Name: の解離、文化、および分析アフリカツメガエル胚性網膜組織 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 学ぶXenopus laevis網膜細胞の一次培養法。組織解離、単細胞培養、共焦点顕微鏡によるカルシウムイメージングを用いて、網膜細胞の生理機能と発生生物学を研究する手法を解説します。

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我々は優雅にスクリプト用ドクタージョンヘイズに感謝;博士。エリック·ブラッドリーと共焦点顕微鏡の支援のためのクリストファー·デル·ネグロ、ドリュー·ヒューズ、プロジェクトを開発し、予備的なデータを提供する際に自分の仕事のためラウラOdorizzi、アレックスGarafalo、レベッカラウデン、とリズ·マクマレイ、統計分析に役立つ提案のための博士グレッグスミス。この作品は、MSSにNIHの助成金（NINDS IR15N5067566-01）とウィリアム·アンド·メアリー大学のハワードヒューズ医学研究所の科学教育助成金によって支えられている。

特別な利害関係は宣言されません。

すべての脊椎動物全体で保存されており、その十分に特徴付けられた細胞の種類によって、網膜は細胞型仕様と分化を支配する分子細胞過程を研究するための有用なモデルを提供します。初代培養細胞は、遺伝子発現、蛋白質のダイナミクス、およびカルシウム、単一細胞の解像度レベルでの電気的活動を含むプロセスの広い範囲を調査するための強力な方法を与える。ここでは、 アフリカツメガエルにおける解剖推定網膜組織からの初代細胞培養のための簡単な手法を提示し、推定網膜が発達し、その初代細胞培養のごく初期の段階から容易にアクセス可能であることを与えられたこのような研究のために特に適した生物がで発生する可能性があります単純な食塩水から成る定義されたメディア。 ほとんどの実験室の設定に容易に適応が、特に細心の注意を必要とするいくつかの手順があります。 Dissectiアドオンは新鮮尖っ鉗子を用いて実施されるべきである。若い段階（&lt;聖30）細胞培養培地と混合コラゲナーゼBと治療の恩恵を受ける。別のメディアから組織や細胞の移転を伴うすべての手順は、空気 - 溶液界面の近傍に入ってくるから組織や細胞を...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 解剖と培養するための </td></tr><tr><td> BDファルコンイージーグリップ組織培養皿、35ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 08-772A </td><td></td></tr><tr><td>使い捨てのポリスチレンペトリ皿、60×15ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> 35ミリメートルNunclon表面ペトリ皿（Airvent付き） </td><td>フィッシャー</td><td> 12-565-91 </td><td></td></tr><tr><td>デュモンファイン鉗子（Dumostar＃55） </td><td>フィッシャー</td><td> NC9341917 </td><td></td></tr><tr><td> Cellatticeマイクロ支配プラスチックカバースリップ、25ミリメートル</td><td>フィッシャー</td><td> 50-313-17 </td><td></td></tr><tr><td>エチル-m-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩（MS-222） </td><td> MPバイオメディカル、LLC </td><td> 103106 </td><td></td></tr><tr><td>硫酸ゲンタマイシン</td><td>エンツォ生命科学</td><td> 380から003-G025 </td><td></td></tr><tr><td>ギブコトリプシン（1:250）パウダー</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 27250-018 </td><td></td></tr><tr><td> クロストリジウム·ヒストリチカムからのコラゲナーゼB </td><td>ロッシュ</td><td> 11088831001 </td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td>ナイルブルー硫酸（オプション） </td><td>ファルツ＆バウアー</td><td> N05550 </td><td></td></tr><tr><td> 500mlの真空フィルター/ストレージボトルシステム、孔径0.22μm33.2センチメートル2 CN膜</td><td>コー​​ニング</td><td> 430758 </td><td></td></tr><tr><td></td><td> &lt;/ TD&gt; <td></td><td> カルシウムイメージングのための </td></tr><tr><td>のFluo-4は、DMSOで1mM溶液、永久細胞AM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> F-14217 </td><td></td></tr><tr><td>水中でのプルロニックF-127の10％溶液</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> P-6866 </td><td></td></tr><tr><td> LSM 510共焦点顕微鏡システム</td><td>ツァイス</td><td>モデル廃止</td><td></td></tr><tr><td>ブロッキング試薬</td><td>ロッシュ</td><td> 11096176001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 蛍光in situハイブリダイゼーション （FISH）を用 </td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン-POD、Fab断片</td><td>ロッシュ</td><td> 11207733910 </td><td></td></tr><tr><td>抗DNP-HRP抗体</td><td>パーキンエルマー</td><td> NEL747A </td><td></td></tr><tr><td> Cy3でNHSエステル</td><td> GEヘルスケア</td><td> PA13101 </td><td></td></tr><tr><td> NHS-フルオレセイン</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 46409 </td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド、脱イオン</td><td> Amresco </td><td> 0606-950ML </td><td></td></tr><tr><td>トルラRNA、IX型</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R3629 </td><td></td></tr><tr><td>ブタ腸粘膜からヘパリンナトリウム塩、 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> H3393-250KU </td><td></td></tr><tr><td> CHAPS </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C3023 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2に特異的な試薬や機器。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> ソリューション </td><td> リファレンス </td><td> 中身 </td></tr><tr><td>細胞培養培地</td><td>チャンとスピッツァー、2009 54 </td><td> 116 mMのNaCl 0.67のKCl 2mMのCaCl 2 1.31 mMのMgSO 4を 4.6 mMトリス 1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン HClで7.8にpHを調整する。 0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>カルシウム·マグネシウム培地（CMF） </td><td>グーら 、1994 42;。Guとスピッツァー、1995年55 </td><td> 116 mMのNaCl 0.67のKCl 4.6 mMトリス 0.4 mMのEDTA 1％（v：v）のペニシリン/ストレプトマイシン HClで7.8にpHを調整する。 0.22μmのCNのフィルターを通過することによって殺菌をフィルタリングします。 4℃で保存する</td></tr><tr><td>マレイン酸バッファ（MAB） </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td> 100mMのマレイン酸 150mMのNaCl（pH7.5）で。 </td></tr><tr><td> 10X Marcの修正リンガー（MMR） </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td> 100mMのNaCl のKCl 1mMのMgSO 4を 2mMのCaCl 2 5mMのHEPES pHはNaOHで7.4に調整 0.1X MMRは、50 mg / mlの硫酸ゲンタマイシン及びpHをNaOHで7.4に調整されているが含まれています。 </td></tr><tr><td> 10X MEMFAソリューション、 </td><td> Sive ら 、2000年53 </td><td>の0.1M MOPS緩衝液（pH7.4） 2mMのEGTA 1mMのMgSO 4を 3.7％ホルムアルデヒド 10X溶液は、ホルムアルデヒドことなく、4℃で保存することができますホルムアルデヒドは（標準37％ストックの1/10量）新鮮追加されます。 </td></tr><tr><td> in situハイブリダイゼーション緩衝液中に </td><td> SIV電子ら 、2000年53 </td><td> 50％ホルムアミド 5X SSC 1 mg / mlのトルラRNA 100 mg / mlのヘパリン 1Xデンハルト溶液 0.1％のTween20 0.1％CHAPS 10mMのEDTA。 </td></tr></tbody></table>ペニシリンとストレプトマイシンが我々の文化メディアで使用されている間ソリューションを提供しています。*ゲンタマイシン、抗生物質は、私たちのMMRのソリューションで使用されています。 </td></tr></tbody></table>

