Name: 人間の腸粘膜の外植片の文化と偏刺激する新規な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学ぶ人間腸粘膜外植片の培養と偏刺激法。組織極性を保持しアピカル側から刺激を加え、24〜36時間の生存が可能。免疫組織化学とサイトカインプロファイリングで免疫応答を解析し、腸管免疫学の理解を深める。

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我々は酸素室を提供するための優れた技術サポートと博士はアントニオ·ディ·サバティーノのためエリカMiletiに感謝します。 資金調達 ：MRへとFondazione Cariploとマリーキュリー国際トレーニングモビリティネットワーク（クロストーク、グラント契約番号：21553から2）による支援へ：この作品は、第7回EUフレームワークプログラム（Dendroworld IBDase、ERC）からの補助金によって支えられてKT。

1。入手とティッシュの準備<ol><li>組織（健康またはIBD粘膜）が手術中に得られる。一度試料を4℃または氷上でペニシリン/ストレプトマイシンを補充したのCa + + / Mg + +を含まフリーHBSSバッファにそれを維持、できるだけ早く研究室に転送を切除されています。 </li></ol> *試料の大きさは、組織の可用性に依存します。得られた組織の一部は、診断のために必要とされておらず、健康でIBDの被験者間で大きく異なることがあります何厳密です。健康な組織は、大腸癌の手術を受けた患者から切除されています。 <ol start="2"><li>そっとティッシュを洗って、すべての腸間膜の材料でそれをきれいに。ペトリ皿（必ずしも漬せず）内にHBSSバッファで組織を維持しながら、滅菌ハサミとピンセットを用いて粘膜から粘膜層を分離する。できるだけ少ないようにピンセットで粘膜表面をタッチします。 </li><li>少なくとも1 cがストライプ状に粘膜をカットメートル幅とできるだけ長く。あなたは食品を切断されたかのように多く、2滅菌メスを使用してください。 </li><li> HBSSに優しくクリーンな粘膜を洗浄し、上向きに直面している頂端側をシャーレの上に広げる。 </li></ol> 2。ティッシュの取り付け<ol><li>新鮮な培地（tisDMEM）を準備。 DMEMはグルタミン（2 mM）をとNaPyr（1mMの）を補充し使用し、FBS - Naは15％を追加（ウシ胎児血清 - 北米）、1％ITS-Xおよび使用時の200 ngの/ mlのEGF。 </li><li> FBS-ナ（金属グリッドが完全に水没されるように約30mlを使用してください）​​と水没金属グリッドの残りの部分と10センチメートルシャーレを埋める。プレートを開いたままにし、そのタップのプラスチック製のシリンダーをサポートしています。 </li></ol> *金属グリッドは、鉄で作られている。メッシュは0.5mmの辺を有する正方形である。 <ol start="3"><li> 10または20μlのピペットを用いて外科的接着剤の3μLを取る。 fは、それを保持しながら、プラスチックシリンダーの境界のいずれかに慎重にそれを適用します鉗子でIRM。 </li><li>静かにできるだけ近いストリップの境界のいずれかに、粘膜の頂端側にシリンダーを配置。 </li><li>しっかりと組織上のシリンダーを接続するために接着剤の時間を与えるために、センターウェル器官培養プレートを準備：よく中央に培地850μL-1ミリリットルを分注し、ウェルプレートの中央の端に金属グリッドをサポートしています。 </li><li>前のように2つの滅菌メスを使用してシリンダーの境界線から余分な組織を切り取る。 </li><li>優しく添付組織とシリンダーを持ち上げ、プレートの中央に金属グリッドに基底側に置く。 </li></ol> 3。刺激<ol><li>お好みの濃度でお好みの刺激を使用してください。 </li><li>ピペットチップでシリンダや粘膜表面を乱すことなく、プラスチックシリンダーの中心に適切な音量を適用します。選択したボリュームが均一にシリンダ内表面を覆っていることを確認してください。でdicatedボリューム： 大型プラスチックシリンダー：200μlの ミディアムプラスチックシリンダー：100μlの 小さなプラスチック製のシリンダー：50μlの</li><li>アップ従来のインキュベーター内で3時間までインキュベートする。 </li></ol> *あなたが長い時点インキュベートしたい場合は、（3.5を参照）を使用すると、刺激のはるかに小さい音量（10〜20μL）を使用していることを確認し、直接、1気圧の圧力では100％O 2雰囲気中で組織を配置。 <ol start="4"><li>頂端面上の媒体の厚い層がガス交換ができない場合、組織が​​2 O十分に取得していないので、組織の先端面からの刺激と培地を取り、新鮮な培地と交換しないでください。 プレートをカバーしています。 </li><li> 1気圧の圧力では100％O 2雰囲気中で組織を置きます。 </li></ol> 4。収穫<ol><li>総培養時間（±2.5時間）の24時間後、注意深く番目からシリンダーを取り外すメス優しくこするグルーオフの助けを借りて、電子ティッシュ、それは希望の解析（RNAの精製および遺伝子発現プロファイリングやタンパク質精製およびウェスタンブロットアッセイのための液体窒素中で免疫組織化学、および/または免疫蛍光アッセイの修正、またはスナップ凍結に応じて保管）。 </li><li>サイトカイン分泌プロファイリングのための基底培地を収穫。ペレット破片〜7分間8,000 rpmで遠心分離し、エッペンドルフチュー​​ブ（あるいはアリコート）で上清を転送し、直ちに-20℃で保存し</li></ol> *あなたが長い上清を維持したい場合には、-80℃で保管し℃まで

