Name: セラピーの脊髄配達のための外科テクニック：ゲッティンゲンミニブタの手順のデモンストレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶ ゲッティンゲンミニブタを用いた脊髄治療薬の外科的投与法。ラミネクトミーと硬膜切開による正確な髄内注射技術を習得し、神経外科における遺伝子・細胞治療の安全性と標的精度を向上させる方法を理解する。

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私たちは、獣医医療用動物資源スタッフのエモリー大学本部に感謝します。資金源が含まれます：ALS協会、国防総省、そしてNeuralstem、株式会社

1。動物使用本明細書に示さ手続きはエモリー大学機関動物実験委員会（IACUC）によって承認されている。約15〜20 kgの女性ゲッティンゲンのミニブタが使用されます。 2。麻酔動物は、手術の前に約12時間を絶食させる。動物の鎮静および麻酔導入は、筋肉内ケタミン（35 mg / kg）を、アセプロマジン（1.1 mg / kg）であり、アトロピン（0.04 mg / kg）のカクテルで構成されています。動物は、その後挿管し、酸素および1-3％イソフルラン麻酔で維持されます。この時点で、それぞれの動物の背中と頭部を剃毛されています。麻酔の深さは、獣医スタッフによって監視されています。 、すだれ状角膜と眼瞼反射神経だけでなく、心臓や呼吸数、パルスオキシメータ、直接/間接血圧、呼気終末二酸化炭素の測定、および筋緊張/侵害刺激に対する応答の有無は、深さを監視するために使用される<html>麻酔の。 3。ポジショニング動物は、手術室に連れて行かれ、ジャクソン脊椎手術台に患者の位置決めを模倣するように設計されたフレームのカスタムに腹臥位に配置されます。フレームは腹部と胸部とその結果として硬膜外静脈出血（ 図1）に圧力を最小限に抑えるため、腹部は無料垂れ下がらと、動物の胸と骨盤の下に置かれている調節可能なスリングを利用しています。フレームには、手順1の背骨の外部固定化を提供します。 また、動物は体温と体液管理や手術中に必要な薬物送達のためにカテーテルを挿入された辺縁耳静脈を維持するために加熱された再循環パッド上に配置されます。最後に、手術野は、アルコールとChlorhexadineまたはベタジン溶液と整形処理され、外科用ドレープは、手術フィールドに配置されます。 椎弓切除術LE &quot;&gt; 4。 約10〜15 cm商品皮膚切開が行われ、傍脊柱筋組織は、二国間で背骨をオフに解剖されています。次に、背マルチレベルの椎弓切除術が行われます。 3つの椎骨を覆うC3〜C5またはL2-L4セグメントのラミナと棘突起はrongeursと外科用ドリルを使用して除去される。 5。脊髄デリックの配置我々は、脊髄デリック脊髄2-5に（遺伝子細胞）療法の配信のために設計されたデバイスと呼びます。このデバイスの設計と進化に関する詳細な議論は、ライリーら 、2011に記載されています。4 患者へのデバイスの安全性を確保するために、経皮的ポストは主切開上下1センチメートル皮膚切開を介して配置され、主切開上下に薄板に取り付けられている。 次に、2の統合開創は、foに接続されている椎弓切除術を受けている背骨の領域を露出させるために切開部位の上下ウル皮の投稿。 6。硬膜オープニングウッドソン歯科用ツールおよび11ブレードの助けを借りて、2.5 cm商品切開は脊髄を露出し、硬膜を介して行われます。硬膜を4から0 Nurolon縫合糸を使用して軟膜層から反射と深い傍脊柱筋組織に固定されている。 手術のパテは、開口部の吻側および尾側の両極端に配置されます。これらは、脳脊髄液の流れへの部分的なバリアを提供し、また、脊髄に損傷を与えることなく、吸盤を配置する外科医のための安全なターゲットを提供する。ヒトでは、手術用顕微鏡の倍率で、軟膜表面は、この時点で解剖されています。技術的な制限があるため、この手順は必須または動物で現実的ではありません。 7。脊髄注射と追加注射用脊髄デリックの横方向の変位の注射の直前に、メチルプレドニゾロン（125mgを、IV）のボーラスが腫れ脊髄を防止するために与えられている。 この時点では、プラットフォームのレールシステムを装着し、サイドレールは、適切な長さに合わせて調整されます。ゴンドラです 2つのバーの上にトップロードが、Zドライブは、ユニバーサルジョイントにマウントされています。次に、ロードされたカニューレは、マイクロドライブに配置されます。マイクロインジェクションプラットフォーム上でユニバーサルジョイントを使用して、冠状および矢状角は脊髄注射はカニューレの配置をたどるの表面に直交する軌道を確保するために調整されます。