Name: マウスの心臓から初代メラノサイト様細胞を単離する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶマウス心臓から初代メラノサイト様細胞を単離する方法。酵素処理と遠心分離を用いて心房性不整脈に関与する細胞を採取し、パッチクランプやマイクロアレイ解析に活用できます。

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VVPMDLに健康賞R01 HL105734の国立研究所によってサポートされていましたこの作品は、部分的には、ヘルスリサーチのキャリア賞K08 HL094748の国立研究所によって、サポートされています。 VVPは、付与11IRG900384でサポートされている米国心臓協会の革新的な研究である。

必要なソリューションと機器の準備1。 <ol><li>まず、15分のためにそれらをオートクレーブで手術器具（ストレート形状鉗子、湾曲した形状の鉗子、ストレート形状のはさみ、湾曲形状はさみ）を殺菌する。 121℃。組織をミンチに使用される1組の心と他のセットを解剖するために使用されている楽器、2セットを準備します。 </li><li>滅菌濾過し、水900mlでMCDB153培養培地の1パケットを溶解し、粉末が溶解するまでゆっくり撹拌する。溶解するまで調製し、撹拌している培地の最終容量1リットルのために、[w / vの7.5％] 1.2グラムの重炭酸ナトリウム、または重炭酸ナトリウム溶液15.7 mlを加え。その後、組織培養フード（バイオセーフティキャビネット）において無菌条件下で0.2μmのボトルトップフィルターを介してメディアを注ぐ、1N HClまたは1N NaOHのいずれかを追加することによって、7.2にpHを調整する。その後、メディアを収集し、4℃で保管してください。 </li><li>サプリメントへの準備を培養培地（材料リスト）に追加する。サプリメントは、メディアが細胞をプレーティングするために必要とされる直前に培地に添加されるべきである。 </li><li> 10％FBSを加えた抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）とのDPBSを準備します。 </li><li> DPBSを加えた抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）100mlに、次に、トリプシン、0.25gの（USBウシ膵臓、活性&gt; 2,500 USP単位/ mg、超高純度）を添加することによって0.25％トリプシン溶液を調製。 </li><li>この手順を完了するために必要なその他の必要な機器は、実体顕微鏡、ペトリ皿（10センチ）、50 mlのコニカルチューブ、40μmのセルストレーナー、DPBSを加えた抗生物質、60 mmの培養皿および35mmの培養皿が含まれています。 </li></ol>新生児マウスの仔から2分離ハーツ<ol><li>まず、P2新生仔マウスにP0を取得した（n = 6〜8）。 EYFP対立遺伝子またはZ / EGアレルラベルを付ける：R26Rどちらが探しこれは、ヘテロ接合性である雄とDCT-Creをホモ接合の雌の繁殖によって生成された子犬の使用をお勧めしますメラノサイト様細胞。両R26R：EYFPおよびZ / EGマウスは、ジャクソン·ラボラトリーズ（それぞれ株式数006148と003920）から入手可能である。 </li><li>次に、新生児仔マウスを安楽死させるアルコール綿で胸を拭く、次にDPBSで10センチのペトリ皿に子犬を置く。 </li><li>滅菌ピンセットとはさみで胸と胸骨の上に皮膚をカットした後、実体顕微鏡下で慎重に胸を開きます。新生児仔マウスの心は非常に小さいので、添付の心房と心臓全体を削除してくださいするように注意してください。 </li><li> DPBSで心を洗い、新しい10cmのペトリ皿に移す。 </li></ol> 3酵素消化<ol><li>組織培養フード（バイオセーフティキャビネット）に切除した心でペトリ皿を持参してからフード内で無菌技術を使用して以下の手順に従ってください。 </li><li>まず、無菌DPBSプラス抗生物質に心を3回洗浄する。 </li><li>でた（n = 6-8）の心を置きます60 mmの培養皿と皿に0.5％トリプシン溶液6-8 mLを加え。 </li><li>次に、（サイズが1ミリメートル未満の）小片に心を切断し、5％CO 2雰囲気中で30分間37℃でそれらをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション期間が完了した後、滅菌50 mlコニカルチューブに心臓組織と皿からトリプシンの得られた溶液を注ぐ。 </li><li>その後、すぐにかつ慎重に、10 mlの滅菌ピペットを用いて、50mlのコニカルチューブ内で30〜50回のソリューションを粉砕する。 </li><li>ろ液を収集するために、新しい、清潔な50mlのコニカルチューブの上に40μmのセルストレーナーを通して得られた溶液をろ過する。 </li><li>次に、室温で5分間卓上遠心機で240×gで50 mlチューブを遠心する。その後、静かに上清を吸引し、滅菌DPBS 6-8中で残ったペレットを懸濁します。このステップをさらに2回繰り返します。このステップは、心房筋細胞や心臓のメラノサイトをペレットが、第がダウンすることはありません線維芽細胞からの芽細胞は小さく、上清中に残ります。 </li></ol> 4。メッキ心臓メラノサイト様細胞<ol><li>遠心分離後の第3のすすぎに続いて、慎重にドレインまたは吸引洗浄溶液（DPBS）オフやサプリメントが追加された先のMCDB培地6mlにペレットを再懸濁します。 </li><li>さて、無菌トランスファーピペットに再懸濁させた溶液を描き、35 mmディッシュ中で、あるいは6ウェルプレートのウェル中の細胞を置き、1 35-mmディッシュに3新生児マウスから単離された心臓細胞をプールかよく。 </li><li> 、5％CO 2雰囲気下で37℃で一晩皿をインキュベートあらゆる付着していない細胞と一緒に培養培地をオフに吸引した後、DPBSで一度プレートをすすぐ。その後、プレートに新鮮な培地を追加し、2日ごとにメディアを交換。細胞は成体聞くから単離され、一方、新生児または胚の心臓から単離された細胞は、最大で3週間培養物中に維持することができるtsが最大10日間培養物中に維持することができる。 </li></ol> 5。成体マウス心臓から心臓メラノサイト様細胞を単離する<ol><li>まず、マウスにヘパリン100 Uの腹腔内に投与し、それらを安楽死させた後（3-4週齢、n = 3）の成熟したマウスから心を取り除くミッドライン胸骨切開を通して。それは、この手順のためにマウスを安楽死させるために、ペントバルビタールの使用をお勧めしますが、この薬は、すべての場所で​​は使用できません。 </li><li>次に、組織培養フード（バイオセーフティキャビネット）中の抗生物質を含む滅菌DPBS中に切除心を洗う。そこから残りの血液を除去した後、DPBSでもう一度心をすすぐために湾曲した解剖用鉗子で少し心を絞る。 </li><li>心臓から心房と房室弁輪を取り外します（これらの構造はメラニン細胞様細胞が含まれている）、および35-mmディッシュで切除した組織標本を置く。 </li><li>湾曲したハサミと力を用いて小片に心をカットpsの、その後皿に0.5％トリプシン溶液6-8 mLを加え。その後、45〜60分間37℃で料理をインキュベートする。 </li><li>さて、以降のステップ3.6から始まる上記の手順から手順に従ってください。 </li></ol>

