の解離、文化、および分析

本手順の全体的な目的は、ゼノプスの網膜細胞の一次細胞培養を調製することです。まず、周囲の組織を除去して網膜を露出させ、次に網膜組織を切り出すことでこれを達成します。

次に、網膜組織を単一細胞に解離させます。最終ステップとして、網膜細胞をUnClonedディッシュに播種し、カルシウムイメージング用にfluo-4 AMを添加します。最終的に、共焦点顕微鏡を用いて網膜細胞培養におけるカルシウム活性を検出します。

本手法は、網膜の発達におけるカルシウムおよび電気活動の役割や、単一細胞レベルでの遺伝子発現など、発生生物学、神経生物学、および細胞生物学の分野における重要な疑問への回答に寄与します。一般的に、本手順に不慣れな者は、迅速かつ正確な解剖に微細な運動操作が必要となるため、習得に苦労します。解剖の手順は複雑な手と目の協調運動が不可欠であり困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。

フード内でこの手順を開始するために、10 mLの細胞培養培地を入れた60 mmのプラスチック製ペトリ皿を1枚用意し、ラベルを貼ります。これを解剖プレートとして使用します。オプションとして、ステージ25以下の胚の解剖時に組織層の分離を促進するため、最終濃度が1.0 mg/mLとなるように、解剖プレートに10 mgのcollagenase Bを添加しても構いません。

また、培養プレートとして使用する、2 mLの細胞培養培地を入れた35 mmの表面処理済みディッシュを1枚準備します。さらに、外植体解離チューブとして使用する空の1.5 mLマイクロ遠心チューブ1本と、15 mLの液を入れた15 mLコニカルファルコンチューブ1本を準備します。

細胞培養液。次に、解剖用のCMFを2 mLずつ含む35 mmプラスチック製ペトリ皿を2枚準備し、1枚を外植体解離プレートとして、もう1枚をフード外での外植体洗浄プレートとして使用します。10 mLを含む60 mmプラスチック製ペトリ皿を2枚準備します。

0.1 XMMRを2枚用意し、1枚を保持プレートとして、もう1枚をシブリングプレートとして使用します。さらに、10 mLの0.1 XMMRと0.5 mg/mLのMS 2 22を含む60 mmプラスチックペトリ皿を1枚用意します。その後、解離プレートに40 µLの5%トリプシン（CMF含有）を加えます。

渦巻状に混ぜて混合し、そのままにしておきます。次に、2組の微小ピンセットを用い、解剖顕微鏡下で解剖を行います。胚の腹側において、後端から始まり、胚の前方にあるセメント腺を通る正中矢状切開を行います。

切り口の両側を広げるようにして、胚を慎重に開きます。これにより、胚の背面が解剖プレート側を向くようになります。次に、腹側の外胚葉を開き、内胚葉と中胚葉を露出させます。

次に、この組織の最初にして最大の層である内胚葉と中胚葉を除去します。内胚葉は非常にふわふわした外見で、大きな細胞からなり、明確な構造はほとんど見られません。この層を除去すると、体節とNotochordが sichtbar になります。

コントラストを向上させるため、胚を10 mLの細胞培養培地と100 µLの1% Nile blue sulfate溶液を含む別の60 mmプラスチック製ペトリ皿に移し、2〜3分間インキュベートします。その後、解剖プレートに戻します。これにより、外胚葉、体節、およびNotochordが染色され、同定と方向の確認が容易になります。

胚の前端部分に注目し、脳と視胞を露出させるために、神経板と残りの中胚葉を慎重に取り除きます。脳と視胞が完全に露出したら、ピンセットを使用して、脳の直後にある神経管とその下の外胚葉を切断します。この部分を反転させ、外胚葉が上になるようにします。

下層の視嚢を傷つけないよう注意しながら、外胚葉を慎重に取り除きます。最後に、ステージ25以降の胚を解剖する場合、ピンセットを用いて視嚢を脳から分離します。まず、麻酔プレート上でピンセットを用いて胚の腹側部分を取り除きます。

コントラストを高めるため、胚を10 mLの0.1 XMMRと100 µLの1% Nile blue sulfateを含む60 mmプラスチック製ペトリ皿に移し、2〜3分間置いて外胚葉を染色します。その後、解剖プレートに移します。次に、胚を固定しながら、外胚葉の直下にある網膜または視胞を慎重に除去します。

視覚胞または網膜を摘出した後、エアロゾル防止チップを装着したP 100マイクロピペットを用いて、X外植えリンスプレートに慎重に移します。気液界面に触れないように注意してください。その後、外植え組織を30秒間静置します。

次に、外植片解離プレートから0.1% trypsin in CMF 80 µLを、外植片解離チューブに移します。その後、外植片洗浄プレートから網膜または視杯を外植片解離チューブに移します。この際、外植片洗浄液が混入しないように注意してください。

その後、組織を外植体解離チューブに入れ、室温で1時間置いて解離させます。実験を通して細胞の画像を複数回撮影する場合は、少量の瞬間接着剤を用いて、培養プレートの底面にグリッドを貼り付けます。これにより、細胞を播種する手順の異なる時点で、同一の方向にある同一の細胞の画像を撮影することが可能になります。

まず、外植体解離チューブから溶液を40 µLゆっくりと吸い取り、廃棄します。次に、エアロゾル防止チップを装着したP 100を用いて、細胞を培養プレートにゆっくりと移します。プレートに細胞を分注する際は、ゆっくりとピペッティングし、プレート中央の狭い範囲に細胞を留めるようにしてください。

この図は、1時間のイメージングにおける単一細胞のカルシウム活性の例を示しています。これらの図は、異なる発生段階で分析した胚性網膜細胞におけるカルシウムイメージング実験の代表的な結果を提供しています。簡潔に述べると、結果はカルシウムが発生的に調節されており、特定のプローブ陽性細胞とカルシウム活性を相関させた場合、ステージ35でスパイク状のピークを示すことを明らかにしています。

魚類を用いた実験において、統計的な有意差は認められなかったものの、GABA作動性マーカー陽性細胞は、グルタミン酸作動性マーカー陽性細胞や、GABA作動性表現型の促進に関与する転写因子をコードするPT F1 A.A遺伝子陽性細胞よりも、カルシウムスパイク活性が高くなる傾向が見られました。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、1プレートあたり約3時間30分で完了できます。本手順の後、どの細胞が特定の表現型マーカーを発現しているかを確認するための細胞培養やC twoハイブリダイゼーション、あるいは電気生理学的記録などの他の手法を用いて、さらなる解析を行うことが可能です。このビデオを視聴することで、網膜組織の摘出、網膜組織の分散、および網膜細胞の播種方法について十分な理解を深めることができます。