針は背根入り口帯（DREZ）に応じて内側に配置されている。 DREZは3.5X外科ルーペの倍率で識別し、ポイントでコードの表面に直交する軌道上に貫通されている&lt;1ミリメートル内側。 ヒトでは、術前のMRIは、ベースラインアセスメントOを提供手術計画のためのf脊髄寸法。また、脊髄の厚さは、前角の目標深度を決定するために測定される。 懸濁液は、軟膜の接触から4ミリメートルの深さに注入される。ウルテムプラスチック製のフランジに、必要以上に深く進んでから針を防ぐために軟膜表面上のストッパーとして機能します。針の先端がターゲットで配置されると、硬い金属外側スリーブは柔軟性のあるチューブが露出したまま、プルアップされています。注入が完了すると、針がカニューレ噴射管アップセルの逆流を防止するためにさらに1分間場所に残されています。 ケアは若干マイクロドライブ側性またはrostro-尾のどちらかを調整することによって、表面の血管系を回避するように注意されています。浸透のサイトからいくつかの出血が発生することがあります。出血などが発生した場合、マイクロパテは出血穿刺部位の上に配置されており、吸引は、カニューレpenetrから血を吸い取るために、それらに適用されるationサイト​​とコードの蓄積を防ぐ。血液が凝固するためにこれが確実にできます。直接の圧力があるよう焼灼は回避される。 針を除去した後、定位固定装置は、脊髄の背側表面に見える血管を避けるために必要に応じて、2または4 mm以上で区切っrostro - 尾軸に沿って次の標的部位に再配置されます。与えられた研究で提案したように、このプロセスが何度も繰り返されます。 8。フローティングカニューレ細径のカスタム注入カニューレ、注射のために使用されます。カニューレは、可変長の30ゲージのフレキシブルシラスティックチューブに接続されている固定長の30ゲージベベル針で構成されています。遠位端がマイクロインジェクターポンプに接続されているハミルトンルアーロックが装備されています。近シラスティックチューブは24番ゲージの剛性アウターカニューレ内ensheathedされている注射針のフランジの近位端上の席。このフランジ両方席外側カニューレ、注射針の深さストップとして機能します。各注射のためには、治療上の懸濁液の適切なボリュームが1分あたり5μlの割合で校正済みM​​INJ-PDマイクロインジェクターポンプ（Tritechリサーチ社、ロサンゼルス、カリフォルニア州）を用いて注入する。 9。閉鎖すべての注射が行われた後、脊髄デリックを穏やかに除去され、切開は4層で閉鎖されています。硬膜防水ファッションで、4.0 Nurolonステッチを使用して閉じられます。 0 VICRYL縫合糸は深い筋層に使用されます。筋膜は、その後防水ファッションでも0 VICRYL縫合糸で閉じられます。真皮層は、最終的にランニングステッチで、2.0 VICRYLで閉じられます。皮膚縫合は3から0ナイロン縫合糸を使用して完了します。 10。回復と疼痛管理動物は2時間以下の麻酔回復のために抜管され、監視されています。次に、動物を個々のCに転送されます年齢や摂餌量、排便、排尿のためにと少なくとも1日1回監視した。 疼痛管理のために、経皮フェンタニルパッチ（75 mcgか）は、術後鎮痛の3日間、動物の背中にステイプルされています。また、ブプレノルフィン（0.05 mg / kgで、BID、IM）はまた、最大3日間、術後のために与えることができます。 11。その結果、代表アウトカム臨床的および行動観察は研究デザインによると終点まで術前に行われると、その後1〜7日目に記録し、毎週しています。行動データは、前述の6として神経学的罹患率を評価するために収集されます。感覚機能は、前面と後肢のつま先への機械的刺激に対する離脱応答の有無により評価される。 - ; 1 -後肢における知覚緊張、わずかメートル麻痺、動かない0：モータ関数はTarlovスコア（ 表1）を次のovement、2 - 後肢での動きが、座ったり立つことができ、3 - スタンドと歩行能力が、運動失調と短い期間、4 - 完全回復、正常な運動機能。 手順の安全性は、手術前のベースラインに戻るには、動物の能力によって決定されます。一過性神経障害は、主に動物の品種や手順（他のパラメータのうち、注射の回数）に応じていくつかのバリエーションで、術後1日目と7の間に解決する必要があります。永久的な罹患率は、動物が動物実験委員会、デフォルトのエンドポイント（ 図2）に達する時間によって解決されない持続的な神経学的欠損によって定義されます。