<ol><li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li>
<li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li>
<li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li>
<li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Cardiovasc.+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li>
<li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li>
<li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+melanoblasts+in+culture%3A+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2%2C+stem+cell+factor%2C+and+endothelin-3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li>
<li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li>
<li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li>
<li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Res%22%5BJournal%5D)">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li>
</ol>

私たちは、開示することは何もない。

心臓メラノサイトは、一般的に心房性不整脈のトリガーを引き起こす心臓内の解剖学的位置に存在している。これらの領域は、肺静脈、房室弁輪、後部左心房と卵円孔（ 図4）が挙げられる。これらの細胞は不整脈原性に果たす役割を理解するために、私たちはそれらを分離し、その生理機能を研究するための技術を開発する。しかし、心臓のメラノサイトの健康でより大量に生成するこの技術の改善は、外因性の刺激に対する心臓のメラニン細胞の応答を調べるためにさらなる研究を可能にするであろうことを認識した。さらに、改良された単離技術はまた、正常な生理機能および疾患の間の心房筋細胞と心筋メラニン細胞の相互作用を調査するための研究を可能にすることができる。 本稿では、ISOLように設計されたプロトコルから開発されたマウスの心臓から実行可能なメラニン細胞様細胞を単離するための手順を説明します皮膚からメラノサイトを食べた。このプロトコルにおける重要なステップは、心臓からメラニン細胞様細胞を抽出している。新生児心臓から心臓メラノサイトを分離することは比較的簡単ですが、成熟した心臓から心臓メラノサイ...