の解離、文化、および分析<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚性網膜組織

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

神経板の前方領域は脊椎動物の網膜を生じさせることによって、プロセスは、臨床と基礎研究の両方の主要な焦点であり続けている。網膜疾患の理解と治療のための明白な医学的関連に加えて、脊椎動物の網膜の開発は、神経細胞の種類の判定や分化1-16を理解する上で重要とエレガントなモデルシステムとして機能し続けています。神経網膜には、ステレオタイプのレイヤーに配置された6つの個別の細胞種（神経節、水平、アマクリン視細胞、双極細胞、ミュラーグリア細胞）が、大部分はすべての脊椎動物12,14-18間で保存されているパターンで構成されています。 無傷の胚で網膜を勉強しながら、明らかにこの複雑な器官が層状構造に前脳の突起から発達する方法、あちこち恩恵多くの質問があります理解するために必要とされるmは推定網膜細胞の初代培養細胞を用いた7,19-23アプローチを採用する。たとえば、さまざまな段階で除去され、解離組織から細胞を分析すると、1つは、異なる発達段階で個々のセルの仕様の状態を認識することができ、すなわち、隣接組織8,19-22との相互作用の非存在下における細胞の運命,24-33。初代培養細胞はまた、治験責任医師は、特定の試薬 ​​と文化を扱い、単一細胞レベル5,8,21,24,27-30,33-39に結果を分析することができます。 アフリカツメガエルの研究のための古典的なモデル系初期の神経発達19,27,29,31-32,40-42は 、網膜の初代細胞培養10,38,43-45に特に適したシステムとしての役割を果たします。 推定網膜組織はすぐに神経誘導25,38,43に続いて、開発の初期段階からのアクセスが可能です。また、与えられた目卵黄の供給が含まれている胚の各セルに、網膜細胞は、このようにインキュベーションや他の血清ベースの製品10,24,44-45の交絡影響を除去、緩衝塩溶液からなる非常にシンプルに定義された培地で培養することができる。 しかし、周囲の組織とその後の処理から網膜組織の分離は困難である。ここで、我々は、順番に、単一細胞の解像度でカルシウム活性と遺伝子発現について分析される初代培養細胞を調製するために使用されるアフリカツメガエルの網膜の細胞の解離と解離するための方法を提示する。本稿で紹介トピックが自発カルシウムトランジェントの分析ですが、技術が研究課題とアプローチ（ 図1）の広い配列に広く適用可能である。

