Name: 上の可視光およびゲンタマイシンの相乗効果 Pseudomona緑膿菌微生物 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-02T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 学ぶ可視光とゲンタマイシンの相乗効果によるPseudomonas aeruginosaの抗菌治療法。この手法は抗生物質耐性菌に対する新たな治療戦略として有望であり、細菌生存率を8桁減少させる効果が確認された。

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1。細菌培養物<ol><li>グラム陰性P.緑膿菌株PAO1は、18時間37℃でルリアブロス（LB）中で増殖させた。 </li><li>細胞の培養物を5分間、7,500 rpmで（毎分ラウンド）で遠心分離し、上清を除去した。 </li><li>細菌を、10％LBに再懸濁し、培養が定常期を再入力することを可能にする別の2時間のために再成長させた。 </li><li>細菌懸濁液は、2つのグループに分けた：最初のグループ（2本）のない抗生物質我々はゲンタマイシン抗生物質（50μgの/ ml）を添加番目のグループに加えた。 </li></ol> 2。コロニー形成単位の判定（CFU） <ol><li>細胞生存率を決定するために、20μlのサンプルを、24時間の時間枠内でおよそ2時間の実験から採取した。サンプルの連続希釈が行われ、めっきさLB寒天プレート上、37℃で一晩インキュベートした。 </li><li>プラットフォームごとのCFUを各治療のため電子を測定し、比較する期間、様々な処置の間で行われた。式で説明したようCFUにおける対数減少を算出した。 （1）： ログイン削減= LOGU-LogC [CFU / mlの] ここで、Uは、各時点で単位値をコロニー形成であり、CFUに等しいCFU / mlの単位中にコロニー形成単位である。 CFU / mlの=（コロニーのx希釈係数の数）/（体積接種） 及びCは、開始時にコントロールサンプルにおいて見出さCFUである。 Uは、測定時点で要因を形成するコロニーを指定することに注意してください。 </li><li>それらのそれぞれの中の細菌の濃度が10分の1に減少しながら希釈係数は、希釈液の数である。接種量は常に200マイクロリットルであり、それは、我々の試験管のサイズに関係している。 </li></ol>したがって、ビューの濃度点を要約する、ゲンタマイシン抗生物質、50μgの/ mlの濃度であった。の終わりまで、細菌に関してプロセスは、我々は全体の8希釈していた。各希釈は10倍であり、それは、200μlにチューブ内で行われていた。出発点は、200μlのチューブに入れたサンプル20μlのだった（その結果、初期濃度は20/200C 0だったC 0と= 0.1C0サンプルを20μlの初期濃度である）、最終濃度が8減少した8希釈に起因桁違い。 3。照明<ol><li> CWのNd：YAGレーザー（532 nmおよび200 mWの平均光パワーの波長）の光、50％/ 50％ビームスプリッタを使用して二つの光路に分割された。ビーム径は約10mmであった。露出時間は24時間であった。 </li><li> QスイッチパルスNd：YAGレーザー（波長532nm、300mWの2.5 MWの光ピークパワーの平均電力）が、光の50％/ 50％ビームスプリッタを用いて2つの経路に分割された。スポット径は6であった。 Qスイッチレーザのパルス幅は6ナノ秒であり、繰り返しレートが15Hzのであった。ザ平均電力密度は106 MW / cm 2であった、ピークパワー密度は8.83キロワット/ mm 2であった。露出時間は24時間であった。 </li></ol>細菌懸濁液は、照射中に攪拌し、それが細菌の増殖（全てのチューブに細菌が成長できるようにするルリアのブロス培地があった）のために適切な培養条件下で維持されたことに注意してください。