私たちは最近、メラニン合成酵素を発現するマウスとヒトの中心部に新たな細胞集団を同定し、形態学的に皮膚のメラノサイトに似ている。当社は、これらの細胞の心臓メラノサイト」と呼ばれ、彼らは心房性不整脈が頻繁に人間に由来トリガするの解剖学的位置に存在しているが見つかりました。また、心臓のメラノサイトは、DCTの生殖細胞欠失を有するマウスでは心房性不整脈に貢献した。心臓のメラノサイトは、まばらにそれらが全ての心房細胞の0.1％未満を含み、マウスの心房全体に分散されている。心臓のメラノサイトの電気的および生物学的特性を調査するために、私たちは、Cre誘導性メラノサイト特異的マーカーを用いて、マウスの心臓からそれらを分離するための手順を開発しました。当初の手順は、新生児マウスの心筋細胞を単離するために使用されるものから開発され、パッチクランプ記録またはPCR分析に適した少数細胞を得た。しかし、癒すを改善する目と心臓のメラノサイトの生存率は、より詳細な電気生理学的解析や生化学的研究のために、私たちは皮膚のメラニン細胞を単離するために設計されたものから洗練された手順を開発しました。このレビューに記載され、実証された手順は、純粋な集団として、または心筋細胞でメッキすることができる健康な心臓のメラノサイトを生成するという利点を有している。

<table><tbody><tr><td>MCDB 153</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>水に溶解</td></tr><tr><td>DPBS（カルシウム、マグネシウム不含）</td><td>Invitrogen</td><td>14190136</td><td>ストック濃度：1x&lt;br/&gt; 最終濃度：1x</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>ストック濃度：100x&lt;br/&gt; 最終濃度：1x</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Life Technology</td><td>認定済み</td><td>最終濃度：4%</td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>DMSOに溶解&lt;br/&gt;ストック濃度：3.2 &amp;mu;M&lt;br/&gt;最終濃度：32 nM</td></tr><tr><td>トランスフェリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>DPBSに溶解&lt;br/&gt;ストック濃度：0.1 mg/ml&lt;br/&gt;最終濃度：1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>ジブチリル cyclic AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>DPBSに溶解&lt;br/&gt;ストック濃度：0.5 mM&lt;br/&gt;最終濃度：5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>10 mM 酢酸に溶解&lt;br/&gt;ストック濃度：1 mg/ml&lt;br/&gt;最終濃度：5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Basic FGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td>水に溶解&lt;br/&gt;ストック濃度：4 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt;最終濃度：4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

マウスの心臓から初代メラノサイト様細胞を単離する

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

私たちは、マウスでの心房性不整脈のトリガーに貢献し、マウスおよびヒトの心の中に（また、心臓メラノサイトとも呼ばれます）メラニン細胞様細胞の新規集団を同定した。心臓のメラノサイトの電気的および生物学的特性を調査するために私たちは、新生児マウスの心筋細胞を単離するために設計されたものに由来するマウスの心臓からそれらを分離するための手順を開発しました。より広範なパッチクランプまたは生化学的研究に適して健康的な心臓メラノサイトを得るために、私たちは、もともと皮膚のメラニン細胞を単離するために設計されたものに基づいて心臓のメラノサイトを分離し、メッキする洗練された手順を開発しました。洗練された手順は、このレビューで実証し、純粋な集団として、または心筋細胞でメッキすることができる健康的なメラニン細胞様細胞のより大きな数字を生成する。

この資料に記載されたプロトコルは、私たちが以前にマウスの心臓から心臓メラノサイトを分離するために公開1と比較して改善された手法である。この手順では、心臓のメラニン細胞様細胞を標識するためにメラニン合成酵素特異的にCre-リコンビナーゼにより駆動される蛍光マーカーの使用を採用する。新たに単離された胚性または新生児の細胞を扱うとき心房筋細胞から心臓のメラノサイトを区別する形態学的な違いは、まだ発症していないので、それは、（ 図1A）、心臓メラノサイトにラベルを付けるために、マーカーを使用することが重要です。 図1Aに示すように、単離工程がうまくいった場合には、心房筋細胞および心臓メラノサイトのかなり大きな数はわずか非接着細胞とラミニンコートディッシュに付着する。この場合、接着細胞をシャーレ（黄色矢頭図1A、矢印）の底に平らに表示されます。一方、時procedureがうまく動作しない細胞のほとんどは、非付着性となり、多くの場合、球状のを見て、（水色矢印、 図1A）切り上げ。 <p class="jov...

このプロトコルでは、W eは心房性不整脈に貢献したマウスとヒトの心の中に（また、心臓メラノサイトとも呼ばれます）メラニン細胞様細胞の新規な集団を同定したマウスでトリガします。