<ol><li>Usvald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+dosing+regimen+and+reproducibility+of+intraspinal+grafting+of+human+spinal+stem+cells+in+immunosuppressed+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Analysis of dosing regimen and reproducibility of intraspinal grafting of human spinal stem cells in immunosuppressed minipigs.</a> Cell Transplant. 19, 1103-1122 (2010).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+spinal+cord+therapeutics+delivery%3A+stabilized+platform+and+microelectrode+recording+guidance+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Stereotact.+Funct.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Targeted spinal cord therapeutics delivery: stabilized platform and microelectrode recording guidance validation.</a> Stereotact. Funct. Neurosurg. 86, 67-74 (2008).</li>
<li>Federici, T., Riley, J., Park, J., Bain, M., Boulis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+validation+of+a+stabilized+viral+vector+direct+injection+approach+to+the+cervical+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety validation of a stabilized viral vector direct injection approach to the cervical spinal cord.</a> Clin. Transl. Sci. 2, 165-167 (2009).</li>
<li>Riley, J. P., Raore, B., Taub, J. S., Federici, T., Boulis, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platform+and+Cannula+Design+Improvements+for+Spinal+Cord+Therapeutics+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Platform and Cannula Design Improvements for Spinal Cord Therapeutics Delivery.</a> Neurosurgery. 69, 147-154 (2011).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+spinal+cord+therapeutics+delivery%3A+preclinical+safety+validation+of+a+stabilized+microinjection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Cervical spinal cord therapeutics delivery: preclinical safety validation of a stabilized microinjection platform.</a> Neurosurgery. 65, 754-761 (2009).</li>
<li>Raore, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cervical+multilevel+intraspinal+stem+cell+therapy%3A+assessment+of+surgical+risks+in+Gottingen+minipigs%5BTitle%5D)+AND+%22Spine%22%5BJournal%5D)">Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs.</a> Spine. 36, 164-171 (2011).</li>
<li>Boulis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+stem+cell+therapy+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Translational stem cell therapy for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Nat. Rev. Neurol. , (2011).</li>
<li>Riley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+Stem+Cell+Transplantation+in+ALS%3A+A+Phase+I+Safety+Trial%2C+Technical+Note+%26+Interim+Safety+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Intraspinal Stem Cell Transplantation in ALS: A Phase I Safety Trial, Technical Note & Interim Safety Outcomes.</a> Neurosurgery. 71 (2), 405-416 (2012).</li>
<li>Boulis, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lumbar+intraspinal+injection+of+neural+stem+cells+in+patients+with+ALS%3A+results+of+a+Phase+I+trial+in+12+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lumbar intraspinal injection of neural stem cells in patients with ALS: results of a Phase I trial in 12 patients.</a> Stem Cells. 30 (6), 1144-1151 (2012).</li>
</ol>

博士Boulisはヒトの脊髄の安全かつ正確な注入を可能にするための装置の発明者です。 Neuralstem社は、この技術への排他的なライセンスを購入した。博士Boulisは、この手数料の棚卸のシェアを受けており、この技術の配布のためのロイヤルティの支払いに対する権利を持っています。他の著者は、開示することは何もありません。

人間7-9の記載された技術を進めるための承認にもかかわらず、重要な問題は、成功するために脊髄療法の順に回答されずに残っている。実質内注入に脊髄寛容の厳格な理解は、退行性脱髄、および外傷性脊髄疾患の治療法を開発する臨床試験の計画と実行を有効にする必要があります。現在、大型哺乳類の脊髄は一過性​​および永久的な罹患せずに耐えることができる注射の数の明確な理解がありません。同様に、注射の間隔は、罹患率に影響を及ぼす可能性があります。また、巨視的な（ 例えば 、換気関連または不注意による患者の動き）と微視的な（ すなわち 、換気および心臓のパルスの両方を持つ発振）脊髄運動は注入時に脊髄にリスクをもたらす。大型動物モデルにおける罹患率のためのしきい値を理解することが助けとなるすべての脊髄治療プログラムのための計算を投与。当社の翻訳脊髄移植の研究室では現在、脊髄アプリケーションの試験を設計するすべてのチームの前臨床開発プログラムを支援するために利用可能です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 機器の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>脊髄デリック</td><td> Neuralstem株式会社</td><td></td><td> Neuralstem社は、この技術への排他的なライセンスを購入した</td></tr><tr><td> MINJ-PDマイクロインジェクターポンプ</td><td> Tritechリサーチ社</td><td></td><td>この特定のアプリケーション用にカスタマイズ</td></tr><tr><td>フローティングカニューレ</td><td> Neuralstem株式会社</td><td></td><td>この特定のアプリケーションのためのカスタム設計</td></tr></tbody></table>