<ol><li>Schuller, S., Lucas, M., Kaper, J. B., Giron, J. A., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ex+vivo+response+of+human+intestinal+mucosa+to+enteropathogenic+Escherichia+coli+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ex vivo response of human intestinal mucosa to enteropathogenic Escherichia coli infection.</a> Cell. Microbiol. 11, 521-530 (2009).</li>
<li>Tsilingiri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+and+postbiotic+activity+in+health+and+disease%3A+comparison+on+a+novel+polarised+ex-vivo+organ+culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Probiotic and postbiotic activity in health and disease: comparison on a novel polarised ex-vivo organ culture model.</a> Gut. , (2012).</li>
<li>Tsilingiri, K., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Should+probiotics+be+tested+on+ex+vivo+organ+culture+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Should probiotics be tested on ex vivo organ culture models?</a> Gut Microbes. , Manuscript in preparation (2012).</li>
<li>Mileti, E., Matteoli, G., Iliev, I. D., Rescigno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+immunomodulatory+properties+of+three+probiotic+strains+of+Lactobacilli+using+complex+culture+systems%3A+prediction+for+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of the immunomodulatory properties of three probiotic strains of Lactobacilli using complex culture systems: prediction for in vivo efficacy.</a> PLoS One. 4, e7056(2009).</li>
<li>Cencic, A., Langerholc, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cell+models+of+the+gut+and+their+applications+in+food+microbiology--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Food+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Functional cell models of the gut and their applications in food microbiology--a review.</a> Int. J. Food Microbiol. 141, Suppl 1. S4-S14 (2010).</li>
<li>te Velde, A. A., Verstege, M. A., Hommes, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+current+practice+in+murine+TNBS-induced+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm.+Bowel+Dis%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the current practice in murine TNBS-induced colitis.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 995-999 (2006).</li>
<li>Senior, P. V., Pritchett, C. J., Sunter, J. P., Appleton, D. R., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crypt+regeneration+in+adult+human+colonic+mucosa+during+prolonged+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Crypt regeneration in adult human colonic mucosa during prolonged organ culture.</a> J. Anat. 134, 459-469 (1982).</li>
<li>Browning, T. H., Trier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+culture+of+mucosal+biopsies+of+human+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Organ culture of mucosal biopsies of human small intestine.</a> J. Clin. Invest. 48, 1423-1432 (1969).</li>
<li>Besselink, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+prophylaxis+in+predicted+severe+acute+pancreatitis%3A+a+randomised%2C+double-blind%2C+placebo-controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Probiotic prophylaxis in predicted severe acute pancreatitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial.</a> Lancet. 371, 651-659 (2008).</li>
<li>Lakhdari, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+NF-kappaB+modulation+capabilities+within+human+intestinal+commensal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Identification of NF-kappaB modulation capabilities within human intestinal commensal bacteria.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2011, 282356(2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

