肝動脈再建を用いた部分同所性肝移植のラットモデルのための外科的処置

本手順の目的は、移植研究のための再現可能な実験モデルとして、ラットにおける部分同所性肝移植を行うことです。これは、まずドナーラットから肝臓を摘出することで達成されます。第2のステップは、50%の肝切除を含む、肝移植片のex vivo（生体外）調製です。

次に、レシピエントラットの本来の肝臓を摘出します。最後のステップは、部分肝移植片をレシピエントラットに移植することです。最終的に、移植後の肝移植片における肝細胞障害を評価するため、血清アラニンアミノトランスフェラーゼ値を測定します。

一般的に、この手技に不慣れな方は、高度なマイクロサージャリー技術を要する工程が多く、困難に直面します。本手技を開始するには、麻酔をかけたドナーラットをウォーミングパッドの上に置き、足趾へのピンチテストで完全に麻酔がかかっていることを確認した後、磁気固定リトラクションシステムを用いて前肢を固定します。ラットの腹部全体の被毛を剃毛し、該当する皮膚をポビドンヨード溶液で滅菌します。

正中切開を行い、両側に延長して腹部を開きます。ラットの背側に5 mLシリンジを配置し、蚊鉗子を用いて上肝腔静脈を腹側に挙上させます。この状態で組織を頭側へ牽引し、肋骨下開創器を装着して術野を確保します。術中に開創器や5 mLシリンジを頻繁に操作する必要があるため、切開部位の周囲に手術用ドレープは使用しません。手術顕微鏡（16倍）下で、鎌状靭帯と左三角靭帯を剥離し、左横隔静脈を切断します。その後、湿らせたガーゼを用いて、肝臓の中葉および左外葉を上方に牽引します。

バイポーラ鉗子を用いて、左側葉と前座標葉の間の食道傍血管を凝固し、切断します。腸管を腹腔外のラットの左側に移動させ、湿らせたガーゼで覆います。湿らせたガーゼを用いて、右側葉を上方に牽引します。

下大静脈（肝下部）を後腹膜組織から剥離し、右副腎静脈を結紮します。この静脈は、後に胆管へステントを挿入するためのグラフト除去直前に切断します。まず、胃十二指腸動脈の分岐レベルで胆管を結紮します。結紮点より近位の胆管前壁に小さな切開を加えます。次に、左手の直線マイクロ鉗子で切開部の前壁を保持しながら、右手の弯曲マイクロ鉗子を用いて胆管内にステントを挿入します。6-0シルク糸を用いてステントを固定します。

後の吻合時に保持できるよう、胆管に結紮した糸の切断端の一方を4 mmの長さに残します。門脈を門脈枝および脾静脈から遊離させるため、これらを結紮して切断し、胃十二指腸動脈を結紮して切断します。その後、膵頭部から根部にかけて総肝動脈を単離します。

綿棒を用いて肝臓を右側に回転させ、準備が完了した時点で、肝臓の背面および食道周囲の靭帯を解剖します。肝切除のため、リトラクター、剣状突起を固定している蚊型鉗子、およびラットの背面に置いた5 mLシリンジを取り除きます。

腸管を腹腔内に戻します。生理食塩水 2 mL に溶解したヘパリンナトリウム 500 IU を陰茎静脈から注入します。約 3 分後、5 mL シリンジ、蚊肢鉗子、および開創器を準備し、総肝動脈の根部近位側を結紮します。

切断した糸の片端を、総肝動脈用に結紮したままにしておきます。下大静脈をクランプした後、時間を置いてから、蚊C型鉗子（モスキート鉗子）を用いて右腎静脈の近傍を遮断します。

脾静脈の断端の下方で、門脈を使い捨ての微小血管クランプで遮断します。門脈の前壁を切開し、18ゲージのカテーテルを門脈内に挿入します。60 mLの冷却ヒスチジン・トリプトファン・ケトグルタル酸溶液を用いて、肝臓をin situで灌流します。