セラピーの脊髄配達のための外科テクニック：ゲッティンゲンミニブタの手順のデモンストレーション

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

これは脊髄に（遺伝子細胞）療法の送達のための手術手技とデバイスの組み合わせのコンパクトな視覚的な説明です。技術が動物で実証されているが、手順がFDA承認されており、現在はALS患者の脊髄に幹細胞移植に使用されている。 FDAは非常に特徴げっ歯類モデルにおける治療効果に関する実証の原則データを認識しているが、大型動物の使用は、外科手術の組み合わせで、デバイス、およびヒトでの使用のための最終的な治療の安全性を検証するために重要とみなされ。大きさ、解剖学、そして豚の背骨と脊髄の一般的な脆弱性は、より良いモデル人間に認識されます。また、露光および操作脊髄ならびに豚に創傷を閉鎖の手術プロセスは、人間とほとんど見分けがつかない。私たちは健康なブタモデルはcritiを表していることを信じている手続き的安全性の研究では、CALの第一歩。

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tarlovスコア</td></tr><tr><td> 0 </td><td>麻痺、動かない</td></tr><tr><td> 1 </td><td>後肢における知覚緊張、わずかな動き</td></tr><tr><td> 2 </td><td>後肢の動きが、座ったり、立ってすることができません</td></tr><tr><td> 3 </td><td>立って、歩く能力が、運動失調と短期間</td></tr><tr><td> 4 </td><td>完全な回復は、通常の運動機能</td></tr></tbody></table> 表1。Tarlovスコア。神経の罹患率と回復は、動物の運動機能を獲得することにより評価される。 <p class="jove_content" fo:keep-together.within-pa...

脊髄に（遺伝子細胞）治療​​の送達のために使用手術手技とデバイスの短い視覚的な説明。技術が動物で実証が、完全に翻訳可能であり、現在、人間のアプリケーションに使用されています。