<ol><li>Feuerstein, O., Persman, N., Weiss, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxic+Effect+of+Visible+Light+on+Porphyromonas+gingivalis+and+Fusobacterium+nucleatum%3A+An+In+Vitro+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Phototoxic Effect of Visible Light on Porphyromonas gingivalis and Fusobacterium nucleatum: An In Vitro Study.</a> Photochemistry and Photobiology. 80, 412-415 (2004).</li>
<li>Enwemeka, C. S., Williams, D., Enwemeka, S. K., Hollosi, S., Yens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+470-nm+light+kills+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+%28MRSA%29+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">Blue 470-nm light kills methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in vitro.</a> Photomed. Laser Surg. 27, 221-226 (2009).</li>
<li>Guffey, J. S., Wilborn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+bactericidal+effects+of+405-nm+and+470-nm%5BTitle%5D)+AND+%22Photomed.+Laser+Surg%22%5BJournal%5D)">In vitro bactericidal effects of 405-nm and 470-nm.</a> Photomed. Laser Surg. 24, 684-688 (2006).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Friedman, H., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Staphylococcus+aureus+strains+to+broadband+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Staphylococcus aureus strains to broadband visible light.</a> Photochem. Photobiol. 85, 255-260 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+possible+Mechanism+for+visible+light+induced+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">A possible Mechanism for visible light induced wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 40, 509-514 (2008).</li>
<li>Lipovsky, A., Nitzan, Y., Gedanken, A., Lubart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visible+light-induced+killing+of+bacteria+as+a+function+of+wavelength%3A+Implication+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Visible light-induced killing of bacteria as a function of wavelength: Implication for wound healing.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 42, 467-472 (2010).</li>
<li>Feuerstein, O., Ginsburg, I., Dayan, E., Veler, D., Weiss, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Visible+Light+Phototoxicity+on+Porphyromonas+gingiwalis+and+Fusobacferium+nucleaturn%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Visible Light Phototoxicity on Porphyromonas gingiwalis and Fusobacferium nucleaturn.</a> Photochemistry and Photobiology. 81, 1186-1189 (2005).</li>
<li>Nussbaum, E. L., Lilge, L., Mazzulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+630-%2C+660-%2C+810-%2C+and+905-nm+laser+irradiation+delivering+radiant+exposure+of+1-50+J%2Fcm2+on+three+species+of+bacteria+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Laser+Med.+Surg%22%5BJournal%5D)">Effects of 630-, 660-, 810-, and 905-nm laser irradiation delivering radiant exposure of 1-50 J/cm2 on three species of bacteria in vitro.</a> J. Clin. Laser Med. Surg. 20, 325-333 (2002).</li>
<li>Dadras, S., Mohajerani, E., Eftekhar, F., Hosseini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+Photoresponses+of+Staphylococcus+aureus+and+Pseudomonas+aeruginosa+to+514%2C+532%2C+and+633+nm+Low+Level+Lasers+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Different Photoresponses of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa to 514, 532, and 633 nm Low Level Lasers In Vitro.</a> Current Microbiology. 53, 282-286 (2006).</li>
<li>Stover, C. K., Pham, X. Q., Erwin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+genome+sequence+of+Pseudomonas+aeruginosa+PAO1%2C+an+opportunistic+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Complete genome sequence of Pseudomonas aeruginosa PAO1, an opportunistic pathogen.</a> Nature. 406, 952-964 (2000).</li>
<li>Hamblin, M. R., Demidova, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+low+level+light+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+SPIE%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of low level light therapy.</a> Proc. SPIE. 6140, 1-12 (2006).</li>
<li>Krespi, Y. P., Stoodley, P., Hall-Stoodley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+disruption+of+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Laser disruption of biofilm.</a> Laryngoscope. 118, 1168-1173 (2008).</li>
<li>Reznick, Y., Banin, E., Lipovsky, A., Lubart, R., Zalevsky, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+laser+light+enhancement+of+susceptibility+of+bacteria+to+gentamycin+antibiotic%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Commun%22%5BJournal%5D)">Direct laser light enhancement of susceptibility of bacteria to gentamycin antibiotic.</a> Opt. Commun. 284, 5501-5507 (2011).</li>
</ol>

利害の衝突は宣言されていない。

光線療法は、治療多くの疾患のための有望なアプローチとして浮上し、近年では先進的な学際的研究分野となっています。この文脈において、可視領域の光の使用が広く研究されている。例えば、感染した創傷を殺菌のために、強い可視光にさらすことによって、より効果的に治癒することができることが見出された。このアプローチのための作用機構は、細菌を殺す11光誘起酸素ラジカルの誘発（ROS）を介してであることが証明された。 6以前の研究は、赤色および近赤外光によって誘導されるものよりも青色光を照射細菌においてROSはるかに高い金額を実証している。文学の中で最も証拠は青色光の殺菌効果に集中これはなぜ説明しています。 耐性菌と戦うために、レーザー光を使用するための別の最近の例はKrespにより証明された私ら 12。その研究のレーザで生成された衝撃波技術がバイオフィルムを根絶するために利用された。 YAGレーザや細い繊維、衝撃波効果を生じプラズマ形成を...