首尾よく解剖オプティック胞（ステージ25）、網膜（ステージ35）の例は2Eおよび2J図に示されている。このプロトコルは、開発のさまざまな段階で使用することができますが、それはさらなる実験のために正確さを保証する唯一の網膜組織を得ることが重要です。慎重にすべての段階で表皮を取り除き、あなたの鉗子は網膜組織を穿刺しないことを確認してください。ステージ35歳以上では、レンズ、網膜の上に透明なレイヤーとして見ることができると鉗子を用いて慎重に削って除去することができる。 首尾よくメッキ初代培養細胞は 、 図3Aに示されている。組織を解離するときに、リンス液に解離するから組織を防ぐために推奨される30秒のインキュベーション時間よりも長くすすぎ液中に網膜外植片を残さないことが重要です。さらに、組織は完全な時間のためにトリプシン溶液中で解離することが許可されていることを確認培養プレート中の細胞の均一な分布を可能にするために（古い胚および幼虫期はさらに長く必要になるかもしれない。）細胞がメッキされ...

アフリカツメガエルは、細胞運命の仕様および初代培養細胞内の個々の網膜細胞の生理機能を研究するための理想的なモデルシステムを提供します。ここでは、網膜組織を解剖し、カルシウム活性のために画像化し、in situハイブリダイゼーションにより分析される初代培養細胞を生成するための手法を提示する。