これは、脊髄への（遺伝子および細胞）療法の導入のための、外科的手法とデバイスを組み合わせた簡潔な視覚的解説です。

本手順の全体的な目的は、脊髄内の目的とする特定の実質内部位へ、生物学的治療薬を安全に投与し、正確に標的化することです。まず動物の手術準備を行い、次に椎弓切除術を施行して脊髄デリックを組み立てることでこれを達成します。次に硬膜を切開し、脊髄内注射を行います。最後に、硬膜、筋肉、筋膜、および皮膚を縫合します。最終的に、行動データと標的データを収集することで、安全性と標的への到達結果を確認することができます。本論文で提示する手法は、脊髄への生物学的ペイロード投与のための安定化プラットフォームおよびフレキシブルカニューレの使用に関するものです。このアプローチの利点は、脊髄の可動性のために適用が困難な標準的な定位手技に代わり、投与の精度を高められる点にあります。精度に加えて、本手法は患者の動きに対しても安全マージンを確保することができます。本症例では、固定プラットフォームを使用しているため、ブタの脊髄に損傷が生じることはありません。また、カニューレに柔軟性があるため、呼吸や心拍に伴う管内での脊髄の動きによって脊髄がさらに損傷することもありません。ミニブタを12時間絶食させた後、ケタミン、アセプロマジン、アトロピンを筋肉内に注射して鎮静し、動物を挿管して酸素および1〜3%のisof fluorineで維持します。麻酔深度は、書面によるプロトコルに従ってモニターしてください。動物の頭部と背中の被毛を刈り取ります。鎮静した動物を手術室に運び、Jackson脊髄手術台での配置を再現するため、専用のフレーム上の腹臥位に固定します。このフレームには、動物の胸部と骨盤の下に配置する調節可能なスリングが備わっており、腹部を自由に垂れ下げさせることができます。これにより、腹部と胸部への圧迫を最小限に抑え、結果として硬膜外静脈からの出血を軽減させます。また、このフレームにより脊椎を外部から固定します。処置にあたり、動物を加熱再循環パッドの上に置き、体温を維持させます。次に、手術中の輸液および薬剤投与のため、耳縁静脈にカテーテルを挿入します。次に、アルコールとクロルヘキシジンまたはベタジン溶液で術野を消毒し、術野に滅菌ドレープを掛けます。皮膚を10から15 cm切開し、単極電極焼灼器を用いて脊柱起立筋を両側性に剥離します。次に、 رونジュール（Rongeurs）とサージカルドリルを用いて背側多椎間椎弓切除術を開始し、棘突起を除去して、C3からC5またはL2からL4セグメントに相当する椎骨の椎弓切除を行います。スピナル・デリックは、脊髄に遺伝子治療および細胞治療を導入するために設計された装置です。デバイスを患者に固定するため、主切開部の上下に1cmの皮膚切開を施します。経皮的なポストを切開部から挿入し、椎弓に固定して、脊髄の必要領域を露出し、椎弓切除術を完了させます。一体型のリトラクターブレードを挿入し、デリックに取り付けます。棘突起を上方へ牽引しながら、組織を後退させます。棘間靭帯と黄色靭帯を切除し、椎弓切除術を完了します。カニューレは、30ゲージの針と30ゲージのプラスチックチューブ、および2つの金属シース（外側の可動式シースと内側の固定式シース）で構成されています。マイクロインジェクターポンプに接続したハミルトンルアーロックを使用し、注射針のフランジおよびシースの近位端に配置される24ゲージの外筒を遠位端に適合させ、近位端から脊髄を露出させます。まず、メチルプレジニゾロンをボーラス投与します。次に、硬膜を脊髄から剥離させるため、注意深くアタックを配置します。Woodson歯科用器具と11番メスを用いて、硬膜に2.5 centimeterの切開を加えます。次に、4-0ヌロン縫合糸を使用して硬膜を剥離層から反転させ、深層の脊柱傍筋に固定します。脊髄の周囲にサージカルパティを配置します。次に、プラットフォームレールシステムの上部から取り付け、ゴンドラを2本のバーに載せ、Zドライブをユニバーサルジョイントに装着します。続いて、装着済みのカニューレをマイクロドライブにセットし、マイクロインジェクションプラットフォームのユニバーサルジョイントを使用して冠状面および矢状面の角度を調整します。これにより、カニューレの挿入経路が脊髄注入部位の表面に対して垂直になるようにします。その後、針を後根進入帯（dres）の内側に配置し、硬い金属製アウタースリーブを引き上げ、フレキシブルチューブを露出させます。あらかじめ校正済みのマイクロインジェクターポンプを使用して、標的部位に注入します。その後、注入管に沿った細胞の逆流を防ぐため、さらに1分間針を留置します。針を抜いた後、脊髄背側の可視血管を避けるため、吻側尾側軸に沿って2〜4 mm離れた次の標的部位に、定位固定装置を移動させます。脊髄固定具を慎重に取り外した後、4-0ニューロン糸を用いて硬膜を水密的に閉鎖します。深層筋および筋膜層をバイクリル縫合糸で閉鎖した後、3-0ナイロン縫合糸を用いて皮膚を閉鎖します。麻酔からの回復後、挿管チューブを抜き、2時間動物を観察します。術後の疼痛管理のため、経皮吸収型フェンタニルパッチを動物の背中に3日間貼付します。さらに、必要に応じて術後最大3日間までブプレノルフィンを投与します。その後、動物を個別のケージに移し、少なくとも1日1回観察を行います。神経学的罹患度を評価するため、餌の摂取量、排便および微細栄養行動のデータを収集します。既述の通り、本処置の安全性は、動物が術前のベースライン状態に回復できるかによって判断されます。一過性の神経学的欠損は、品種や処置による多少の変動はあるものの、多くの場合、術後1日から7日の間に消失します。永続的な罹患（モビリティ）は、本処置後、動物がIACUCの規定エンドポイントに達するまで回復しない持続的な神経学的欠損として定義されます。免疫化学などのその他の手法を用いて、細胞の生存能、細胞の遊走、および注入の正確性などの重要なデータを確認することができます。

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出典: Unger, M. D., et al., Lambar Dorsal Root Ganglion Access and Injection for Lumbar Dernlion Access and Injection in S豚.J. Vis.

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