<table><tbody><tr><td>ローリア液体培地</td><td>Difco</td><td>241420</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td></td></tr><tr><td>バクトアガー</td><td>Difco</td><td>231710</td><td></td></tr></tbody></table>

上の可視光およびゲンタマイシンの相乗効果<em&gt; pseudomona緑膿菌</em&gt;微生物

The Synergistic Effect of Visible Light and Gentamycin on Pseudomona aeruginosa Microorganisms

最近では、可視光の殺菌効果に関するいくつかの出版物、それらのほとんどは、スペクトルのその青の部分を主張があった（400 NM-500 nm）の様々な病原体1-5を殺すために責任があります。青色光の光毒性効果は、光誘起反応性酸素種（ROS）主に青色領域4,6,7の光を吸収する内因性光感受性物質、細菌による形成の結果であることが示唆された。赤と近赤外8と同様に緑色の光9の殺菌効果の報告もあります。 本研究では、我々は我々が緑膿菌での高出力緑色（波長532nm）の連続（CW）とパルスQスイッチ（QS）光の影響を特徴づけるために許可された方法を開発した。この方法を用いて、我々はまた、細菌の生存に抗生物質治療（ゲンタマイシン）と組み合わせて緑色の光の効果を検討した。P.緑膿菌は、ACですommon noscomial日和見病原体は、様々な疾患を引き起こす。株は、様々な抗生物質に対してかなり耐性があり、多くの予測AcrB /メックス型RND排出システム10を多剤が含まれています。 この方法は、抗生物質、ゲンタマイシンを加えてとせずにQスイッチおよび/ ​​またはCWレーザに露出ルリアブロス（LB）培地中で増殖させ、（ 緑膿菌株 PAO1）自由生活固定相グラム陰性菌を利用した。細胞生存率は、異なる時点で測定した。得られた結果は、それだけでレーザー治療が唯一のPの生菌数は0.5 log減少をもたらした未処理の制御とそれだけでゲンタマイシン治療に比べて細胞の生存率を減少させなかった示した緑膿菌 。合成レーザおよびゲンタマイシン処理は、しかしながら、P.の相乗効果及び生存率をもたらし緑膿菌は、8ログの減少した。 提案手法では、さらに実装することができます同時に光で面積を照射しながら感染臓器に抗生物質溶液を注入することができる装置のようなカテーテルの開発を介しmented。

レーザーベースのセットアップを図1に概略的に示されている。第1実験条件は、CWのNd利用：とは200mWの平均光パワー：YAGレーザは、波長532nmの（YAGのNdの第2高調波）を有する。このビームは、各分割ビームが100mWでのパワーを持っていたこのような光の50％/ 50％ビームスプリッタを使用して二つの光路に分割された。ビーム径は約10mmであったため、電力密度は、約100mWの/ cm 2であった。露出時間は24時間であった。光力が相対的に高いが、それは試料の加熱を引き起こすほど高くない。 QスイッチパルスNdを利用した第二の実験条件：YAGレーザは532nmの（第二高調波）と6mmのスポット径の波長を有する。平均電力は300 mWで、2.5 MWの光ピークパワーだった。 Qスイッチレーザのパルス幅は6ナノ秒であり、繰り返しレートが15Hzのであった。このビームは、光使って2つの経路に分割されました50％/ 50％ビームスプリッタ。平均電力密度は約100mW / cm 2とし、ピークパワー密度...

我々は、抗生物質治療（ゲンタマイシン）と組み合わされて、連続またはパルス可視レーザーベースの治療を含むその発達生物医学装置の生存率の減少につながる統計的に有意な相乗効果で結果を表示する<em&gt; P.緑膿菌</em8ログが単独の抗生物質による治療と比較していることで&gt; PAO1、。

上の可視光およびゲンタマイシンの相乗効果<em&gt; Pseudomona緑膿菌</em&gt;微生物

近年、可視光の殺菌効果に関する論文が数多く発表されており、その多くはスペクトルの青色領域（400 nm〜500 nm...