マウスおよびヒトの心臓において、心房の…に寄与するメラノサイト様細胞（心メラノサイトとしても知られる）の新たな集団を同定した。

本手順の全体的な目的は、マウスの心臓から生存可能な心臓メラノサイト様細胞を単離することです。まず、安楽死させたマウスから心臓を採取します。次に、心臓を細切し、酵素消化と機械的攪拌を用いて細胞を分散させます。次に、細胞のスラリーを遠心分離し、心筋細胞とメラノサイト様細胞を含むペレットを再懸濁します。最終ステップは、播種および培養です。最終的に単離された心臓メラノサイト様細胞は、パッチクランプ研究や、病態生理学的ストレス因子に対するマイクロアレイ解析に用いられ、細胞の興奮性やトランスクリプトームの状態を評価することができます。心筋細胞を単離・培養するために設計された既存の手法に対する本手法の主な利点は、多くのウェアラブルな心臓メラノサイト様細胞を単離できることです。もともと、マウスの心臓で新しい細胞集団を発見し、その生理学的特性を調査したいと考えたときに、この手法のアイデアを得ました。まず、心臓を摘出するためのセットと、組織を細切するためのセットの、2組の滅菌済み手術器具を用意します。次に、培地サプリメントを調製しますが、細胞を播種する直前まで培地への添加は控えてください。組織培養フード内で作業を行い、培地を調製した後にフィルター滅菌し、4 °Cで保存します。10% FBSおよび抗生物質を含むDPBS 100 mLに、DNAse I 0.05 gを添加してDNAse I溶液を調製します。次に、0.5 gのtrypsinを100 mLの抗生物質添加DPBSに加えて、0.5% trypsin溶液を調製します。最後に、ペトリ皿、50 mLコニカルチューブ、40 µmセルストレーナー、抗生物質添加DPBS、60 mmおよび35 mm培養皿など、手順の完了に必要なその他の器具を揃えます。P0からP2の新生マウスを安楽死させた後、胸部をアルコールで拭き、DPBSを入れた10 cm P2皿に置きます。実体顕微鏡下で慎重に胸腔を開き、心房が付着した状態で心臓全体を取り出します。心臓をDPBSで洗浄し、新しい10 centimeterのペトリ皿に移します。摘出した心臓が入ったペトリ皿を組織培養フード内に移動させ、以下の手順では無菌操作に従ってください。まず、抗生物質を含む滅菌済みDPBSで心臓を3回洗浄します。心臓を60 mmの培養皿に入れ、0.5%トリプシン溶液を6〜8 mL加えます。次に、心臓を細かく切断し、37 °Cで30分間インキュベートします。インキュベーション終了後、皿の中の溶液を滅菌済みの10 mLコニカルチューブに回収します。10 mLの滅菌ピペットを用い、迅速かつ穏やかに溶液を30〜50回ピペッティングし、得られた懸濁液を40 µmのセルストレーナーでろ過して、新しい清潔な50 mLコニカルチューブに回収します。遠心分離後、上清を穏やかに吸引除去し、残ったペレットを6〜8 mLの滅菌DPBSで再懸濁します。この工程をさらに2回繰り返します。遠心分離後の3回目の洗浄の後、洗浄液を注意深く排液または吸引し、ペレットを6 mLの添加物入り培地で再懸濁します。次に、再懸濁液を滅菌転送ピペットで吸い上げ、細胞を35 mmディッシュに移します。一晩のインキュベーション後、新生マウス3匹から単離した心筋細胞を回収し、未接着細胞とともに培地を吸引除去します。その後、プレートをDPBSで1回洗浄し、新鮮な培地を加えて培地を交換します。新生児または胎児の心臓から単離した細胞は、2日ごとの継代により最大3週間まで培養を維持できますが、成体心臓から単離した細胞は最大10日までとなります。成体マウスの心臓からメラノサイト様細胞を単離するには、まず、組織培養フード内で、抗生物質を含む滅菌DPBSを用いて摘出した心臓を洗浄します。湾曲ピンセットで心臓を軽く絞り、残存血液を除去した後、再びDPBSで心臓をすすぎます。次に、心臓から心房および房室環を除去し、切り出した組織検体を35 millimeterのディッシュに入れます。曲剪とピンセットを用いて、心臓を細かく切断します。0.5%trips in溶液を6～8 milliliters加え、37 degrees Celsiusで45～60分間インキュベートします。インキュベーション後、前述の手順を繰り返し、成体心臓細胞の懸濁液を作成し、以前と同様にプレートに播種します。この例では、両方のパネルにおいて白い矢印が心臓メラノサイトを示しています。蛍光マーカーの助けがなければ、心臓メラノサイトを特定し、ディッシュに付着している心房筋細胞と区別することは困難であることに注意してください。水色の矢印頭は、新生マウス心臓から単離された健康な心臓メラノサイトを示すこの図において、ディッシュに十分に付着していない心房細胞を指しています。それらは広範な樹状突起を発達させており、皮膚メラノサイトに酷似しています。この手法を習得し、適切に実施すれば、数時間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、心臓から生存可能なメラノサイト細胞を単離する方法について十分に理解できるはずです。これにより、生理学的および分子生物学的解析に適した状態になります。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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