人間の腸粘膜の外植片の文化と偏刺激する新規な方法

本実験の全体的な目的は、ヒト腸粘膜の刺激におけるin vivoの状況を模倣することです。これは、刺激物が基底側（basolateral side）に接触するのを防ぐため、組織の頂端側（apical side）にケーブシリンダーを接着させることで達成されます。次に、刺激を適用し、それによって誘発された免疫応答の解析を行います。

次に、組織を24から36時間生存させるため、組織の頂端側から刺激を除去します。得られた結果から、免疫組織化学データ、サイトカイン分泌、プロファイル解析などの指標に基づき、さまざまなプロバイオティクス株の異なる影響を示すことができます。ASICチャンバーなどの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、最大20の条件を同時に解析できることです。

これにより、培養時間を最大36時間まで延長することが可能となり、DNA/RNA解析、免疫組織化学染色、サイトカイン分泌などのさまざまな読み出し解析に十分な材料を確保できます。この手法はプロバイオティクス分野に知見をもたらすだけでなく、他の技術や、生物学的製剤、抗炎症薬などの他の免疫調節因子の効果を研究するためにも利用可能です。健康な個人または炎症性腸疾患患者から、手術時に腸粘膜組織を採取する必要があります。

検体を摘出した後、速やかにラボへ搬送し、ペニシリン・ストレプトマイシン（pen strep）を含むHBSS中で冷却状態で保持します。次に、組織をバッファーで洗浄し、腸間膜組織を除去します。続いて、組織をHBSSバッファーに浸したまま、滅菌済みのハサミとピンセットを用いて、粘膜層を粘膜下層から分離します。

ペトリ皿において、組織を完全に浸漬させておく必要はありませんが、ピンセットで粘膜表面に触れる回数はできるだけ少なくしてください。次に、2本の滅菌メスを使用して、食品を切るように、粘膜を幅1cm以上、長さは可能な限り長く切り出します。切り出した後、カルシウムおよびマグネシウムフリーのHBSSを用いて、粘膜を優しく洗浄し、清浄にします。

最後に、粘膜ストリップをペトリ皿の上に、頂端側を上にして広げます。まず、新鮮なTIS DMEMを準備します。次に、10 centimeterのペトリ皿に約30 millilitersのF-B-S-N-Aを満たし、そこに鉄製グリッドを完全に浸します。

プレートを開けたままにし、プラスチックシリンダーをプレート上に配置します。カバーをかけます。次に、3 µLの外科用接着剤をピペットで吸い取り、ピンセットでプラスチックシリンダーをしっかりと固定しながら、シリンダーの縁の一箇所に注意深く接着剤を塗布します。続いて、接着剤が乾くまでの間に、シリンダーを粘膜の尖端側に、ストリップの縁の可能な限り近くにゆっくりと設置します。

組織プレートの中央ウェルに850〜1000 µLの培地を分注し、プレート中央の縁にアイロングリッドを設置します。2本のメスを用いて、シリンダーの境界から余分な組織を切り取り、除去します。次に、組織が付着したシリンダーを慎重に持ち上げ、組織の基底側をプレート中央のアイロングリッド上に配置します。

次に、組織の刺激を行います。目的の刺激物質を、所定の濃度でプラスチックシリンダーの中央に適用します。ピペットチップでシリンダーや粘膜表面を乱さないようにし、シリンダー内部の表面を均一に覆ってください。

次に、組織を最大3時間インキュベートします。刺激溶液の量を少なめにすれば、3時間を超えるインキュベーションも可能です。インキュベーション後、組織の頂端面から刺激物質を除去しますが、新鮮な培地で置換しないでください。

培地を加えると組織が窒息してしまいます。次に、酸素ジャ―を1気圧の100%酸素で満たし、24時間培養します。酸素タンクを取り扱う際は常に注意し、使用後は必ず適切に閉じてください。

24時間の刺激培養後、メスを用いて接着剤をそっとこそげ落とし、組織からシリンダーを慎重に取り出します。その後、IHC（免疫組織化学）または免疫蛍光アッセイを行う場合は、組織を固定します。遺伝子発現またはタンパク質分析を行う場合は、液体窒素で組織を急冷してください。

次に、サイトカイン分泌プロファイリングのため、基底側側方培地を回収します。その後、培地を遠心管に移し、概説したプロトコルに従ってデブリをペレット化します。組織の健全性を維持しながら、健康なヒトおよびIBDヒト腸粘膜を24時間以上培養しました。

これは、培養時間の少なくとも85%が酸素豊富な環境で行われた場合にのみ可能でした。従来の方法で培養された粘膜では、同様の結果は得られませんでした。その後、健全な組織に炎症性侵襲性サルモネラを刺激として加えました。

接種から2時間後、対照群と比較して上皮の上層の破壊がすでに認められました。24時間後には、変性はかなり広範囲に及びました。発表済みの結果を伴う実験的応用の詳細な検討については、執筆中の原稿にて記載します。

この手法により、消化器病学分野の研究者が胃腸管における宿主と微生物の相互作用を研究するための道が開かれました。このビデオを視聴することで、ヒト腸粘膜を培養し、局所的に刺激する方法について深く理解できるはずです。ヒト試料の取り扱いは極めて危険を伴う可能性があるため、この手順を行う際は常に必要な予防措置を講じることを忘れないでください。