本手順の全体的な目的は、溶液中のPseudomona aerogenに対するゲンタマイシンの有効性が、可視光によって増強されることを実験的に検証することである。まず、実験用の細菌培養物を増殖させ、次に、抗生物質処理の有無に合わせて細菌に光照射を行うことでこれを達成する。最後に、24時間にわたって培養物からサンプルを回収し、各時点における細胞培養内のコロニー形成単位を定量します。これにより、最終的に、光照射が抗生物質治療による細菌除去への感受性に及ぼす影響を評価することができます。光照射が抗生物質治療の効果を高めるため、この技術の意義は感染症のin vivo治療へと広がります。手順のデモンストレーションは、私の研究室の修士課程学生であるAnna Resnickが行います。まず、適切な培地を用いて目的の細菌培養物を増殖させます。ここでは、グラム陰性菌のP aerogen株PAO oneを、ルリア・ブロス中で37 °C、13時間培養しています。次に、細胞を室温、約3,145 Gsで5分間遠心分離します。その後、上清を除去し、細菌を10% Lauria brothで再懸濁させ、Lauria brothを用いて37 °Cでさらに2時間培養し、培養液を再び静止期に戻します。その後、細菌懸濁液を2つのグループに分け、そのうちの1つのグループにGentamycinを添加します。次に、それぞれの培養液をマグネチックスターラーの上に置き、スターラーを回転させます。続いて、連続波nd:YAGレーザー、またはQスイッチパルスnd:YAGレーザーを2つの光路に分割し、照射開始時に各培養液を照射できるようにします。対照群および抗生物質処理群から、24時間にわたって約2時間ごとに20 µLのサンプルを採取し始めてください。翌日、得られたサンプルを段階希釈します。例えば、本実験では、細菌を200 µLの接種量で10倍に8回希釈しました。次に、希釈液をルリアブロス寒天培地に塗布し、37 °Cで一晩インキュベートして、翌朝に回収します。各処理におけるプレートあたりのコロニー形成単位（CFU）数を算出し、次にここで示す方法でCFUのログ減少量を計算します。ここで、uは測定時点における正確なコロニー形成単位の値を示します。CFUはコロニー形成単位を、Cは開始時の対照サンプルで検出されたCFUを示します。さらに、1 mLあたりのCFUの単位は、（コロニー数 × 希釈倍率）÷ 接種量で算出されます。ここでは、レーザーを用いたセットアップの概略図を示します。連続波NDAレーザーまたはQスイッチレーザーが、光学的な50/50ビームスプリッターを用いて2つの経路に分割されます。両方の試料はスターラー上に配置されます。この画像は、同一条件下で両方のチューブを処理するために、レーザーを2本のチューブに分光させた実験装置を示しています。一方の培養液には抗生物質を投与し、もう一方は対照群として投与しません。その後、細菌を24時間レーザーに曝露させます。このグラフは、対照群である光照射なしの試料において、抗生物質処理の有無にかかわらず、連続波レーザー光またはQスイッチレーザーがp aerogenの増殖に及ぼす有効な照射効果をそれぞれ示したものである。培養液に抗生物質を添加したか否かにかかわらず、細胞生存率の低下は見られなかったことから、細菌がgentamicinに耐性を持っていることが示唆され、またレーザーのみによる処理も細胞増殖に影響を与えなかった。しかし、レーザーと抗生物質の両方で処理した培養液では、細菌の生存率は数桁低下した。最も顕著な効果は24時間後に測定され、連続波またはQスイッチレーザーのいずれかの組み合わせにより、抗生物質単独または光単独の対照群と比較して、細菌細胞の生存率が8桁減少しました。これらのデータは、抗生物質耐性菌の治療法となる解決策を示唆しています。したがって、この図の点は、細菌に感染した組織に挿入されたカテーテルを通じて、拡散レーザー照射と抗生物質治療の二重投与を促進するための光散乱点を示しています。532 nm付近の吸収スペクトルを示すこの最終的な図は、細菌株 p aerogenと抗生物質のgentamicinの両方がこの波長において透明であることを明確に示しており、この波長が併用療法の選択肢として有効であることを証明しています。提示された手法は、微生物学および医学分野の研究者が、この手法の有効性を、バイオフィルムや器官系に対しても探索するための道を開きました。Pseudomonas aerogen微生物の取り扱いは極めて危険である可能性があるため、本手順を実施する際は、常に適切な無菌操作を行い、滅菌された環境および設備を使用することを忘れないでください。

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上の可視光およびゲンタマイシンの相乗効果

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