ヒト腸粘膜の治療が正当に試験することができるれた生理学的に関連するモデルの必要性が強調されている長い。多くの研究者がその目的のためにこれまで使用されるセル5及び6マウスモデルの両方で潜在的なアーティファクトや欠陥を同定した。有望な前臨床データは、多くの場合、取得されていても実際、これらはほとんど重要な臨床的利益のために翻訳しません。 この作品に記載されている方法は、偏光方式で人間の腸粘膜植の文化と刺激のための既存のプロトコル7、8、比較的シンプルでありながら効果的かつ斬新な適応を提示します。 このモデルでは、診療所にどのような種類の潜在的な処置を取る前に有効な前臨床データを生成するための優れた補完的なアプローチを提供することができます。このように、不幸な臨床転帰9は、潜在的に避けることができると研究者たちは、より可能性安全に急性の炎症状態の処理のためにクリニックに治療を推進しています。 <p class="jove_content"...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;試薬&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>10X HBSS</td><td>Eurocalne</td><td>ECM4006XL</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Lonza</td><td>DE17602E</td><td></td></tr><tr><td>ジェンタマイシン</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12614</td><td></td></tr><tr><td>FBS-Na</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>100X ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Tebu-bio</td><td>100-15</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Lonza</td><td>BE17605E</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NaPyr</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;器具・材料&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>クローニングシリンダー 6x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-00608</td><td></td></tr><tr><td>クローニングシリンダー 8x8 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-0080</td><td></td></tr><tr><td>クローニングシリンダー 10x10 mm</td><td>BellCo</td><td>2090-01010</td><td></td></tr><tr><td>メタルグリッド</td><td>自製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>センターウェル器官培養プレート</td><td>BD Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>外科用接着剤 (Vetbond)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>酸素ジャー</td><td>自製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸素タンク</td><td>Air Liquid Sanit&amp;#224;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

人間の腸粘膜の外植片の文化と偏刺激する新規な方法

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

いくつかのモデルは、現在現実的に相互作用の様々な場所を取る複雑な人間の腸内の微小環境をシミュレートするために存在します。誤って食物と一緒に摂取した病原性微生物に対して効果的な免疫応答をマウントすると同時に、彼らは食物抗原に対する全体の免疫応答誘導耐性を形作るように適切な恒常性を直接、これらの相互作用に依存する。 腸の恒常性は粘液のアタッチメント/劣化を規制する微生物（食品関連の有益な細菌株を含む）とホストの間の様々な複雑な相互作用を介しても保存され、上皮バリアによって抗菌ペプチドの産生、および &quot;教育&quot;集団 &#39;ユニーク、腸常駐リンパ系細胞の免疫寛容や免疫表現型を制御する&#39;を上皮細胞。これらの相互作用は、in vitroアッセイを再現するこれまでのところ非常に困難であった培養された細胞系または末梢血単核細胞のいずれかを使用して。また、マウスモデルは、ヒトの腸に関して腸粘膜（粘液層の組織、共生細菌のコミュニティ）の構成成分で大きく異なる。したがって、このような過敏性腸症候群、炎症性腸疾患または結腸直腸癌などの重要なストレス関連または病理学的状態のために診療所に持ち込まれる治療の様々な研究が行うことが困難であった。 これらの問題に対処するために、我々は我々が分極方法で、ホストの細菌叢と免疫応答によりその場コンディショニングで自分を維持する人間の腸粘膜の外植片を刺激することができた新規のシステムを開発しました。偏尖刺激の結果のために非常に重要である免疫応答を誘発した。これを繰り返し、それらが腸エピの先端面をバイパスするときに、同じ刺激​​が全く異なる応答を生成できることが示されている乳房、免疫原性への寛容原性の表現型をスイッチング領域に不要な過剰な炎症を引き起こし、基底外側上皮細胞を刺激または粘膜固有層コンポーネントと直接接触する。 私たちは、接着することで、プロトコルに記載されるように粘膜の頂端面上に区切られた刺激の面積洞窟シリンダーを分極刺激を達成しました。我々は他の人、三つの異なる乳酸菌株の差の影響の中で、検討するために、このモデルを使用していました。我々はこのモデルシステムは、健康と病気の条件でプロバイオティクスの免疫調節特性を評価することは非常に強力であることを示している。

