある生物学的メカニズムを解明するための機能研究に、精製された細胞源を提供する。
- 予測的価値： マウスモデルにおいて心メラノサイト様細胞と不整脈誘発能を関連付けることで、メカニズムに基づいたリスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：パッチクランプ法およびマイクロアレイ解析に適した生存可能な心臓メラノサイト様細胞を調製でき、定量的な生理学的読み取りが可能になります。
- 運用上の価値：純粋な集団として播種、あるいは心筋細胞と共培養することが可能な再現性のある細胞調製法を提供し、標準化されたアッセイを実現します。
- アッセイへの即応性：病態生理学的ストレス因子に対する細胞応答を評価するダウンストリームのスクリーニングアプリケーションに十分な細胞数を確保できます。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： 分離細胞を用いてマウスにおける心房不整脈トリガーの新たな寄与因子をモデル化し、前臨床モデルの開発を支援します。
- トランスレーショナルな継続性： 細胞の興奮性とトランスクリプトームの状態の解析を可能にし、発見から不整脈メカニズムの機序解明へとつなげます。
- リスク調整済み進展： 前臨床への投資前に、標的調節が不整脈関連表現型に及ぼす影響を評価するための系を提供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この単離方法は、標的仮説の検証から表現型スクリーニングに至るディスカバリー・コンティニュアム（創薬探索の連続的な流れ）に適合しており、不整脈経路における心細胞機能の評価に有用な疾患関連システムを提供します。
- 発見生物学：心房不整脈のトリガーに関与する新規細胞集団を単離することにより、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：電気生理学的およびトランスクリプトーム解析に適した、生存可能な純粋な細胞集団を生成することで、アッセイ開発を可能にします。
- 分析：病態生理学的ストレス因子に対する細胞興奮性と遺伝子発現変化の定量的な測定を容易にします。
- トランスレーショナルリサーチ：マウス系で不整脈を誘発すると推定される細胞型をモデル化することで、初期段階の発見から前臨床検証への橋渡しを行います。
- 企業の再利用：再現性のある単離プロトコルを確立し、複数の研究を通じて一貫した心臓メラノサイト様細胞調製物を生成できるようにします。
運用および企業への影響
- 科学的価値：疾患に関連する細胞モデルへのアクセスにより、不整脈ターゲットのメカニズム的なリスク低減が可能になる。
- 運用的価値：標準化された単離および播種手順により、細胞製造の再現性と拡張性が確保される。
- 戦略的価値：心臓病態生理における新規細胞集団に関する生物学的不確実性を低減し、ゴー/ノーゴー判断に寄与する。
- ポートフォリオへの影響：心臓メラノサイト様細胞が介在する不整脈メカニズムに関連するターゲットの、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 心臓組織の解剖、酵素的解離、および無菌的な細胞培養技術に関する専門知識が必要です。
- 新生または成体マウスの心臓、酵素試薬（trypsin）、およびデブリ除去用のセルストレーナーへのアクセスに依存します。
- 実験を通じて細胞生存率を維持するために、標準化された培地調製および添加剤プロトコルが必要です。
- 適応上の検討事項として、回収率を最適化するために、心臓の成熟度（新生児か成体か）に基づいて酵素処理時間を調整することが含まれます。
- 実用上の制限として、心房筋細胞との形態的な類似性があるため、単離した心臓メラノサイト様細胞を確実に同定するための蛍光マーカーが必要となります。