20 cmの静水圧において、横隔膜、胸腔内大静脈、および肝下大静脈の前壁を直ちに切開し、灌流液が肝臓から洗い流されるようにします。肝臓の直下で微小血管クランプを用いて肝下大静脈を遮断します。肝下大静脈を剥離して肝臓を摘出します。

門脈、横隔膜、残りの靭帯、右副腎静脈、および総肝動脈を切り離します。摘出した肝臓を、砕氷を満たしたプラスチック製ボックス内に設置した、冷HTK液入りのメタルカップに入れます。肝移植片の処置は、氷冷HTK液を満たしたメタルカップ内で行います。門脈へのカフ装着のため、門脈幹をDeBakeyブルドッグクランプで遮断し、カップの上でクランプをブリッジ位置に固定します。

門脈をカフに通し、カフの延長部分と共に門脈を12時方向で再度クランプします。門脈壁をカフの上に折り返し、脾静脈の断端が7時方向でカフの外側に位置するように調整し、肝動脈にステントを挿入するために門脈を6-0シルク糸で固定します。横隔膜の両端を鉗子でクランプして肝臓を固定し、結紮糸をDeBakeyブルドッグクランプで保持しながら、直線的なマイクロ鋏を用いて総肝動脈を直線状に引っ張ります。左手で総肝動脈の前壁に小さな切開を加えます。

直線マイクロフォーセップスで切開部位の前壁を保持し、右手で総肝動脈にステントを挿入する。弯曲マイクロフォーセップスを用いて、6-0シルク糸でステントを固定し、切断した糸の一方の端を4 mmの長さにしておく。50%肝切除のため、動脈カテーテルを通じて5 mLの冷却HTK溶液で肝臓をフラッシュする。

まず、蚊鉗子で後座標葉をクランプして固定します。次に、4-0シルク糸でその茎を結紮し、葉を切除します。

前方の冠状葉を同様に切除します。次に、プラスチック製のボックスを90度回転させます。横隔膜の右端と中葉の左側部分をクランプします。

内側葉の両側部分の境界の上端に小さな切開を加え、結紮後に左側部分を除去します。4-0シルク糸で血管柄を結紮した後、左外側葉を除去し、切除した肝表面をバイポーラピンセットで慎重に焼灼します。これにより、肝上大静脈の形成術に向けて、肝重量を約50%減少させます。

まず、蚊鉗子で横隔膜の両端をクランプし、肝臓の位置を固定します。次に、対応する横隔膜を除去して、肝上大静脈の前壁をトリミングします。後の吻合のための保持縫合として、2 7 0 ポリプロピレン縫合糸を用いて、両角の外側から内側へ縫い付けます。

その後、上大静脈の後壁をトリミングします。肝移植片はHTK液に入れ、冷水バスを用いて4 °Cで保存します。レシピエントをドナーの手術と同様の方法で手術準備し、正中切開により腹腔を開きます。

濡らしたガーゼ綿棒を十二指腸の右側と腸管全体に配置します。肝下大静脈周囲に手術視野を確保するため、左外葉と中葉を左横隔膜下腔に寄せ、右外葉を濡らしたガーゼ綿棒で上方に牽引します。

後腹膜組織の結紮部位から肝下大静脈を遊離し、湿ったガーゼと綿球を用いて右副腎静脈を遮断します。肝臓を左側に回転させ、肝臓後方の靭帯を切開します。胆管を、尾状葉からの分枝の直下で切断します。

切断した糸の一端を、4 mmの長さで胆管を結紮するために残しておきます。胃十二指腸動脈と固有肝動脈を、総肝動脈の分枝点から3 mmの距離で結紮および切断し、総肝動脈の末端に動脈の広い構造を作ります。右腎静脈の直上の肝下大静脈と、肝門の分枝レベルにある門脈を、金属製マイクロ血管クランプとモスキート鉗子でそれぞれクランプします。肝上大静脈を横隔膜とともに末梢血管クランプでクランプし、そのクランプを油粘土の塊で固定します。イソフルランによる麻酔を0.4 volume percentまで軽減します。肝上大静脈と肝臓の境界で肝上大静脈を剥離し、レシピエントの自己肝を切除します。