私たちは、組織の健康を維持し、少なくとも24時間、文化の中で、健康でIBD人間の腸粘膜を維持することに成功しました。組織は、従来のインキュベータで24時間（ 図2）が生存しなかったとして、培養時間の大部分（全体の少なくとも85％）は、O 2で行われた場合、以前の観測値1によれば、これは可能であった。また、外植片の異なる応答を刺激（頂端対側底）と刺激2,3の免疫原性の極性に応じて、このモデルで観察することができることを示している。 このプロトコルを使用して、我々は別のプロバイオティック株は、組織の一部に異なる応答を誘発できることを示す。 ラクトバチルス·プランタラムNCIMB8826は、健康な組織に対する驚くべきことに、免疫原性であることが判明した。他の二つの乳酸菌株に反して、それはにリンパ系細胞の遊走を誘導しなかっただけで<html>病棟粘膜の最表面が、それはまた、大幅にこの移行、CCL4ならびにIL-1bは、伝統的に炎症誘発性の活性に関連するサイ...

私たちは、少なくとも24時間以上の刺激の様々なタイプに対応しての文化やモニタリングにおけるヒト腸粘膜の維持のための新規な方法をご紹介します。我々の方法では、組織の極性が尖経路で生理的刺激を可能にし、維持されている。

多様な相互作用が行われる複雑なヒト腸管の微小環境を現実的にシミュレートできるモデルは、現在ほとんど存在しません。適切な...