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

本手順の全体的な目的は、ゼノプスの網膜細胞の一次細胞培養を調製することです。まず、周囲の組織を除去して網膜を露出させ、次に網膜組織を切り出すことでこれを達成します。次に、網膜組織を単一細胞に解離させます。最終ステップとして、網膜細胞をUnClonedディッシュに播種し、カルシウムイメージング用にfluo-4 AMを添加します。最終的に、共焦点顕微鏡を用いて網膜細胞培養におけるカルシウム活性を検出します。本手法は、網膜の発達におけるカルシウムおよび電気活動の役割や、単一細胞レベルでの遺伝子発現など、発生生物学、神経生物学、および細胞生物学の分野における重要な疑問への回答に寄与します。一般的に、本手順に不慣れな者は、迅速かつ正確な解剖に微細な運動操作が必要となるため、習得に苦労します。解剖の手順は複雑な手と目の協調運動が不可欠であり困難であるため、本手法を視覚的に提示することが極めて重要です。フード内でこの手順を開始するために、10 mLの細胞培養培地を入れた60 mmのプラスチック製ペトリ皿を1枚用意し、ラベルを貼ります。これを解剖プレートとして使用します。オプションとして、ステージ25以下の胚の解剖時に組織層の分離を促進するため、最終濃度が1.0 mg/mLとなるように、解剖プレートに10 mgのcollagenase Bを添加しても構いません。また、培養プレートとして使用する、2 mLの細胞培養培地を入れた35 mmの表面処理済みディッシュを1枚準備します。さらに、外植体解離チューブとして使用する空の1.5 mLマイクロ遠心チューブ1本と、15 mLの液を入れた15 mLコニカルファルコンチューブ1本を準備します。細胞培養液。次に、解剖用のCMFを2 mLずつ含む35 mmプラスチック製ペトリ皿を2枚準備し、1枚を外植体解離プレートとして、もう1枚をフード外での外植体洗浄プレートとして使用します。10 mLを含む60 mmプラスチック製ペトリ皿を2枚準備します。0.1 XMMRを2枚用意し、1枚を保持プレートとして、もう1枚をシブリングプレートとして使用します。さらに、10 mLの0.1 XMMRと0.5 mg/mLのMS 2 22を含む60 mmプラスチックペトリ皿を1枚用意します。その後、解離プレートに40 µLの5%トリプシン（CMF含有）を加えます。渦巻状に混ぜて混合し、そのままにしておきます。次に、2組の微小ピンセットを用い、解剖顕微鏡下で解剖を行います。胚の腹側において、後端から始まり、胚の前方にあるセメント腺を通る正中矢状切開を行います。切り口の両側を広げるようにして、胚を慎重に開きます。これにより、胚の背面が解剖プレート側を向くようになります。次に、腹側の外胚葉を開き、内胚葉と中胚葉を露出させます。次に、この組織の最初にして最大の層である内胚葉と中胚葉を除去します。内胚葉は非常にふわふわした外見で、大きな細胞からなり、明確な構造はほとんど見られません。この層を除去すると、体節とNotochordが sichtbar になります。コントラストを向上させるため、胚を10 mLの細胞培養培地と100 µLの1% Nile blue sulfate溶液を含む別の60 mmプラスチック製ペトリ皿に移し、2〜3分間インキュベートします。その後、解剖プレートに戻します。これにより、外胚葉、体節、およびNotochordが染色され、同定と方向の確認が容易になります。胚の前端部分に注目し、脳と視胞を露出させるために、神経板と残りの中胚葉を慎重に取り除きます。脳と視胞が完全に露出したら、ピンセットを使用して、脳の直後にある神経管とその下の外胚葉を切断します。この部分を反転させ、外胚葉が上になるようにします。下層の視嚢を傷つけないよう注意しながら、外胚葉を慎重に取り除きます。最後に、ステージ25以降の胚を解剖する場合、ピンセットを用いて視嚢を脳から分離します。まず、麻酔プレート上でピンセットを用いて胚の腹側部分を取り除きます。コントラストを高めるため、胚を10 mLの0.1 XMMRと100 µLの1% Nile blue sulfateを含む60 mmプラスチック製ペトリ皿に移し、2〜3分間置いて外胚葉を染色します。その後、解剖プレートに移します。次に、胚を固定しながら、外胚葉の直下にある網膜または視胞を慎重に除去します。視覚胞または網膜を摘出した後、エアロゾル防止チップを装着したP 100マイクロピペットを用いて、X外植えリンスプレートに慎重に移します。気液界面に触れないように注意してください。その後、外植え組織を30秒間静置します。次に、外植片解離プレートから0.1% trypsin in CMF 80 µLを、外植片解離チューブに移します。その後、外植片洗浄プレートから網膜または視杯を外植片解離チューブに移します。この際、外植片洗浄液が混入しないように注意してください。その後、組織を外植体解離チューブに入れ、室温で1時間置いて解離させます。実験を通して細胞の画像を複数回撮影する場合は、少量の瞬間接着剤を用いて、培養プレートの底面にグリッドを貼り付けます。これにより、細胞を播種する手順の異なる時点で、同一の方向にある同一の細胞の画像を撮影することが可能になります。まず、外植体解離チューブから溶液を40 µLゆっくりと吸い取り、廃棄します。次に、エアロゾル防止チップを装着したP 100を用いて、細胞を培養プレートにゆっくりと移します。プレートに細胞を分注する際は、ゆっくりとピペッティングし、プレート中央の狭い範囲に細胞を留めるようにしてください。この図は、1時間のイメージングにおける単一細胞のカルシウム活性の例を示しています。これらの図は、異なる発生段階で分析した胚性網膜細胞におけるカルシウムイメージング実験の代表的な結果を提供しています。簡潔に述べると、結果はカルシウムが発生的に調節されており、特定のプローブ陽性細胞とカルシウム活性を相関させた場合、ステージ35でスパイク状のピークを示すことを明らかにしています。魚類を用いた実験において、統計的な有意差は認められなかったものの、GABA作動性マーカー陽性細胞は、グルタミン酸作動性マーカー陽性細胞や、GABA作動性表現型の促進に関与する転写因子をコードするPT F1 A.A遺伝子陽性細胞よりも、カルシウムスパイク活性が高くなる傾向が見られました。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、1プレートあたり約3時間30分で完了できます。本手順の後、どの細胞が特定の表現型マーカーを発現しているかを確認するための細胞培養やC twoハイブリダイゼーション、あるいは電気生理学的記録などの他の手法を用いて、さらなる解析を行うことが可能です。このビデオを視聴することで、網膜組織の摘出、網膜組織の分散、および網膜細胞の播種方法について十分な理解を深めることができます。

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