蚊口鉗子の顎の直上の門脈と、肝臓と右腎静脈の中間点よりわずかに下方の肝下大静脈を同定します。肝移植片を正位に配置します。血管の再建は、この手技において最も困難かつ重要な工程です。

上腔静脈の連続縫合による吻合は、非常に慎重かつ迅速に行う必要があります。グラフトの右角において、付属の7/0ポリプロピレン糸を用いて、レシピエントの上腔静脈の内側から外側へ留置縫合を行い、同様に結紮します。次に、左角に2つ目の留置縫合を行います。

これが連続縫合の開始点となります。吻合部を広げるため、DeBakeyブルドッグクランプを用いて両角の縫合糸を把持し、外側上方に緩やかに牽引しながら保持します。次に、左角の縫合糸を、結節の外側近くでグラフト側の壁の外から内へと貫通させ、後壁の静脈洞内腔を7～8針で右角まで縫合します。

内腔同士が右角で向かい合うように、最初の数針を慎重に縫ってください。7-0ポリプロピレン糸を、グラフト側の血管の内側から外側に向かって刺します。外側から右から左へ、約10針で前列を縫合します。

内部を乳酸リンゲル液で洗浄します。気泡を取り除くため、最後の縫合をステイ縫合の近くに行い、門脈の再建に向けてそれらを一緒に結紮します。微小血管クランプで門脈を遮断し、蚊型鉗子を粘土に固定します。次に、蚊型鉗子の顎のすぐ下の門脈前壁を切開します。

受容側の門脈内部とカフを乳酸リンゲル液で洗浄します。カフを門脈に挿入し、6-0のシルク糸で周囲を固定します。最後に、肝臓を再灌流させます。

ラットの背面から5 mLシリンジを取り外し、ステント法による肝管再建のため、イソフルランの濃度を0.8 volume percentに上げます。まず、固有肝動脈の糸を蚊鉗子で保持し、粘土に固定します。次に、レシピエントの総肝動脈をクランプします。

共通肝動脈末端のY字構造の分岐部に小さな切開を加え、漏斗状の開口部を作成します。移植片の共通肝動脈内に留置したステントを、湾曲マイクロ鉗子で保持します。ステントをレシピエントの共通肝動脈内にスライドさせて挿入し、6-0シルク糸で固定します。この糸の一端と、移植片共通肝動脈上の4 mmの糸を一緒に結び合わせ、吻合部位の緊張を軽減しながら、両者の共通肝動脈を互いに近づけます。

その後、肝下大静脈の吻合のため、クランプを解除します。吻合は肝上大静脈と同様の手法で連続縫合により行いますが、より細い針目で縫合回数を増やして行います。クランプ解除後、胆管再建のため麻酔濃度を1.0 volume percentに上げます。レシピエント胆管の糸を蚊針鉗子で保持し、粘土で固定します。

再建後の胆管が長くなりすぎないよう、適切な位置で胆管に小さな切開を加えます。ステントを挿入し、6-0シルク糸で固定します。この糸とグラフト胆管の糸を結束します。

これで、すべての再建処置が完了しました。腹部の切開創を4-0 Vicryl縫合糸を用いて、層別に連続縫合で閉じます。手術直後、レシピエントラットに、生理食塩水合計1.5 millilitersに溶解した sphero sodium および buprenorphine を皮下注射します。

ラットを通常のケージに戻す前に、温風と酸素供給を備えた専用の集中治療ユニットケージで60分間回復させます。移植後の門脈再灌流から1、3、24、および168時間後の血液採取のための計画的な安楽死まで、すべてのレシピエントラットが生存しました。血清サンプルを用いてアラニンアミノトランスフェラーゼレベルを分析し、移植後の肝移植片における肝細胞損傷の程度を評価しました。

このグラフに示されているように、LTレベルは24時間でピークに達し、その後168時間までに正常範囲内まで低下しました。このビデオを視聴することで、移植研究のための再現性のある実験モデルとして、ラットにおける部分的な局所肝移植を行う方法を十分に理解できるはずです。