本実験の全体的な目的は、ヒト腸粘膜の刺激におけるin vivoの状況を模倣することです。これは、刺激物が基底側（basolateral side）に接触するのを防ぐため、組織の頂端側（apical side）にケーブシリンダーを接着させることで達成されます。次に、刺激を適用し、それによって誘発された免疫応答の解析を行います。次に、組織を24から36時間生存させるため、組織の頂端側から刺激を除去します。得られた結果から、免疫組織化学データ、サイトカイン分泌、プロファイル解析などの指標に基づき、さまざまなプロバイオティクス株の異なる影響を示すことができます。ASICチャンバーなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、最大20の条件を同時に解析できることです。これにより、培養時間を最大36時間まで延長することが可能となり、DNA/RNA解析、免疫組織化学染色、サイトカイン分泌などのさまざまな読み出し解析に十分な材料を確保できます。この手法はプロバイオティクス分野に知見をもたらすだけでなく、他の技術や、生物学的製剤、抗炎症薬などの他の免疫調節因子の効果を研究するためにも利用可能です。健康な個人または炎症性腸疾患患者から、手術時に腸粘膜組織を採取する必要があります。検体を摘出した後、速やかにラボへ搬送し、ペニシリン・ストレプトマイシン（pen strep）を含むHBSS中で冷却状態で保持します。次に、組織をバッファーで洗浄し、腸間膜組織を除去します。続いて、組織をHBSSバッファーに浸したまま、滅菌済みのハサミとピンセットを用いて、粘膜層を粘膜下層から分離します。ペトリ皿において、組織を完全に浸漬させておく必要はありませんが、ピンセットで粘膜表面に触れる回数はできるだけ少なくしてください。次に、2本の滅菌メスを使用して、食品を切るように、粘膜を幅1cm以上、長さは可能な限り長く切り出します。切り出した後、カルシウムおよびマグネシウムフリーのHBSSを用いて、粘膜を優しく洗浄し、清浄にします。最後に、粘膜ストリップをペトリ皿の上に、頂端側を上にして広げます。まず、新鮮なTIS DMEMを準備します。次に、10 centimeterのペトリ皿に約30 millilitersのF-B-S-N-Aを満たし、そこに鉄製グリッドを完全に浸します。プレートを開けたままにし、プラスチックシリンダーをプレート上に配置します。カバーをかけます。次に、3 µLの外科用接着剤をピペットで吸い取り、ピンセットでプラスチックシリンダーをしっかりと固定しながら、シリンダーの縁の一箇所に注意深く接着剤を塗布します。続いて、接着剤が乾くまでの間に、シリンダーを粘膜の尖端側に、ストリップの縁の可能な限り近くにゆっくりと設置します。組織プレートの中央ウェルに850〜1000 µLの培地を分注し、プレート中央の縁にアイロングリッドを設置します。2本のメスを用いて、シリンダーの境界から余分な組織を切り取り、除去します。次に、組織が付着したシリンダーを慎重に持ち上げ、組織の基底側をプレート中央のアイロングリッド上に配置します。次に、組織の刺激を行います。目的の刺激物質を、所定の濃度でプラスチックシリンダーの中央に適用します。ピペットチップでシリンダーや粘膜表面を乱さないようにし、シリンダー内部の表面を均一に覆ってください。次に、組織を最大3時間インキュベートします。刺激溶液の量を少なめにすれば、3時間を超えるインキュベーションも可能です。インキュベーション後、組織の頂端面から刺激物質を除去しますが、新鮮な培地で置換しないでください。培地を加えると組織が窒息してしまいます。次に、酸素ジャ―を1気圧の100%酸素で満たし、24時間培養します。酸素タンクを取り扱う際は常に注意し、使用後は必ず適切に閉じてください。24時間の刺激培養後、メスを用いて接着剤をそっとこそげ落とし、組織からシリンダーを慎重に取り出します。その後、IHC（免疫組織化学）または免疫蛍光アッセイを行う場合は、組織を固定します。遺伝子発現またはタンパク質分析を行う場合は、液体窒素で組織を急冷してください。次に、サイトカイン分泌プロファイリングのため、基底側側方培地を回収します。その後、培地を遠心管に移し、概説したプロトコルに従ってデブリをペレット化します。組織の健全性を維持しながら、健康なヒトおよびIBDヒト腸粘膜を24時間以上培養しました。これは、培養時間の少なくとも85%が酸素豊富な環境で行われた場合にのみ可能でした。従来の方法で培養された粘膜では、同様の結果は得られませんでした。その後、健全な組織に炎症性侵襲性サルモネラを刺激として加えました。接種から2時間後、対照群と比較して上皮の上層の破壊がすでに認められました。24時間後には、変性はかなり広範囲に及びました。発表済みの結果を伴う実験的応用の詳細な検討については、執筆中の原稿にて記載します。この手法により、消化器病学分野の研究者が胃腸管における宿主と微生物の相互作用を研究するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、ヒト腸粘膜を培養し、局所的に刺激する方法について深く理解できるはずです。ヒト試料の取り扱いは極めて危険を伴う可能性があるため、この手順を行う際は常に必要な予防措置を講じることを忘れないでください。

a-novel-method-for-culture-polarized-stimulation-human-intestinal

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

出典:J. G. 他病原体、共生体、宿主腸上皮間の相互作用を研究するためのヒトコロノイドモノレイヤー。J. Vis.

宿主と病原体の相互作用を研究するためのバリア機能を持つヒトコロノイド単層の生成

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私たちは、小さな腸の陰窩からヒトの腸を、手術組織と生検の両方から採取した結腸の陰窩からコロノイドを確立する方法を説明しています。この方法論の記事では、ヒトエンテロイドとコロノイドの成長と維持を成功させるために不可欠な培養モダリティを紹介します。...

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宿主と細菌の相互作用を研究するための侵入膜抽出物または基底膜抽出物を用いた二次元オルガノイド培養

学ぶ人間腸粘膜外植片の培養と偏刺激法。組織極性を保持しアピカル側から刺激を加え、24〜36時間の生存が可能。免疫組織化学とサイトカインプロファイリングで免疫応答を解析し、腸管免疫学の理解を深める。

人間の腸粘膜の外植片の文化と偏刺激する新規な方法

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